宋華峰 胥萍

蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，蘇州 215131

結(jié)核病是一種由感染結(jié)核分枝桿菌（MTB）所引起的疾病，它的病程發(fā)展與機(jī)體的免疫功能有關(guān)。負(fù)性共刺激分子在調(diào)控免疫細(xì)胞功能時(shí)發(fā)揮著重要作用，其能夠負(fù)性調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子的分泌，從而抑制免疫細(xì)胞對外來病原體的免疫應(yīng)答[1-2]。因此，結(jié)核病患者中免疫細(xì)胞表面負(fù)性共刺激分子的異常表達(dá)對于機(jī)體有效清除MTB感染具有重要的調(diào)控作用。本文對負(fù)性共刺激分子在結(jié)核病中的表達(dá)進(jìn)行了綜述。

一、主要的負(fù)性共刺激分子與結(jié)核

負(fù)性共刺激分子所傳遞的第二信號(hào)負(fù)責(zé)對免疫細(xì)胞進(jìn)行負(fù)面調(diào)控，當(dāng)其表達(dá)量增加時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞的部分免疫功能[3]。研究顯示，負(fù)性共刺激分子的異常表達(dá)與慢性感染性疾病以及腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系。關(guān)于結(jié)核病與負(fù)性共刺激分子，研究最多的是PD-1分子，隨著研究的逐漸深入，BTLA、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3（Tim-3）等分子研究也越來越被關(guān)注。

1.PD-1與結(jié)核

PD-1負(fù)性共刺激分子是一類相對分子質(zhì)量約55 000的Ⅰ型跨膜糖蛋白，它屬于免疫球蛋白超家族成員。結(jié)核患者中部分免疫細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-1分子，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞對于結(jié)核菌的清除能力減弱。Shen等[4]探討PD-1/PD-L通路在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中對CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，結(jié)果顯示在活動(dòng)性結(jié)核組中PD-1+CD4+和PD-L1+CD4+T細(xì)胞比例均明顯高于健康組?；顒?dòng)性結(jié)核患者CD14+單核細(xì)胞上PD-1、PD-L1、PD-L2表達(dá)也明顯高于健康組；當(dāng)阻斷PD-1/PD-L信號(hào)通路后，可顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬以及細(xì)胞內(nèi)殺傷活性。Li等[5]發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者胸水中的單核細(xì)胞（PFMC）中PD-1表達(dá)的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加。進(jìn)一步通過CD45RO和CCR7/CD62L表面標(biāo)志物的標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，PD-1表達(dá)的CD4+和CD8+T細(xì)胞主要表現(xiàn)為CD45RO+CCR7-CD62L-表型，說明了PD-1的表達(dá)有利于T細(xì)胞向著效應(yīng)記憶性表型分化。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)核抗原的刺激后PD-1的表達(dá)情況會(huì)改變T細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2等Th1型細(xì)胞因子分泌能力?？傮w上這些PD-1+細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出耗竭的狀態(tài)，而是維持在對于抗原特異性的效應(yīng)狀態(tài)。還有研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號(hào)途徑與MTB特異性CD8+T細(xì)胞殺傷功能有關(guān)。Suarez等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核性胸膜炎患者積液樣本(PEMC)中，CD14+細(xì)胞上的PD-L1和CD8+T細(xì)胞上的PD-1均有高表達(dá)。上調(diào)的PD-1/PD-L1途徑阻礙了MTB特異性的CD8+T對巨噬細(xì)胞的特異性殺傷作用，而將PEMC中的CD14+巨噬細(xì)胞分離出來，并與用γ射線輻照過的MTB抗原刺激和自體CD8+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L1途徑能顯著增強(qiáng)MTB特異性CD8+T細(xì)胞對CD14+巨噬細(xì)胞的殺傷作用，可作為結(jié)核病治療的新輔助治療方法。

PD-1作為負(fù)性共刺激分子對細(xì)胞的免疫功能起到負(fù)性調(diào)控作用，但若將其完全敲除對機(jī)體的免疫應(yīng)答也有不利后果。Lázár-Molnár等[7]研究發(fā)現(xiàn)PD-1敲除后的小鼠控制體內(nèi)MTB清除的能力下降，小鼠肺部的MTB含量顯著升高，最終導(dǎo)致其存活期顯著降低。細(xì)胞因子分泌檢測顯示，在感染后28天，PD-1敲除小鼠的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-17的表達(dá)量均顯著升高，可見PD-1途徑是控制MTB感染后肺部過度炎癥反應(yīng)所必需的。Kauffman等[8]采用恒河猴實(shí)驗(yàn)對PD-1阻斷抗體在MTB感染中的效果進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示與對照組比較，抗PD-1單克隆抗體處理過的試驗(yàn)組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的疾病狀態(tài)以及更高的細(xì)菌負(fù)荷量，表明PD-1介導(dǎo)的共抑制作用在控制恒河猴MTB感染中發(fā)揮重要作用，很可能降低有害的炎癥反應(yīng)以及允許正常的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.B、T淋巴細(xì)胞弱化因子（BTLA）與結(jié)核

