基于16S rDNA高通量測序研究針灸對克羅恩病大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

鐘蕊 林亞瑩 朱毅 吳煥淦 孫可鑫 黃艷 祁琴 吳璐一

摘要 目的：采用16S rDNA高通量測序技術(shù)分析針灸對克羅恩?。–D）大鼠腸道菌群物種相對豐度和多樣性的影響，探討針灸對克羅恩病的作用機制。方法：將40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥餅灸組、電針組和西藥組，每組8只。采用2，4，6-三硝基苯磺酸溶液灌腸4周構(gòu)建CD大鼠模型，隔藥餅灸組和電針組選取天樞（雙側(cè)）、氣海穴進行干預(yù)，西藥組采用柳氮磺吡啶溶液灌胃干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后取結(jié)腸組織進行HE染色，收取大鼠糞便進行16S rDNA高通量測序并對進行物種相對豐度、alpha多樣性和基因功能代謝預(yù)測分析等。結(jié)果：隔藥餅灸組和電針組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著低于模型組（P<0.01）。與正常組比較，模型組擬桿菌門、放線菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、紫單胞菌科、普雷沃菌科、擬桿菌科、普雷沃菌屬等的相對豐度升高，厚壁菌門、變形菌門、梭菌綱、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃菌科、乳酸桿菌屬等的相對豐度降低;在經(jīng)過隔藥餅灸和電針治療后，上述大多數(shù)微生物相對豐度均有不同程度改善。與正常組比較，模型組腸道菌群的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等alpha多樣性指數(shù)均顯著下降（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組和電針組上述指數(shù)均顯著升高（P<0.05）。功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸和電針均能調(diào)節(jié)參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝等的功能基因。結(jié)論：CD與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，針灸能夠調(diào)節(jié)CD大鼠腸道菌群物種相對豐度和菌群多樣性。

關(guān)鍵詞 克羅恩病;針灸;腸道菌群;高通量測序;功能預(yù)測

Regulatory Effect of Acupuncture and Moxibustion on Gut Microbiota of Rats with Crohn′s Disease Based on 16S rDNA High-throughput Sequencing

ZHONG Rui1，LIN Yaying2，ZHU Yi2，WU Huangan2，3，SUN Kexin3，HUANG Yan2，QI Qin2，WU Luyi2，3

（1 Shanghai Qigong Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China）

Abstract Objective：To analyze the effects of acupuncture and moxibustion on the relative abundance and diversity of gut microbiota in rats with Crohn′s disease （CD） by 16S rDNA high-throughput sequencing and explore the mechanism of acupuncture and moxibustion on CD.Methods：Forty SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an indirect moxibustion group，an electroacupuncture （EA） group，and a western medicine group，with eight rats in each group.The CD model was induced in rats by enema with 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid for four weeks.The bilateral “Tianshu” （ST 25） and “Qihai” （CV 6） were selected for intervention in the indirect moxibustion group and the EA group，and the rats in the western medicine group received sulfasalazine solution by gavage.After the intervention，the colon tissues and rat feces were collected for HE staining and 16S rDNA high-throughput sequencing，respectively.The sequencing results were analyzed for species relative abundance，alpha diversity，and functional gene prediction.Results：The histopathological scores of colon tissues of rats in the indirect moxibustion group and the EA group were significantly lower than those in the model group （P<0.01）.Compared with the normal group，the model group showed the increased relative abundance of Bacteroidetes，Actinobacteria，Bacteroidia，Bacteroidales，Porphyromonadaceae，Prevotellaceae，Bacteroidaceae，and Prevotella，and the decreased relative abundance of Firmicutes，Proteobacteria，Clostrida，Clostridiales，Lachnospiraceae，Ruminococcaceae，and Lactobacillus.After indirect moxibustion and EA treatment，the relative abundance of the majority of the above-mentioned microorganisms improved to varying degrees.Compared with the normal group，the model group displayed decreased alpha diversity indexes of the gut microbiota，such as Chao1，Observed species，Shannon，and Simpson （P<0.05）.Those indexes were elevated in the indirect moxibustion group and the EA group（P<0.05）as compared with those in the model group.As revealed by functional prediction analysis，both indirect moxibustion and EA could regulate functional genes involved in carbohydrate metabolism and amino acid metabolism.Conclusion：CD is related to changes in the structure of gut microbiota，and acupuncture and moxibustion can regulate the relative abundance and diversity of gut microbiota in CD rats.

