杜升園，韋宇音，呂自力

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科，南寧 530021）

肝母細胞瘤（hepatoblastoma,HB）是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤，主要發(fā)生在出生后的前兩年[1]。目前，盡管HB在診斷和治療方面取得了顯著的進展，但HB 的年發(fā)病率仍呈上升趨勢[2]，伴有腫瘤轉(zhuǎn)移等高危因素的HB患者預(yù)后也很差[3]。因此，尋找新的腫瘤標志物，以改善這種惡性腫瘤的預(yù)后，確定HB 新型治療靶點以提高生存率是至關(guān)重要的。鋅指和同源框2（zinc-finger and homeoboxes 2，ZHX2）最初作為血清甲胎蛋白（alpha fetal protein,AFP）的負調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)[4-5]，隨后在肝細胞癌中首次被證實其抑癌基因作用，過表達的ZHX2 可以顯著降低肝癌細胞的增殖和遷移，并且經(jīng)臨床研究證實，ZHX2 的過表達可以顯著延長病人的生存期[6]。ZHX2 的異常表達還與慢性淋巴細胞白血病[7]、乳腺癌[8]、肺癌[9]、多發(fā)性骨髓瘤[10]、霍奇金淋巴瘤[11]的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)，提示ZHX2可能參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展并起關(guān)鍵性作用，值得深入研究。然而，ZHX2在HB中的整體表達情況及其在臨床上可能研究價值的相關(guān)信息鮮少報道。本研究收集公共數(shù)據(jù)庫中10 個HB mRNA 基因芯片數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)，計算標準化均數(shù)差（SMD）和繪制整合受試者工作曲線（SROC）曲線，檢測ZHX2的表達，并通過實時熒光定量PCR 技術(shù)（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和免疫組化實驗進行驗證。

1 材料與方法

1.1 HB中ZHX2表達數(shù)據(jù)的收集

在基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus,GEO）、ArrayExpress、Oncomine 等公共數(shù)據(jù)庫中使用以下搜索詞搜索：（HB OR hepatoblastoma）AND（mRNA），篩選HB 患者mRNA 表達數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集包括以下納入標準：（1）物種為人類；（2）標本必須是肝組織；（3）數(shù)據(jù)是mRNA 的表達；（4）分為實驗組和對照組；（5）兩組樣本均不少于2例；（6）所有組織均來自從未接受過放療或化療的患者。排除標準為：（1）包括其他不相關(guān)的干預(yù)措施；（2）對照組存在其他不相關(guān)研究疾病的影響。篩選后共納入10 個有效芯片數(shù)據(jù)集，分別為GSE51701、GSE81928、GSE89773、GSE104776、GSE131329、GSE132037、GSE133039、GSE151347、GSE75271 和EMEXP185，共276 例HB，124 例非腫瘤。所有ZHX2表達數(shù)據(jù)均經(jīng)log2轉(zhuǎn)化。

1.2 細胞培養(yǎng)

正常肝細胞株LO2（上海中科院細胞庫）和HB細胞株HuH-6（武漢普諾賽生命科技有限公司）的培養(yǎng)環(huán)境為含15%FBS及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2，每2～3 d換液1次。

1.3 RT-qPCR檢測

1.3.1 細胞總RNA提取、純度測定及逆轉(zhuǎn)錄 采用以異硫氰酸胍（酚）為基礎(chǔ)的總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。使用紫外分光光度計測定總RNA 提取溶液的濃度與純度，記錄RNA溶液濃度及A260/A280值。A260/A280 在1.8～2.0 表示RNA 純度較純，實驗可信。逆轉(zhuǎn)錄操作方法按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司）說明書進行，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 保存于-20 ℃。

1.3.2 RT-qPCR 檢測ZHX2在腫瘤細胞的表達引物設(shè)計如下：ZHX2 引物序列為F：5’-TGGCGTAGATTCCCCACTGA-3’，R：5’-CAGACAGAA AAAGCCCCCGT-3’；內(nèi)參基因GAPDH 引物序列為：F：5’-ACTCCTCCACCTTTGACGCT-3’，R：5’-GGTCTCTCTCTTCCTCTTGTGC-3’，引物用DEPC水稀釋引物為終濃度10 mmol/L。PCR反應(yīng)體系共20 μL：包括dH2O（滅菌蒸餾水）7 μL，2X SYBR GreenⅠMaster 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.6 μL，PCR Reverse Primer（10μ mol/L）0.6 μL，DNA 模板2 μL。PCR 反應(yīng)條件：激活酶活性預(yù)熱95 ℃，10min；95 ℃，15 s，60 ℃60 s 循環(huán)10次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理分析 數(shù)據(jù)處理分析獲取RT-qPCR 所得Ct 值，2-△△Ct法計算ZHX2 在HB 細胞內(nèi)的相對表達量，計算公式：△△Ct＝［（HB細胞ZHX2）Ct 值－（HB 細胞GAPDH）Ct 值］－［（正常肝細胞ZHX2）Ct值－（正常肝細胞中GAPDH）Ct值］。