BTLA屬于免疫球蛋白超家族成員[9]，廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等。BTLA作為負(fù)性共刺激分子當(dāng)與其配體HVEM結(jié)合后會(huì)向細(xì)胞傳遞負(fù)性信號(hào)，從而抑制免疫細(xì)胞的部分功能[10]。異常表達(dá)的BTLA能夠影響免疫細(xì)胞表型的分化方向以及對MTB的清除能力，并反映患者的疾病病程進(jìn)展。Shen等[11]研究發(fā)現(xiàn)痰涂片陽性結(jié)核病患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞BTLA表達(dá)均較健康對照組顯著上調(diào)；復(fù)治患者CD4+和CD8+T細(xì)胞上BTLA表達(dá)均要顯著高于初次治療患者，并且BTLA表達(dá)量與痰樣本中細(xì)菌負(fù)荷量呈現(xiàn)出正相關(guān)性；肺部有空洞的患者CD4+和CD8+T細(xì)胞上BTLA表達(dá)水平高于無空洞的患者，由此表明結(jié)核患者CD4+和CD8+T細(xì)胞上BTLA表達(dá)水平上調(diào)與疾病進(jìn)展相關(guān)。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，活動(dòng)性肺結(jié)核患者中髓樣DC（mDC）和漿細(xì)胞樣DC（pDC）上BTLA的表達(dá)顯著上調(diào)；BTLA+mDC更加傾向于誘導(dǎo)促進(jìn)免疫細(xì)胞向Th2和Foxp3+Treg的方向極化，而抑制向抗擊MTB的Th17和Th22方向極化。

另外，BTLA能通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬促進(jìn)宿主對MTB的防御，這可能為結(jié)核病的治療提供新思路。Liu等[13]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默BTLA的信號(hào)通路后將會(huì)抑制巨噬細(xì)胞自噬從而促進(jìn)牛型減毒結(jié)核桿菌（BCG）和MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在胞內(nèi)存活，但不影響巨噬細(xì)胞的吞噬、活性氧(ROS)和凋亡功能的發(fā)揮；通過在體內(nèi)加入BTLA激動(dòng)劑可改善MTB感染過程中的肺部病理，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的自噬和病菌清除。Zeng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核患者的αβ T細(xì)胞上BTLA表達(dá)顯著降低，尤其是那些接受初級治療的患者，其BTLAhighαβ T細(xì)胞在細(xì)菌清除過程中表現(xiàn)為中央記憶表型，對抗MTB感染十分重要，且BTLAhighαβ T細(xì)胞相比較BTLAlowαβ T細(xì)胞在細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出更好的潛能。這些結(jié)果表明了上調(diào)表達(dá)的BTLA也會(huì)在αβ T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮正向調(diào)控作用。

3.Tim-3與結(jié)核

Tim-3是Ⅰ型跨膜蛋白，Tim-3膜蛋白特異性地表達(dá)于活化的Th1細(xì)胞表面，是區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)記分子[15-16]。Tim-3的配體是Galectin9，屬于半乳凝素家族，具有調(diào)節(jié)生物學(xué)功能的多樣性，如細(xì)胞的聚集與黏附、腫瘤細(xì)胞的凋亡等[17]。有研究顯示，與結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性對照組相比較，肺結(jié)核患者組總CD8+T細(xì)胞以及抗原特異性的CD8+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)都顯著升高；在涂片/培養(yǎng)陽性的結(jié)核組中CD8+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)要顯著高于涂片/培養(yǎng)陰性的結(jié)核組；在結(jié)核特異性抗原的刺激下，CD8+Tim-3+T細(xì)胞的IFN-γ分泌量降低，細(xì)胞脫顆粒功能和增殖能力也都出現(xiàn)了下降[18]。Qiu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞上的Tim-3分子以及其配體Gal-9都比健康對照組顯著升高，且CD4+T和CD8+T細(xì)胞主要表現(xiàn)為效應(yīng)記憶型。Tim-3上調(diào)表達(dá)的CD4+和CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的效應(yīng)功能，能夠增加IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-22等細(xì)胞因子的分泌量。