Keywords Crohn′s disease; Acupuncture and moxibustion; Gut microbiota; High-throughput sequencing; Functional prediction

中圖分類號：R245文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.004

克羅恩?。–rohn′s Disease，CD）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腸道炎癥疾病，可累及胃腸道的各個部位。本病在臨床上常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉，病程多遷延，不易根治。其發(fā)病機制尚未明確，目前多認(rèn)為與遺傳、感染、腸道微生態(tài)失衡以及免疫紊亂等相關(guān)[1]。近年來大量研究指出，腸道菌群失調(diào)與CD發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。CD患者腸道菌群與正常人存在明顯差異，常表現(xiàn)為CD患者體內(nèi)有益菌數(shù)量減少，病原菌和致病菌數(shù)量增加以及腸道菌群多樣性顯著降低等[2]。本病常規(guī)治療藥物主要包括氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等，但療效并不理想，且存在一定的不良反應(yīng)。因此，尋找一種安全有效的治療手段至關(guān)重要。

針灸具有安全、復(fù)發(fā)率低以及遠(yuǎn)期療效好等特點，作為一種補充替代療法廣泛地被臨床所應(yīng)用[3-5]?，F(xiàn)代許多臨床研究表明針灸在改善CD患者臨床癥狀、控制病情活動、維持緩解方面具有較好的療效[6-8]。課題組前期研究表明針灸對CD患者具有良好的治療效果，能夠緩解CD患者的臨床癥狀和體征，有效減輕CD患者結(jié)腸炎癥反應(yīng)，并能影響CD結(jié)腸黏膜組織異常的基因表達(dá)譜[9]。然而針灸對CD大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用尚不清楚，故本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上從腸道菌群角度探討針灸治療CD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用體質(zhì)量為（140±20）g的雄性清潔級SD（Sprague-Dawley）大鼠，于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫為（20±2）℃，濕度50%～70%，12 h晝夜節(jié)律交替，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將一般情況正常的大鼠納入實驗。所有動物的使用嚴(yán)格按照國家實驗動物健康規(guī)定執(zhí)行。實驗過程嚴(yán)格遵循動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，動物福利倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理審批號：PZSHUTCM210305005）。

1.1.2 藥物 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）（Sigma，美國，貨號：P2297）;柳氮磺吡啶腸溶片（上海中西三維藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020450）。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，貨號：10009228）;電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，型號：HANS-200A）;戊巴比妥鈉（Sigma，美國，貨號：P3761）;全自動組織脫水機（Leica，德國，型號：APS300S）;石蠟包埋機（Leica，德國，型號：EG1160）;石蠟切片機（Leica，德國，型號：RM2235）;光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本，型號：BX53）;糞便DNA提取試劑盒（TIANGEN，德國，貨號：DP328）;瓊脂糖（Oxoid，英國，貨號：LP0028A）;紫外微量分光光度計（Thermo Electron Corporation，美國，型號：840-210600）;PCR試劑盒（Kapa biosystems，美國，貨號：KK4601）;Hiseq測序儀（Illumina，美國，型號：2500）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、隔藥餅灸組、電針組和西藥組，每組8只。采用TNBS灌腸液制備大鼠CD模型[10]。大鼠稱重后，采用2%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。TNBS灌腸液制備：將無水乙醇加雙蒸水，配成50%的乙醇，然后將5%的TNBS與50%的乙醇按2∶1比例混合成TNBS灌腸液。以0.2 mL/100 g TNBS灌腸液進行灌腸;用12 cm長的灌腸針插入直腸約6～8 cm，1 mL注射器注入。每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、進食、活動、大便性狀等一般情況。每隔7 d重復(fù)灌腸1次，共4次。

