劉美含，雷立健，楊 瀟，丁 玲*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病學(xué)教研室，山西 太原030001；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

染色體異常與男性不育密切相關(guān)，在無(wú)精子癥患者中約占20%，在少精子癥患者中可達(dá)8%[1]。平衡易位是常見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)異常之一，其男性攜帶者可表現(xiàn)為精液正常且可正常生育；也可能表現(xiàn)為無(wú)精子癥、少精子癥等不育；也可表現(xiàn)為妻子自然流產(chǎn)、不良妊娠史等[2-4]。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，對(duì)平衡易位攜帶者，胚胎植入前診斷(PGD)被推薦為一種有效的選擇，可降低流產(chǎn)率，提高臨床妊娠率[5]。也有文獻(xiàn)報(bào)道由于PGD價(jià)格昂貴，嘗試自然受孕也是一個(gè)可行的選擇，其活產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于預(yù)期；未經(jīng)治療的攜帶者經(jīng)過(guò)5年的追蹤隨訪，其活產(chǎn)率可達(dá)60%至70%[6]。最近一篇Meta分析表明，平衡易位攜帶者能否通過(guò)PGD降低流產(chǎn)率，提高妊娠率，不同國(guó)家文獻(xiàn)報(bào)道不一致，也取決于特定的染色體和其斷裂點(diǎn)[7]。因此，臨床上對(duì)平衡易位攜帶者的遺傳咨詢尚有一定挑戰(zhàn)。

本研究以男性遺傳咨詢患者為研究對(duì)象，包括男性不育患者、女方有反復(fù)自然流產(chǎn)或不良孕產(chǎn)史的夫婦、妻子懷孕發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常需要行染色體對(duì)照的夫婦等進(jìn)行外周血染色體檢查；分析其染色體異常情況，針對(duì)染色體平衡易位攜帶者，進(jìn)一步探討其斷裂點(diǎn)與不育的關(guān)系，為臨床遺傳咨詢提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年1月至2020年12月到吉林大學(xué)第一醫(yī)院生殖男科就診，且行染色體檢查的6111例患者為研究對(duì)象，年齡20-49歲。臨床收集患者問(wèn)卷信息、臨床診斷等，主要臨床表現(xiàn)為：男性原發(fā)不育、妻子有反復(fù)自然流產(chǎn)、妻子有不良孕產(chǎn)史、妻子懷孕產(chǎn)前診斷檢出胎兒染色體異常等。

1.2 儀器和試劑材料

恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)MIR-162，日本三洋公司)、水浴箱(型號(hào)REX-C400，北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、電熱干燥箱(型號(hào)WOV-212S，日本三洋公司)、自動(dòng)掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)(型號(hào)CytoVision GSL-120，德國(guó)萊卡公司)、自動(dòng)細(xì)胞收獲儀(型號(hào)CP-II-32，上海樂(lè)辰生物科技有限公司)、普通光學(xué)顯微鏡(型號(hào)DM2500，德國(guó)萊卡公司)、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液(一生駿，廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司)、秋水仙素(廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司)、甲醇(北京化工廠)、無(wú)水乙醇(北京化工廠)、冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、吉姆薩染料(鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶(1∶250，鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣本采集和保存 所有患者經(jīng)臨床咨詢，填寫(xiě)申請(qǐng)單和知情同意書(shū)，抽取患者外周血2 ml于綠頭肝素抗凝采血管中(含有30 IU/ml肝素)，常規(guī)保存于4℃冰箱中，用于接種和淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2染色體接種、收獲與制備 在無(wú)菌操作條件下，用1 ml一次性注射器吸取0.8 ml抗凝血注入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕微搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收獲前2 h，用1 ml注射器加入終濃度為150 μg/ml的秋水仙素，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞分裂周期被阻斷至有絲分裂中期。將細(xì)胞懸液收集至15 ml離心管中，然后置于自動(dòng)細(xì)胞收獲儀進(jìn)行收獲，收獲程序如下：先1 500 r/min 條件下離心10 min，棄去上清液，加入低滲液8 ml，混勻后繼續(xù)37℃孵育30 min；后加入新鮮配制的1 ml卡諾固定液(甲醇：冰醋酸=3∶1)，充分吹打混勻，室溫靜置1 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入6 ml固定液混勻靜置后，2 000 r/min離心5 min，此過(guò)程重復(fù)兩次。最后一次固定完成后保留1-2 ml，制備成細(xì)胞懸液。