1.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)

1.4.1 患者標本及相關(guān)病理學(xué)資料的收集 回顧性選擇2016 年4 月至2021 年4 月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理科確診的HB患者50例。納入標準：（1）原發(fā)性HB患者；（2）在手術(shù)過程中或超聲引導(dǎo)的經(jīng)皮穿刺中獲得的腫瘤組織樣本；（3）患者臨床資料及組織樣本完整。排除標準：（1）接受過放療、化療等輔助治療的患者；（2）合并其他惡性腫瘤。于本院檔案室查閱入選患者相關(guān)臨床病理學(xué)資料，具體包括：性別、年齡、腫瘤直徑大小、組織學(xué)分型、AFP、病理類型和PRETEXT 臨床分期等。取HB 樣本作為實驗組，瘤旁非瘤肝組織樣本作為對照組。

1.4.2 免疫組織化學(xué)實驗方法 采用EnVision 二步法，具體操作如下：制作厚度3 μm 的石蠟切片，65 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟10 min×3次，梯度酒精脫水3 min×3次，抗原修復(fù)2.5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，ZHX2 抗體（abcam 抗體官方網(wǎng)站）（1∶50 稀釋）4 ℃過夜孵育，反應(yīng)增強液室溫孵育20 min，增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育20 min，DAB 顯色試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）顯色2 min，蘇木精復(fù)染30 s，自來水沖洗反藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片固定。

1.4.3 染色結(jié)果評估 根據(jù)免疫組化結(jié)果的著色情況及陽性細胞數(shù)情況制定如下判讀標準：細胞為藍色、淺黃色、棕色、深棕色至黑色分別代表0 分、1分、2分、3分。視野下沒有陽性細胞、陽性細胞率＜25%、陽性細胞率在25%與50%之間且包括25%和50%、陽性細胞率＞50%分別代表0分、1分、2分、3分。每項評分結(jié)果獨立，兩項評分結(jié)果進行相乘，得出的結(jié)果即為綜合評分，根據(jù)綜合評分又可分為4 個等級，0 分、1～2 分、3～4 分、＞4 分記分別記為（-）、（+）、（++）、（+++）。綜合評分等級在++以上的定為高表達，以下的為低表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。應(yīng)用STATA12.0 合并數(shù)據(jù)庫中ZHX2 表達值，計算SMD并制作森林圖，分析異質(zhì)性和敏感性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于基因芯片的ZHX2 mRNA表達的驗證

驗證ZHX2 mRNA 在HB 和非瘤肝組織中的表達，由于每個芯片之間研究樣本量有差異，本研究整合了10個基因芯片ZHX2相關(guān)的表達值，并進行薈萃分析。結(jié)果顯示，10組數(shù)據(jù)集之間的異質(zhì)性較?。↖2=8.3%，P=0.366），因而可以忽略其異質(zhì)性，選擇固定效應(yīng)模型。ZHX2 mRNA 的合并SMD為SMD=1.49（95%CI：1.24～1.75）（圖1A），表明在HB中ZHX2 mRNA表達明顯上調(diào)。高表達的ZHX2的SROC為AUC=0.85（95%CI：0.81～0.88）（圖1B），表明ZHX2 在HB 和非腫瘤病變中差異表達且具有較強的區(qū)分能力。敏感性分析結(jié)果顯示合并量SMD穩(wěn)定（圖1C）。Begg 檢驗顯示ZHX2 mRNA 在HB的表達沒有潛在的發(fā)布偏倚（圖1D），ZHX2的合并靈敏度為55%、合并的特異性為82%、合并的陽性似然比（LR）為2.80、合并陰性LR為0.47，合并診斷優(yōu)勢比為8.70（圖2）。

圖1 ZHX2在10個基因芯片中的表達情況

圖2 集成所有數(shù)據(jù)集的診斷價值

2.2 RT-qPCR分析ZHX2在HB細胞株及正常肝細胞株中的表達

檢測HB細胞株HuH-6及正常肝細胞株LO2中ZHX2 的表達。內(nèi)參及ZHX2 在擴增過程中均無非特異性擴增和引物二聚體。ZHX2 在HB 細胞系HuH-6 中的表達高于正常肝細胞系LO2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 2）（圖3）。