1.2.2 干預(yù)方法 造模結(jié)束后第2天進行干預(yù)。正常組不做任何處理，模型組造模后也不做任何處理，隔藥灸組和電針組造模后分別采用隔藥餅灸和電針大鼠天樞（雙側(cè)）、氣海穴。隔藥餅灸組中藥餅主要以附子、肉桂、丹參等藥研末，用黃酒調(diào)和之后使用模具制成餅，厚約0.5 cm，直徑1 cm，將大小約90 mg的艾炷放在藥餅上置于上述穴位上施灸，每次每穴各灸2壯。電針組采用疏密波，頻率2～100 Hz，電流2 mA，留針20 min。西藥組采用柳氮磺吡啶溶液灌胃。劑量為：按成人（70 kg體質(zhì)量）∶大鼠（200 g體質(zhì)量）=1∶0.018比例根據(jù)《藥理學(xué)實驗方法》制備灌胃溶液。上述3個觀察組大鼠均固定時間干預(yù)1次/d，共7 d。標(biāo)本采集與處理治療結(jié)束之后，采用2%戊巴比妥鈉，40～50 mg/kg，腹腔注射麻醉，自肛門向上約2 cm處截取長6～8 cm的結(jié)腸，縱向剖開結(jié)腸，取出糞便放入凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存，并將取得的結(jié)腸放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變 主要步驟：結(jié)腸組織脫水、石蠟包埋、石蠟切片（厚度為4 μm），二甲苯、梯度乙醇、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇、伊紅染色、梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并進行結(jié)腸組織學(xué)評分。

1.2.3.2 大鼠腸道菌群16S rDNA高通量測序 采用16S rDNA高通量測序進行大鼠糞便樣本中腸道菌群的檢測（n=7）。該測序方法通過對16S rRNA基因上的可變區(qū)域進行擴增，利用可變區(qū)域的差異來對不同菌屬的細(xì)菌進行分類鑒定，檢測方法如下：1）樣品DNA抽提：采用DNA試劑盒對大鼠糞便中的總DNA進行抽提，并采用紫外微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的濃度和質(zhì)量，質(zhì)控合格的DNA進入文庫構(gòu)建。2）文庫構(gòu)建：選擇V3-V4區(qū)進行擴增，并加上測序儀所需的接頭、測序引物和index序列，構(gòu)建文庫。3）Illumina上機測序：文庫構(gòu)建好后，使用Illumina HiSeq2500 PE250測序平臺進行上機測序，通過橋式PCR擴增生成DNA簇，檢測與DNA片段結(jié)合的dNTP熒光信號獲知DNA片段序列。4）生物信息分析：測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，去除含N堿基、嵌合體的質(zhì)量低等序列，用優(yōu)化之后的序列進行運算分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類，每個OTU被認(rèn)為可代表一個物種。用OTU代表序列與16S數(shù)據(jù)庫進行比對和物種注釋，得到OTU豐度表，最后基于OTU豐度表進行后續(xù)的可視化和統(tǒng)計化分析。采用R語言進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用R語言3.2.3（http：//cran.r-project.org）中的Kruskal-Wallis檢驗進行組間差異物種豐度分析。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件（IBM Co.，Armonk，NY，USA）對腸道組織病理學(xué)評分進行統(tǒng)計分析，服從正態(tài)分布的資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，而不服從正態(tài)分布的資料則采用M（P25，P75）來表示。方差齊性，組間比較采用方差分析（One-wayANOVA）中的最小顯著性差異（LSD），方差不齊性，采用非參數(shù)檢驗中的秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

光鏡下顯示正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完好，腸黏膜上皮連續(xù)覆蓋，黏膜固有層腺體排列整齊，走向規(guī)則，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，無出血點、糜爛及潰瘍;模型組結(jié)腸黏膜、黏膜下層形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)腸黏膜出血，可見裂隙樣潰瘍，黏膜下層和肌層有大量炎癥細(xì)胞浸潤;隔藥餅灸組結(jié)腸組織損傷程度明顯減輕，黏膜層結(jié)構(gòu)尚完整，可見新生的黏膜上皮修復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤和出血程度均較模型組減輕;電針組結(jié)腸黏膜、黏膜下層以及肌層結(jié)構(gòu)基本正常，有新生的黏膜上皮修復(fù)和愈合性潰瘍;西藥組結(jié)腸組織可見新生的黏膜上皮修復(fù)、愈合性潰瘍，炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯減少，無明顯出血點。見圖1。