取懸液3-5滴滴至潔凈載玻片上，80℃烘烤2 h老化處理。將老化處理后的玻片放入預(yù)熱好的胰蛋白酶溶液中消化處理，具體時(shí)間根據(jù)效果調(diào)整，迅速用0.9%生理鹽水沖洗，吉姆薩染色2 min，自來(lái)水沖洗并室溫涼干備用。

1.3.3核型分析 將制備完成的核型玻片上自動(dòng)掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃片，然后進(jìn)行閱片核型分析。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析6個(gè)核型，按照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2016)判讀染色體核型結(jié)果。

1.4 易位斷裂點(diǎn)相關(guān)基因檢索

為了進(jìn)一步分析易位斷裂點(diǎn)與男性不育的關(guān)系，檢索易位斷裂點(diǎn)及其相關(guān)基因。檢索應(yīng)用網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim，檢索式為“具體斷裂點(diǎn)+sperm”。根據(jù)檢索結(jié)果，分析斷裂點(diǎn)與精子發(fā)生、男性不育的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 男性咨詢者的染色體異常統(tǒng)計(jì)

在6111例男性不育患者中，共計(jì)檢出染色體異常475例，檢出率為7.77%(475/6111)。在異常染色體中，多態(tài)性核型為最多，313例(65.9%)。47,XXY為 59例(12.4%)；平衡易位48例(10.1%)；倒位22例(4.6%)；羅氏易位18例(3.8%)；嵌合體9例(1.9%)；47,XYY為5例(1.1%)；47,XY,+mar為2例(0.4%)；46,XX男性為2例(0.4%)。

2.2 染色體平衡易位攜帶者及其臨床表現(xiàn)

有文獻(xiàn)報(bào)道將男性不育分為受孕前型不育(pregestational infertility)，其特征是不能受孕、未能產(chǎn)生受精卵；受孕型不育(gestational infertility)，其特征是受精后胚胎丟失[8]。前者與無(wú)精子癥、少精子癥或少弱精子綜合征等有關(guān)，后者與發(fā)育性早孕丟失、反復(fù)自然流產(chǎn)和死產(chǎn)等有關(guān)。本文48例男性染色體易位攜帶者中，表現(xiàn)為無(wú)精子癥、少精子癥、弱精子癥、原發(fā)不育的患者共計(jì)22例，屬于受孕前型不育；表現(xiàn)為不良孕產(chǎn)史、妻子孕異常兒、胚胎停育、精液正?；颊吖灿?jì)26例，屬于受孕型不育。具體核型及臨床表現(xiàn)見(jiàn)表1。

2.3 染色體平衡易位斷裂點(diǎn)與相關(guān)基因的關(guān)系

經(jīng)檢索OMIM易位斷裂點(diǎn)與精子相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)39個(gè)易位斷裂點(diǎn)與26個(gè)基因相關(guān)，這26個(gè)基因分別與男性原發(fā)不育、無(wú)精子癥、弱精子癥等相關(guān)，具體基因與所對(duì)應(yīng)的斷裂點(diǎn)見(jiàn)表2。

表1 染色體易位男性攜帶者及其臨床表現(xiàn)

3 討論

在有正常性生活、未采取避孕措施一年或更長(zhǎng)時(shí)間的夫婦中，15%夫婦會(huì)經(jīng)歷不孕不育，其中男性因素不育占50%[35]。隨著遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，男性不育病因的闡明也取得了一定進(jìn)展。明確遺傳病因，可有針對(duì)性的應(yīng)用相關(guān)治療方案；遺傳病因不明，治療方案也不明。染色體異常是男性不育最常見(jiàn)的遺傳因素，細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)可為不育男性的遺傳咨詢提供有價(jià)值的信息。臨床上最多的數(shù)目異常為47,XXY，結(jié)構(gòu)異常包括平衡易位、羅氏易位、倒位等[36]。不育男性的平衡易位發(fā)生率大約是普通人群的10倍。本文6111例男性不育患者中，染色體異常檢出率為7.77%，其中47,XXY占12.4%；平衡易位占10.1%。