Tim-3除了調(diào)控T細(xì)胞免疫功能，也能調(diào)控NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)在活動(dòng)性結(jié)核病患者中NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)增加，且其表達(dá)量與IL-12刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，阻斷這一信號(hào)途徑增加了NK細(xì)胞對K562靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性，提高了NK細(xì)胞控制單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞中MTB生長的能力。Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)CD56dimCD16+NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)在較嚴(yán)重結(jié)核患者中要顯著高于病情較輕和中等的患者，這表明了Tim-3的表達(dá)與結(jié)核病嚴(yán)重程度相關(guān)。

二、其它負(fù)性共刺激分子與結(jié)核

細(xì)胞毒T細(xì)胞抗原4（CTLA-4），屬于免疫球蛋白超家族成員。一旦CTLA-4優(yōu)先與APC上的B7-1和B7-2分子結(jié)合，就會(huì)阻斷了CD28介導(dǎo)的激活T細(xì)胞的共刺激信號(hào)，使T細(xì)胞處于免疫功能失能狀態(tài)，參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)[22-23]。目前關(guān)于CTLA-4與結(jié)核的研究不多。有研究發(fā)現(xiàn)在HIV-結(jié)核共感染患者組中，絕大多數(shù)的PPD特異性CD4+T細(xì)胞高表達(dá)CTLA-4，當(dāng)接受過抗病毒和抗結(jié)核治療后，細(xì)胞表面的CTLA-4表達(dá)能夠降低約40%，在單結(jié)核感染組中，經(jīng)過抗結(jié)核治療后PPD特異性CD4+T細(xì)胞表面的CTLA-4能夠下降60%，但PD-1的降低只觀察到下降趨勢，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明了CTLA-4能夠反映結(jié)核治療的進(jìn)程[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4在鑒別診斷活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏感染者中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。該研究分析了外周血中CD4+CD25+Foxp3+上CTLA-4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示相比較潛伏感染患者組CTLA-4在活動(dòng)性結(jié)核組中的表達(dá)顯著上調(diào)，敏感度和特異性分別為86.7%和94.4%[25]。

淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG-3）是一種跨膜受體，在活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞亞群上表達(dá)，它與PD-1一樣也是一種負(fù)性共刺激分子[26]。Phillips等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對于感染MTB的恒河猴血液來源的CD4+T細(xì)胞內(nèi)LAG-3的沉默，導(dǎo)致共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞的細(xì)菌負(fù)荷顯著降低，而對來源于肺部的CD4+T細(xì)胞的LAG-3沉默卻沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果很可能是因?yàn)橄啾容^血液中CD4+T細(xì)胞，MTB感染后LAG-3在肺部CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)要高得多，并且RNAi對于LAG-3轉(zhuǎn)錄的影響在肺部來源CD4+T細(xì)胞中不那么明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)恒河猴CD4+T細(xì)胞中的LAG-3信號(hào)通路沉默后，IFN-γ、IL-6以及CXCL11促炎細(xì)胞因子分泌增加，從而顯著增強(qiáng)對巨噬細(xì)胞內(nèi)MTB的殺傷作用，因此，LAG-3的異常表達(dá)在調(diào)節(jié)MTB感染時(shí)發(fā)揮著重要作用。但是也有研究發(fā)現(xiàn)無論是敏感還是耐藥結(jié)核患者其CD4+和CD8+T細(xì)胞上LAG-3的表達(dá)與健康對照組相比較都沒有顯著差異，但是PD-1和Tim-3的表達(dá)卻顯著升高，對于這一差異性結(jié)果該研究者認(rèn)為可能是其納入的樣本數(shù)量不多而導(dǎo)致的[28]。

三、結(jié)語

結(jié)核病的發(fā)生以及病程進(jìn)展與機(jī)體的免疫應(yīng)答能力密切相關(guān)，負(fù)性共刺激分子在調(diào)控免疫細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用。大部分的研究表明結(jié)核病患者免疫細(xì)胞高表達(dá)的負(fù)性共刺激分子會(huì)抑制免疫功能，從而影響機(jī)體對MTB的清除，但也有部分研究發(fā)現(xiàn)一些負(fù)性共刺激分子的存在以及過量表達(dá)對于免疫細(xì)胞功能的發(fā)揮必不可少。臨床診斷方面，雖然已有研究表明部分負(fù)性共刺激分子的表達(dá)情況能夠區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染者，并且部分共刺激分子的表達(dá)與疾病的病程以及治療效果相關(guān)，但將其應(yīng)用到實(shí)際臨床中有待進(jìn)一步研究。相信隨著后續(xù)研究的逐漸深入，負(fù)性共刺激分子在結(jié)核病中的臨床診斷以及后期的治療應(yīng)用價(jià)值將會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展和推廣，從而有效遏制結(jié)核病的發(fā)生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突