李廣發(fā)，梁倩瑜，梁攸靈，莫格格，胡章，余佳音，黃德堅(jiān)

(廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，廣東 湛江 524088)

殼聚糖是由來(lái)源豐富的甲殼素脫乙?；玫降囊环N堿性聚電解質(zhì)多糖[1-3]。由于具有生物降解性、生物兼容性、安全無(wú)毒、廣譜抗菌等優(yōu)良特性，殼聚糖已廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域[4-6]。但由于殼聚糖僅溶于酸性水溶液，使得其在很多方面的應(yīng)用受限。由于殼聚糖鏈上含有較多活性基團(tuán)，通過(guò)對(duì)殼聚糖上的C6-OH和C2-NH2進(jìn)行化學(xué)改性，可形成不同結(jié)構(gòu)和不同性能的殼聚糖衍生物[7-8]。兩性殼聚糖鏈上具有親水性基團(tuán)和疏水性基團(tuán)的特殊結(jié)構(gòu)，在醫(yī)藥領(lǐng)域，可增強(qiáng)靶向性給藥，提高藥物的吸收率和生物利用度[9-11]。針對(duì)兩性殼聚糖進(jìn)行更深入的研究，其必將發(fā)揮更加重要的作用，成為一種重要的資源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

甲殼素(分子量50 kDa)，生物試劑；2-氯乙胺鹽酸鹽、檸檬醛、氫氧化鈉、尿素、乙酸、乙醇均為分析純。

HJ-A4四位磁力攪拌水浴鍋；FD-1B-50真空冷凍干燥機(jī)；GM-0.33A隔膜真空泵；EX125DZH型電子天平；3H20RI智能高速冷凍離心機(jī)；P4紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀；Rigaku Ultima IV組合式多功能X射線衍射儀。

1.2 季銨化甲殼素的制備

取甲殼素粉末1 g，分散在氫氧化鈉溶液中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48%，13 g)，室溫?cái)嚢?4 h；加入適量的冰水，劇烈攪拌直至為均勻溶液，此時(shí)溶液中甲殼素和NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.3%和8.0%。于80 ℃攪拌下，分批次緩慢加入2-氯乙胺鹽酸鹽5.65 g，磁力攪拌反應(yīng)12 h后，采用蒸餾水室溫透析3 d，-20 ℃ 預(yù)凍過(guò)夜，真空冷凍干燥，得到白色粉末固體，產(chǎn)率為83.56%。

1.3 季銨化殼聚糖的制備

取上述制備的季銨化甲殼素1 g，加入氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)48%，20 g)，于65 ℃磁力攪拌 10 h；蒸餾水室溫透析3 d，中間間歇性更換蒸餾水，直至透析液近似呈中性，-20 ℃預(yù)凍過(guò)夜，真空冷凍干燥，得到白色粉末固體，產(chǎn)率為63.75%。

1.4 兩性殼聚糖的制備

取季銨化殼聚糖1 g溶解在2%乙酸中(v/v，50 mL)，室溫?cái)嚢? h成透明溶液，利用恒壓滴液漏斗逐滴加入檸檬醛的乙醇溶液(1.86 mmol/L，10 mL)，室溫繼續(xù)攪拌24 h，加入氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)，離心收集沉淀，先后用無(wú)水乙醇和50%乙醇洗滌沉淀，-20 ℃預(yù)凍過(guò)夜，真空冷凍干燥，得到類白色粉末固體，產(chǎn)率為79.81%。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 UV 甲殼素樣品采用10%氫氧化鈉/4%尿素(W/V)的水相溶劑體系溶解；殼聚糖樣品溶于一定量的醋酸溶液(1%，V/V)，參比溶液采用各自相對(duì)應(yīng)的溶劑體系，掃描在波長(zhǎng)200～500 nm的吸光度。

1.5.2 FTIR 采用溴化鉀壓片法，取1～2 mg樣品在瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉末，再與100 mg干燥的溴化鉀粉末混合均勻，裝入模具內(nèi)，在壓片機(jī)上壓制成片。采用純溴化鉀片去除背景干擾，在 4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，測(cè)得樣品紅外光譜。

1.5.3 XRD 將樣品放在X射線衍射儀上掃描，電壓為40 kV，電流為40 mA，CuKα譜線，掃描范圍為5～50°，掃描速度為15 s/步。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩性殼聚糖的合成機(jī)理

在對(duì)殼聚糖C6-OH進(jìn)行化學(xué)改性時(shí)，經(jīng)典的方法是對(duì)殼聚糖C2-NH2進(jìn)行保護(hù)-脫保護(hù)。避開(kāi)傳統(tǒng)的C6-OH殼聚糖衍生物制備途徑，以甲殼素為起始原料，利用甲殼素C2-乙酰氨基的保護(hù)狀態(tài)，直接化學(xué)改性C6-OH，兩性殼聚糖的合成途徑見(jiàn)圖1。