染色體平衡易位可能導(dǎo)致斷點(diǎn)處遺傳物質(zhì)丟失，并可能導(dǎo)致精子發(fā)生失敗。受這種易位影響的個(gè)體表現(xiàn)出一些生殖問(wèn)題，如不育、反復(fù)自然流產(chǎn)和胎兒出生缺陷等[37]。這些影響效應(yīng)通常與易位所涉及的特定染色體和斷裂點(diǎn)有關(guān)；一些斷裂點(diǎn)可以破壞生精相關(guān)重要基因的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致精子發(fā)生或成熟障礙，以及男性不育[38]。針對(duì)受孕型不育，本文檢測(cè)出48例男性染色體易位攜帶者中，共計(jì)26例表現(xiàn)為不良孕產(chǎn)史、妻子孕異常兒、胚胎停育等患者。這些患者精液分析正常，其妻子能受孕，但有不良孕產(chǎn)史；進(jìn)一步分析染色體易位斷裂點(diǎn)，包括1p34，1p32，2p25，2q13，2q23，2q33，3p24，3p23，3p13，3p21，3q13，4p14，4q12，4q23，4q33，4q35，5p13，5q13，6p21，6q15，6q21，6q25，7p13，8q24，9p22，9p23，10p13，10q11，10q22，10q26，11p15，11q23，12p11，13q14，14q22，14q32，15q11，15q15，15q22，15q26，16p13，16q23，17q23，18q12，18q21，18q23，19q13，22q13。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，染色體平衡易位攜帶者有兩種選擇：一種是行PGD，另一種是繼續(xù)嘗試自然受孕[6]。Fischer等學(xué)者[39]報(bào)道經(jīng)歷3次或3次以上流產(chǎn)的易位攜帶者可通過(guò)PGD受益，降低流產(chǎn)率，提高妊娠率，懷孕時(shí)間縮短。Scriven等[40]報(bào)道PGD可通過(guò)降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和避免不平衡易位妊娠而使易位攜帶者受益。然而，也有學(xué)者報(bào)道有63.0%的易位攜帶者在嘗試自然受孕后成功活產(chǎn)，自然受孕的累計(jì)活產(chǎn)率為65%-83%[41]。因此，針對(duì)受孕型不育的易位斷裂點(diǎn)可能不影響精子發(fā)生，其妻子能夠受孕。這些攜帶者可以考慮嘗試進(jìn)一步自然受孕，但要行產(chǎn)前診斷。