組織病理學(xué)評分結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;而隔藥餅灸組、電針組和西藥組結(jié)腸組織病理學(xué)評分均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。見圖2。

2.2 物種注釋豐度分析

根據(jù)OTU豐度表及其代表的不同物種，分別在門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）不同分類等級對各組樣品做相應(yīng)的物種相對豐度和比例的柱狀圖。在門水平包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）4種優(yōu)勢菌門，在屬水平普雷沃菌屬（Prevotella）、氏菌屬（Roseburia）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬XIVa（Clostridium XIVa）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等7種菌屬是主要優(yōu)勢細(xì)菌。與正常組比較，模型組擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌目（Bacteroidiales）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃菌屬（Prevotella）等的相對豐度升高，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等的相對豐度降低;在經(jīng)過隔藥餅灸、電針和西藥治療后，上述大多數(shù)微生物相對豐度均有不同程度改善，其中隔藥餅灸還能增加乳酸桿菌屬的相對豐度，電針還能增加瘤胃菌科的相對豐度。見圖3。

2.3 針灸對CD大鼠腸道菌群alpha多樣性的影響分析

alpha多樣性分析用來評估單個樣品中的物種多樣性，主要包括Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)以及PD whole tree指數(shù)，其中反映群落豐富度的指數(shù)主要有Chao1和Observed species。與正常組比較，模型組Chao1和Observed species指數(shù)均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組Chao1和Observed species指數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），電針組Chao1和Observed species指數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），西藥組Chao1和Observed species指數(shù)與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

反映群落多樣性的指數(shù)主要有Shannon、Simpson和PD whole tree指數(shù)。與正常組比較，模型組Shannon、Simpson和PD whole tree指數(shù)均有一定程度的下降，Shannon、Simpson指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），但PD whole tree差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組Shannon、Simpson和PD whole tree指數(shù)均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但PD whole tree指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），電針組Shannon、Simpson和PD whole tree指數(shù)均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但PD whole tree指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），西藥組Shannon、Simpson指數(shù)與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），PD whole tree指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖5。

2.4 針灸對CD大鼠腸道菌群16S功能預(yù)測代謝功能的影響

為了解CD大鼠腸道菌群代謝情況以及針灸對其調(diào)節(jié)作用，本研究采用PICRUSt（V1.0.0）軟件來預(yù)測5組腸道菌群潛在代謝功能的改變。5組間共有27個京都基因和基因組百科全書（KEGG）代謝通路差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在豐度前20的KEGG通路中，與正常組比較，膜運輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、翻譯等20個KEGG代謝通路中的功能基因在模型組中的相對豐度均降低;與模型組比較，上述20個KEGG代謝通路中的功能基因在隔藥餅灸組、電針組和西藥組中的相對豐度均增加。見圖6。

3 討論

本研究采用16S rDNA高通量測序研究CD大鼠微生物群落組成和相對豐度，以及針灸對其調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD大鼠的腸道菌群alpha多樣性降低，這與以往研究結(jié)果一致[11-13]。而在經(jīng)過隔藥餅灸和電針治療后，腸道菌群多樣性顯著升高，表明隔藥餅灸和電針能在一定程度上提高CD大鼠的腸道菌群群落豐富度和多樣性，改善腸道微生態(tài)。已有大量研究表明針灸能夠調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，改善腸道菌群多樣性，從而達(dá)到治療胃腸疾病的目的[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，艾灸治療7 d可以增加結(jié)腸炎大鼠腸道菌群的多樣性，提高腸道中乳酸桿菌等益生菌的數(shù)量，使結(jié)腸炎大鼠失調(diào)的腸道菌群向正常的方向轉(zhuǎn)變[15]，可能是針灸治療結(jié)腸炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但其具體機制尚不明確。侯天舒等[16]研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群多樣性，升高乳酸桿菌和毛螺科菌的相對豐度，降低雙酶梭菌的相對豐度。張博等[17]采用針灸聯(lián)合湯藥療法治療潰瘍性結(jié)腸炎患者，發(fā)現(xiàn)其能夠提高腸道菌群內(nèi)的乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的相對豐度，降低致病菌相對豐度。王園園[18]在對CD模型大鼠進行針刺與艾灸治療后發(fā)現(xiàn)，針灸可以調(diào)節(jié)CD大鼠腸道菌群的失衡狀態(tài)，改善大鼠腸道菌群的多樣性及益生菌與有害菌的豐富度。

