杜文俊, 馮燕樓, 安 瑩, 褚夫敏, 段曉洋， 丁 寧

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種與細(xì)菌培養(yǎng)基

米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)藻種由中國海洋大學(xué)藻種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供. 培養(yǎng)液為改良f/2營養(yǎng)液，成分參照Guillard的方法[9]. 米氏凱倫藻在光照強(qiáng)度為3000 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h，溫度為(25±1) ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期. 細(xì)菌2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,酵母膏1 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水1000 mL，正向瓊脂粉1.5 g(固體培養(yǎng)基).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離篩選

于無菌操作臺(tái)中取對數(shù)生長期的米氏凱倫藻藻液稀釋成不同的濃度梯度,各移取0.1 mL至2216E固體培養(yǎng)基上,用涂布棒均勻涂布,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),待其長出單菌菌落后按照形態(tài)、顏色不同采用劃線法進(jìn)行單菌的分離純化,挑取單菌接種于經(jīng)高溫滅活的2216E液體培養(yǎng)基中,于25 ℃、150 r·min-1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天,用于單菌DNA提取,剩余的用15% (V/V)甘油于80 ℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2 細(xì)菌DNA制備及序列分析

待測菌株經(jīng)培養(yǎng)3天后經(jīng)高速離心收集得到菌體，用AXYGEN AxyPrep基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA. 以正向27F和反向1492R為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列；取3 μL PCR產(chǎn)物跑電泳,用凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察并選取條帶明亮且單一的擴(kuò)增子送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序；將測序所得的序列在GenBank上與數(shù)據(jù)庫已有的細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行blast比對,通過Clustal X建立aln文件,用軟件MEGA4.1對菌株系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建.

PCR(LC480II型)擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序?yàn)椋?5 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 23 μL；95 ℃預(yù)變性6 min，94 ℃變性50 s,60 ℃退火50 s,75 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)后，75 ℃延伸10 min.

1.2.3 抑藻試驗(yàn)

取經(jīng)過分離純化培養(yǎng)后的單菌菌液按5%體積比接種于米氏凱倫藻培養(yǎng)液中，以添加無菌2216E液體培養(yǎng)基為對照組，測定其抑藻活性，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行7天. 觀察米氏凱倫藻形態(tài)變化，藻細(xì)胞計(jì)數(shù)于光學(xué)顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行，從第0天開始，每24 h計(jì)數(shù)一次，選取抑藻細(xì)菌，抑藻率(Inhibition rate，IR)計(jì)算參考以下公式：IR=(對照組生長量-實(shí)驗(yàn)組生長量)/對照組生長量×100%. 設(shè)置3組平行，并繪制微藻細(xì)胞的生長曲線.

1.2.4 抑藻菌的作用方式

取培養(yǎng)3天的細(xì)菌發(fā)酵液分別通過離心機(jī)高速離心(8500 r·min-1，15 min)和0.22 μm超微孔濾膜過濾，得到除菌后的過濾液；將沉淀用等體積的f/2營養(yǎng)液反復(fù)洗滌3次，得到純菌體. 將原菌液、除菌濾液和純菌體的重懸液按照3%體積比分別加入至生長良好的米氏凱倫藻藻液中進(jìn)行共培養(yǎng)，抑藻實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行進(jìn)行48 h. 抑藻率計(jì)算方法參照1.2.3.

1.2.5 不同作用濃度菌液的抑藻實(shí)驗(yàn)

將抑藻菌接種至2216E液體培養(yǎng)基中活化，于25 ℃、150 r·min-1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天. 分別取1%和3%體積比的抑藻菌菌液加入至生長良好的米氏凱倫藻培養(yǎng)液中進(jìn)行共培養(yǎng)，對照組和抑藻率計(jì)算方法同1.2.3.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析使用軟件SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010完成. 檢驗(yàn)處理組與對照組之間的差異顯著性通過單因素方差分析檢驗(yàn)(One-way ANOVA)，P<0.05表示具有顯著性差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 米氏凱倫藻抑藻菌的分離鑒定

從米氏凱倫藻培養(yǎng)液中共分離純化得到14株單菌，其中一株細(xì)菌D-2對米氏凱倫藻的生長具有顯著抑制效應(yīng). 將測序所得的米氏凱倫藻抑藻菌D-2的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，根據(jù)序列比對結(jié)果,抑藻菌D-2隸屬于 Marinobacter屬. 對所測定的這株米氏凱倫藻抑藻細(xì)菌以及 GenBank數(shù)據(jù)庫中與它們同源性最大的細(xì)菌16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖1，可確定D-2為海桿菌屬(Marinobacter sp.).