圖3 ZHX2 在HB 細胞株HuH-6 和正常肝細胞株LO2 中的表達

2.3 免疫組化實驗分析ZHX2蛋白的表達 在HB組織中，ZHX2 蛋白的表達主要定位于細胞核，ZHX2蛋白在HB組織及瘤旁肝組織中的染色結(jié)果，見表1，圖4。在HB組織中，36例ZHX2蛋白高表達（72%），14 例低表達（28%）；在瘤旁肝組織中，22 例ZHX2 蛋白高表達（44%），28 例低表達（56%）。相對于瘤旁肝組織，ZHX2 蛋白在HB 組織中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。ZHX2蛋白的表達與HB患者性別、年齡、組織學(xué)類型和AFP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與腫瘤大小及PRETEXT臨床分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖4 免疫組化染色結(jié)果（EnVision二步法，×100；×200；×400）

表1 ZHX2 蛋白在HB瘤組織和瘤旁肝組織中表達情況n（%）

表2 ZHX2 在HB中的表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

3 討論

ZHX2 作為新型的轉(zhuǎn)錄抑制因子，其自身表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)已被多項研究證實，ZHX2 在多種腫瘤中均有表達，且參與多種腫瘤病理生理過程并與相關(guān)基因相互作用，影響疾病的進展及臨床預(yù)后。ZHX2 在肝細胞癌[12]、乳腺癌[9]、結(jié)直腸癌[13]中低表達，均已被證實其為抑癌基因，且與患者的生存率低下有關(guān)。Tian 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過表達ZHX2可以抑制肺癌細胞增殖和侵襲并促進細胞凋亡。然而，Zhang 等[14]研究卻發(fā)現(xiàn)，ZHX2 可以通過表觀遺傳修飾激活NF-κB信號通路,促進腫瘤的生長和遷移，首次提出了ZHX2 具有癌基因的功能。隨后，You 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ZHX2 也是胃癌的潛在癌基因。Xu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MEK/ERK 信號通路可誘導(dǎo)HB 細胞停滯和細胞凋亡，Chen 等[17]研究證實ZHX2可通過增加血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表達驅(qū)動細胞生長、遷移和轉(zhuǎn)錄激活MEK/ERK信號通路，并通過調(diào)節(jié)自我保護性自噬誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥。但目前仍未見HB 組織中ZHX2 的表達與MEK/ERK 信號通路是否存在相關(guān)性。由此可見，ZHX2 有望成為判斷HB 惡性程度和預(yù)后的新型分子生物學(xué)標志物。

本研究首次通過整合公共數(shù)據(jù)庫的基因芯片數(shù)據(jù)綜合分析ZHX2 的差異表達，同時結(jié)合RT-qPCR和免疫組化技術(shù)進一步驗證ZHX2在HB中的表達情況。我們通過對納入的400個芯片數(shù)據(jù)進行綜合分析，結(jié)果顯示，HB 組織中ZHX2 mRNA 的表達水平顯著高于非腫瘤組織，其高表達對HB 組織與非腫瘤組織具有較好的區(qū)分度。RT-qPCR 結(jié)果顯示ZHX2在HB細胞系HuH-6中mRNA的表達明顯高于正常肝細胞系LO2，與芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。免疫組化實驗結(jié)果顯示，ZHX2蛋白HB組織中高表達率高于非腫瘤組織。綜上表明，ZHX2 的高表達的對HB的鑒別中有一定的價值作用。

本研究通過分析ZHX2 蛋白表達與HB 患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ZHX2蛋白的高表達與HB患者性別、年齡、組織學(xué)類型和AFP 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是相較于ZHX2 低表達組患者，ZHX2 高表達組患者的腫瘤直徑更大，PRETEXT 臨床分期更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。手術(shù)切除腫瘤是HB 的重要治療手段，而腫瘤大小和PRETEXT 分期是評估手術(shù)能否完整切除的關(guān)鍵因素[18]。綜上表明，ZHX2可能會作為一項HB預(yù)后情況判斷的新指標。

綜上所述，ZHX2 在HB 中存在表達上調(diào)的情況，其可能參與HB的發(fā)生和發(fā)展，并影響腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程，有望為HB 的臨床診療及預(yù)后提供理論依據(jù)和參考價值。