本研究發(fā)現(xiàn)CD大鼠腸道的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，這與相關(guān)文獻[18]報道相似。擬桿菌門包括擬桿菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱，其中擬桿菌綱在有些時候能夠成為致病菌，在CD大鼠腸道中的相對豐度高于正常組。厚壁菌門包括梭菌綱、芽孢桿菌綱、柔膜菌綱，在大鼠腸道中占據(jù)主要優(yōu)勢的梭菌綱大部分都是產(chǎn)丁酸鹽菌，瘤胃菌科也是一種產(chǎn)丁酸鹽菌，其產(chǎn)生的丁酸鹽具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[19]，模型組梭菌綱、瘤胃菌科的相對豐度低于正常組，可能與模型組腸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而隔藥餅灸和電針對擬桿菌綱有明顯的下調(diào)作用，對梭菌綱有明顯的上調(diào)作用，提示針灸治療CD可能與調(diào)節(jié)上述細(xì)菌有關(guān)。普雷沃菌屬是一種常見的條件致病菌，研究表明普雷沃菌屬主要激活Toll樣受體2，通過抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生IL-23、IL-1，普雷沃菌屬還能刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和CCL20，促進黏膜Th17免疫應(yīng)答和中性粒細(xì)胞募集[20]。普雷沃菌屬介導(dǎo)的黏膜炎癥導(dǎo)致炎癥介質(zhì)、細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物的全身傳播，進而可能影響全身疾病的結(jié)局[21]。這表明某些普氏菌菌株可能是臨床上重要的病原菌，可促進慢性炎癥影響人類疾病的發(fā)生發(fā)展。而在本研究中，隔藥餅灸和電針能夠顯著降低大鼠腸道中普雷沃菌屬的相對豐度，表明針灸可能通過降低該菌屬而對腸道黏膜起到一定修復(fù)作用。

為了解CD大鼠腸道菌群代謝情況以及針灸對其調(diào)節(jié)作用，本研究基于16S rDNA高通量測序的結(jié)果對5組大鼠腸道微生物潛在代謝功能進行預(yù)測。結(jié)果顯示在L2水平，與正常組比較，碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路中的功能基因在模型組中的相對豐度均降低;與模型組比較，碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路中的功能基因在隔藥餅灸組、電針組和西藥組中的相對豐度均增加。表明CD大鼠紊亂的腸道菌群將影響碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路，而隔藥灸和電針均具有一定的調(diào)節(jié)作用。氨基酸是維持人體正常免疫能力，保護人體抵御疾病的必需物質(zhì)，氨基酸及其代謝產(chǎn)物在促進腸道生長、維持腸道功能和腸黏膜完整性等方面發(fā)揮重要作用[22]。CD患者體內(nèi)氨基酸代謝異常已被廣泛報道[23-25]，這與本研究結(jié)果類似。而隔藥灸和電針均能調(diào)節(jié)與氨基酸代謝相關(guān)的功能基因的豐度，從而保護腸道黏膜和腸道屏障。

綜上所述，CD大鼠在門、綱、目、科、屬等不同分類水平上均存在微生物組成和相對豐度的變化，而在經(jīng)過隔藥餅灸和電針治療后，上述大多數(shù)微生物相對豐度均有不同程度改善。本研究除了發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸和電針對CD大鼠腸道菌群調(diào)節(jié)作用的共性之外，還有個性之處，例如，隔藥餅灸還能增加CD大鼠乳酸桿菌屬等益生菌的相對豐度，而電針則能增加CD大鼠瘤胃菌科等產(chǎn)丁酸鹽菌的相對豐度?？偨Y(jié)起來，隔藥餅灸和電針均可以調(diào)節(jié)CD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂。本研究的不足之處在于，16S rDNA高通量測序技術(shù)得到的序列大部分都注釋不到屬水平，今后可以應(yīng)用宏基因組測序鑒定到種水平甚至菌株水平，從而更有利于闡明微生物群落在針灸治療CD中的作用機制。

參考文獻

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（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）