圖1 基于16S rRNA的米氏凱倫藻抑藻細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 抑藻菌對米氏凱倫藻的抑制效應(yīng)

如圖2，經(jīng)過抑藻試驗(yàn)測得1株細(xì)菌Marinobacter. sp可以顯著抑制米氏凱倫藻的生長. 對照組中，米氏凱倫藻的生長分別呈現(xiàn)延滯期、平穩(wěn)增長期和對數(shù)生長期,藻細(xì)胞密度第0天為7.6×104cells·mL-1，在培養(yǎng)過程中逐漸增加至第7天的1.29×105cells·mL-1,抑藻菌D-2實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度均明顯減少(P<0.05)；在前3天時(shí)米氏凱倫藻細(xì)胞密度隨處理時(shí)間延長而逐漸降低，在第3天時(shí)，藻細(xì)胞數(shù)即降至最低的0.3×104cells·mL-1,抑制率達(dá)到94.9%(P<0.05). Oh等(2011)從微藻Cochlodinium polykrikoides培養(yǎng)液中分離得到一株Sagittulaju屬菌株，對有害甲藻類微藻呈現(xiàn)出顯著的裂解效果[12].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文分離得到的一株海桿菌，對米氏凱倫藻赤潮的防治具有潛在應(yīng)用價(jià)值.

圖2 抑藻菌對米氏凱倫藻細(xì)胞生長的影響

2.3 抑藻菌的作用方式

圖3 海桿菌抑制米氏凱倫藻的作用方式

海桿菌抑制米氏凱倫藻的作用方式見圖3，由圖可知3%海桿菌原菌液抑藻效果明顯(P<0.05)，經(jīng)離心過濾處理后的海桿菌的無菌上清液也呈現(xiàn)出顯著的抑藻效果(P<0.05)，在48 h時(shí)抑藻率即達(dá)到92.9%. 經(jīng)過離心沉淀得到的海桿菌的純菌體對米氏凱倫藻生長的抑制效果并不明顯(P>0.05)，且輕微促進(jìn)了微藻細(xì)胞的生長. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海桿菌不是通過和米氏凱倫藻細(xì)胞直接接觸抑藻，可以推斷是通過菌體產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)對藻細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的間接抑藻方式. 從赤潮暴發(fā)海域分離的一株Halomonas屬菌株，其分泌的代謝產(chǎn)物能加速東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)光合色素的分解，使胞內(nèi)總糖含量降低[13].Zheng等(2018)篩選得到一株P(guān)seudoalteromonas sp.,也通過分泌胞外活性物質(zhì)對赤潮藻米氏凱倫藻細(xì)胞具有明顯的裂解作用[14].

2.4 菌液以不同作用濃度投加的抑藻效果

圖4為不同作用濃度海桿菌菌液對米氏凱倫藻72 h處理后其生長量的影響效果. 結(jié)果表明，對照組中米氏凱倫藻細(xì)胞持續(xù)生長，隨著抑藻菌菌液處理濃度的升高，米氏凱倫藻的生長量呈現(xiàn)顯著降低的趨勢. 在1%菌液作用濃度下，隨著作用時(shí)間延長藻細(xì)胞密度總體呈現(xiàn)下降趨勢，在第3天時(shí)表現(xiàn)出對米氏凱倫藻生長的最大抑制作用(P<0.05)，在第0.5天時(shí)相比對照組抑藻菌對其生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用(負(fù)抑制)(P>0.05). 這一現(xiàn)象普遍被認(rèn)為是低濃度的毒物對微藻產(chǎn)生了刺激效應(yīng)[15].當(dāng)菌液濃度為3%時(shí)，相比對照組1天以后抑藻菌對藻細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出顯著的抑制效果(P<0.05)，抑藻率維持在95%以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本課題組分離得到的海桿菌株對有害赤潮藻米氏凱倫藻的生長具有短期有效的滅殺效果，且作用濃度在3%以上時(shí)抑制效果顯著.

圖4 不同作用濃度菌液的抑藻效果

3 結(jié) 論

利用平板涂布劃線方法從生長良好的赤潮藻米氏凱倫藻培養(yǎng)液中分離純化得到一株抑藻細(xì)菌D-2. 采用分子生物學(xué)方法，對抑藻菌D-2進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)16S rRNA 序列分析，菌株D-2隸屬于海桿菌屬(Marinobacter sp.). 經(jīng)過藻—菌共培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明海桿菌D-2對米氏凱倫藻細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，在共培養(yǎng)第3天時(shí)抑藻率即達(dá)到95%. 通過離心和過濾方式得到抑藻菌D-2的過濾液和純菌體并分別進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其抑藻效應(yīng)在D-2的除菌上清液中顯現(xiàn)，驗(yàn)證了D-2抑藻方式為通過釋放抑藻物質(zhì)的間接裂解方式. 測定不同作用濃度海桿菌D-2菌液在不同作用時(shí)間下的抑藻效果，結(jié)果表明抑藻菌D-2具有作用濃度和時(shí)間依賴性，在3%作用濃度下抑藻效果更佳. 以上結(jié)果表明，本課題組分離得到的一株細(xì)菌D-2對有害赤潮藻米氏凱倫藻具有短期高效的抑藻作用，為藻—菌關(guān)系的互作過程和機(jī)理的解讀，以及以米氏凱倫藻為優(yōu)勢藻種的赤潮的發(fā)生和防控方法提供參考和借鑒.