圖1 兩性殼聚糖的合成途徑

氯乙胺鹽酸鹽的毒性較弱，故將其作為接枝多氨基的試劑是很好的選擇。首先，甲殼素的6-OH與ACH通過(guò)親核取代反應(yīng)，得到季銨化的甲殼素；接著，在氫氧化鈉的作用下，進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，得到季銨化殼聚糖；最后與一種羰基試劑(檸檬醛)進(jìn)行親核加成-消除反應(yīng)，得到兩性殼聚糖。

2.2 紫外光譜分析

圖2 樣品的紫外光譜圖

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜對(duì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)敏感，適用于測(cè)定不同狀態(tài)、濃度和環(huán)境下的高分子，是確定高分子聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的有效工具[12]。由圖3a可知，3 500～3 200 cm-1寬度峰是甲殼素O—H和N—H的伸縮振動(dòng)疊加峰；2 960～2 830 cm-1屬于飽和C—H的伸縮振動(dòng)峰；1 150～1 020 cm-1屬于醚鍵C—O的伸縮振動(dòng)峰。波數(shù)1 660，1 558，1 310 cm-1分別對(duì)應(yīng)甲殼素中酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜帶的特征吸收峰。波數(shù)在3 480，3 264，2 960～2 840 cm-1附近，甲殼素、季銨化甲殼素、季銨化殼聚糖三者的吸收峰強(qiáng)弱有所不同，但峰型基本相似，差異主要在于酰胺的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜帶。

圖3 樣品的紅外光譜圖

季銨化甲殼素與甲殼素的紅外譜圖相比，季銨化甲殼素在1 569 cm-1和1 461 cm-1處出現(xiàn)了兩個(gè)新的吸收帶，這與 —NH2基團(tuán)和 —CH2基團(tuán)的彎曲振動(dòng)有關(guān)，表明乙氨基團(tuán)成功接枝到甲殼素分子上。

季銨化殼聚糖與季銨化甲殼素的紅外譜圖相比，季銨化殼聚糖的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的吸收帶明顯減弱，酰胺Ⅱ的譜帶消失，并在1 594 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收譜帶，即 —NH2基團(tuán)的振動(dòng)譜帶。綜上表明，季銨化殼聚糖已成功合成。

2.4 X-射線衍射分析

研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析方法很多，但應(yīng)用最廣泛和最有效的手段是X射線衍射技術(shù)，特別是在高分子化學(xué)、材料化學(xué)等領(lǐng)域中，已成為一種重要的結(jié)構(gòu)分析手段[13]。

由圖4可知，甲殼素在9°和19°處各有一個(gè)明顯的特征衍射峰，經(jīng)甲殼素逐步合成反應(yīng)后，甲殼素的9°和19°特征衍射峰發(fā)生了明顯的變化，其中每步反應(yīng)產(chǎn)物的9°特征衍射峰均在減弱，到最后形成兩性殼聚糖時(shí)消失。而位于19°處的特征衍射峰從第二步產(chǎn)物季銨化殼聚糖開(kāi)始明顯變?nèi)酰蔀檩^寬的峰。甲殼素、季銨化甲殼素和季銨化殼聚糖三種物質(zhì)的衍射峰出峰情況較為類似。此外，甲殼素和第一步產(chǎn)物季銨化甲殼素在26°都出現(xiàn)小的峰形，經(jīng)第二步反應(yīng)后該峰形變得模糊，到第三步反應(yīng)產(chǎn)物后，該小峰就消失了。這表明殼聚糖鏈在一些方向具有一定的規(guī)整性，但是結(jié)晶度低，而經(jīng)過(guò)化學(xué)改性之后的殼聚糖，在形成氫鍵的能力方面大大下降，一部分結(jié)晶型轉(zhuǎn)變成了無(wú)定型。

圖4 樣品的X射線衍射圖

3 結(jié)論

本文以甲殼素為原料，通過(guò)C6-OH與氯乙胺鹽酸鹽發(fā)生親核取代反應(yīng)，接著對(duì)C2-氨基脫乙?；?，隨后通過(guò)氨基與羰基發(fā)生希夫堿反應(yīng)，制備得到兩性殼聚糖。通過(guò)紫外、紅外、X-射線衍射分析，一種新型兩性殼聚糖成功合成。該制備方法回避了C6-OH殼聚糖的常規(guī)衍生途徑，即C2-氨基的保護(hù)-脫保護(hù)，制備工藝更加簡(jiǎn)便。