表2 受孕前不育攜帶者易位斷裂點(diǎn)與相關(guān)基因的關(guān)系

針對(duì)受孕前型不育，本文檢出48例男性染色體易位攜帶者中，共計(jì)22例表現(xiàn)為無(wú)精子癥、少精子癥、弱精子癥、原發(fā)不育患者。經(jīng)檢索OMIM易位斷裂點(diǎn)與精子發(fā)生相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)39個(gè)易位斷裂點(diǎn)與26個(gè)基因相關(guān)，這26個(gè)基因分別與男性原發(fā)不育、無(wú)精子癥、弱精子癥等相關(guān)。結(jié)合基因功能分析發(fā)現(xiàn)，SPATA46，CATSPER3，SPGF7，JAM3，CDADC1，SPGF36，ADAM21，SPGF30，SPGF27，SPGF1，TSSK2，SPGFX3基因可能與精子發(fā)生相關(guān)，可直接導(dǎo)致無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥；SMCP，SPGF34，SPGF18，DNAH5，MOSPD3，DNAH11基因可能與弱精子癥相關(guān)；OAZ3，ADAD1，SPGF10，SPGF31基因可能與畸形精子癥有關(guān)；而SPACA1，IZUMO1R，ACR基因可能與受精功能相關(guān)，即使是精子參數(shù)正常，也可能不能受精，可能與原發(fā)性不育有關(guān)。這些基因?qū)?yīng)的易位斷裂點(diǎn)包括1q21，1q23，2q32，3p21，4q27，5q31，5p15，6q15，7q22，7p15，11q13，11q25，11q21，13q14，14q13，14q24，14q32，16p13，16q22，17p11，20q13，22q11，22q13，Xp21。根據(jù)基因與表型的關(guān)系，結(jié)合本文病例分析，以下基因與臨床表型一致，如：SMCP基因定位在染色體1q21，與弱精子癥密切相關(guān)[9]。SPATA46基因定位在染色體1q23，是精子發(fā)生所必需的；基因結(jié)構(gòu)改變可能導(dǎo)致無(wú)精子癥發(fā)生[11]。ADAD1基因定位在4q27,與畸形精子癥有關(guān)[14]。CATSPER3基因定位在5q31，是精子特異性離子通道，可能與精子發(fā)生密切相關(guān)[15]。SPGF7基因定位在11q13，與男性不育相關(guān)[20]。JAM3基因定位在11q25，與男性不育有關(guān)[21]。CDADC1基因定位在13q14，調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育與精子發(fā)生，可能導(dǎo)致無(wú)精子癥發(fā)生[23]。SPGF36基因定位在14q13，與精子發(fā)生有關(guān)[24]。SPGF30基因定位在14q32，變異導(dǎo)致非梗阻性無(wú)精子癥[26]。SPGF1基因定位在20q13，可能與少弱精子癥有關(guān)[31]。TSSK2基因定位在22q11，在睪丸特異性表達(dá)，其功能值得進(jìn)一步研究[32]。ACR基因定位在22q13，與受精有關(guān)，表達(dá)頂體酶，與原發(fā)性不育密切相關(guān)[33]。SPGFX3基因定位在Xp21，與男性原發(fā)性不育有關(guān)[34]。以上結(jié)果和文獻(xiàn)提示，染色體易位斷裂點(diǎn)可能影響其相關(guān)基因結(jié)構(gòu)或功能，影響精子發(fā)生或精子功能，最終導(dǎo)致男性不育。經(jīng)過(guò)與受孕型不育相對(duì)比，有3p21，6q15，13q14，22q13四個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)在二種不育類(lèi)型中，因此推測(cè)這四個(gè)斷裂位點(diǎn)不影響精子發(fā)生，應(yīng)重點(diǎn)考慮易位的另一條染色體斷裂點(diǎn)。另外，這些斷裂點(diǎn)可能直接導(dǎo)致精液參數(shù)改變，難以完成自然受孕，建議這類(lèi)夫婦直接選擇PGD輔助生殖技術(shù)助孕。

染色體易位導(dǎo)致男性不育的機(jī)制目前尚不清楚，針對(duì)當(dāng)前研究可總結(jié)為：①易位攜帶者減數(shù)分裂障礙導(dǎo)致精子發(fā)生失敗，存在配子形成問(wèn)題，導(dǎo)致不育[42]；②染色體平衡易位攜帶者產(chǎn)生不平衡的配子，導(dǎo)致反復(fù)自然流產(chǎn)，降低生育能力[42]；③特定染色體和易位中涉及的斷裂點(diǎn)破壞精子發(fā)生重要基因的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致男性不育[42]；④染色體重排破壞或失調(diào)對(duì)生育重要的基因[43-44]。因此，關(guān)注和研究易位染色體斷裂點(diǎn)，一方面可以為臨床遺傳咨詢提供理論基礎(chǔ)，另一方面可能發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生或成熟相關(guān)的基因，因此值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本文報(bào)道染色體平衡易位斷裂點(diǎn)與男性不育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)染色體易位斷裂點(diǎn)1q21，1q23，4q27，5q31，11q13，11q25，14q13，14q32，20q13，22q11，Xp21與受孕前型不育相關(guān)，這類(lèi)攜帶者夫婦應(yīng)該直接選擇PGD助孕。其他染色體斷裂點(diǎn)與受孕型不育相關(guān)，可以考慮PGD助孕或自然受孕后行產(chǎn)前診斷。在臨床遺傳咨詢中，這些特定的染色體和斷裂點(diǎn)應(yīng)該受到關(guān)注。