NaCl 脅迫對亞柄薹草形態(tài)和相關(guān)生理指標(biāo)的影響

李英博，韓戴宇，付如裕，鞠志新

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 吉林 長春130000；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 吉林 吉林 132000）

土壤鹽漬化威脅農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量，阻礙現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是一個全球性的生態(tài)問題。全世界超過1/3 的灌溉土地受到鹽堿化的影響[1]。此外，不良的灌溉實踐和土地清理導(dǎo)致土壤次生鹽堿化，從而限制了土地利用和作物產(chǎn)量[2]。因此，了解植物對鹽脅迫的形態(tài)、生理、代謝和生化反應(yīng)，對于培育耐鹽植物具有極其重要的意義。鹽分對植物的形態(tài)和生理功能造成了負面影響。鹽分會抑制種子萌發(fā)、植物生長、發(fā)育和產(chǎn)量。在鹽脅迫下，植物表現(xiàn)出鮮重(fresh weigt, FW)和干重(dry weight, DW)下降，尤其是地上部分，株高和冠幅的下降，主要是由于葉片數(shù)量減少或形成的葉片越來越小[3]。在高鹽濃度下，植物活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累引起氧化應(yīng)激，此時活性氧清除機制激活，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)等抗氧化系統(tǒng)的增強提高了植物的耐鹽性[4]。隨著脅迫時間的延長，抗氧化酶系統(tǒng)的作用減弱，ROS 不斷增多，膜脂過氧化作用增強，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加[5]。由于鹽分在植物體內(nèi)大量積累，破壞了細胞膜透性，導(dǎo)致電導(dǎo)率上升；與此同時脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，清除自由基，減少植物受到的鹽害[6-7]。植物中的葉綠素含量與植物的健康直接相關(guān)。鹽脅迫下葉綠素濃度降低是一種常見現(xiàn)象，但是也會出現(xiàn)葉綠素濃度增加的現(xiàn)象，這可能是由于受到脅迫的植物葉片中每單位葉面積的葉綠體數(shù)量增加所致[8-9]。

亞柄薹草(Carex subpediformis)是莎草科薹草屬的多年生草本植物，主要分布于我國東北、華北、西北等地區(qū)[10]。亞柄薹草植株較矮，適應(yīng)性強，并具返青早、生長期長、根莖發(fā)達、耐踐踏等優(yōu)點[11]。目前國內(nèi)外對亞柄薹草的研究，主要在植物資源與物種多樣性以及草本植物引種、抗旱性評價等方面[12-14]，對其耐鹽性的研究鮮見報道。為了探討能否將亞柄薹草引種栽培至鹽漬環(huán)境下，并研究其耐鹽機制和耐受程度，本研究以亞柄薹草為研究材料，分析不同濃度NaCl 脅迫對其生長、生理相關(guān)指標(biāo)的影響，計算其耐鹽閾值，以期為亞柄薹草耐鹽機制的深入研究提供數(shù)據(jù)支持，并為今后亞柄薹草野生資源開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試亞柄薹草材料引種于吉林省白山市靖宇縣，現(xiàn)栽培保存于吉林省吉林市吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院九站校區(qū)園藝場長白山薹草資源圃。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2021 年5 月中旬至7 月中旬在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院園藝場進行。于5 月中旬選擇生長健壯且長勢一致的亞柄薹草，栽植在底部帶有托盤的花盆中，栽培基質(zhì)為復(fù)合基質(zhì)(園土 ∶ 草炭 ∶ 沙子 = 1 ∶ 1 ∶ 1)，在防雨水條件下進行栽培，每盆栽3 叢，每叢20 芽株。培養(yǎng)1 個月后，將所有材料修剪至相同高度，進行NaCl 脅迫處理。NaCl 脅迫處理共設(shè)5 個濃度，0 (CK)、50、100、200、300 mmol·L-1，其中對照組0 (CK)為蒸餾水處理。隨機區(qū)組排列，每個濃度處理設(shè)3 個重復(fù)，每1 盆作為一個重復(fù)，共15 盆。為減小鹽分沖擊，50 mmol·L-1以上NaCl 濃度采用分次澆灌，首次澆灌50 mmol·L-1NaCl 濃度，之后每天遞增50 mmol·L-1濃度，達到預(yù)設(shè)終濃度后，再處理14 d。每隔2 d 用最終濃度的NaCl 溶液澆灌，其余時間采用噴濕葉面補充水分。為保持NaCl 濃度恒定，每盆澆灌同等體積NaCl 溶液，隨時將流入托盤的鹽溶液再次澆入花盆中，反復(fù)幾次，直至不再流出，以使盆土鹽分不會流失。在鹽脅迫處理14 d后，測量植株生長指標(biāo)，并對植株葉片進行隨機取樣，用蒸餾水清洗葉片表面的塵土，擦干，立即進行液氮速凍，放入超低溫冰箱貯藏，用以測定植物生理指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定

測量亞柄薹草從地面到草叢頂部的垂直高度，記為株高；測量亞柄薹草南北和東西方向的平均值記為冠幅。剪取每盆亞柄薹草單株地上部，用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙迅速吸干表面水分，然后放入105 ℃烘箱中殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，稱重記為干重。

1.3.2 生理指標(biāo)測定

細胞膜透性采用電導(dǎo)率法測定，MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定，SOD 活性采用氮藍四唑光還原法測定，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取法測定，可溶性糖含量采用蒽酮法測定，葉綠素含量采用丙酮-乙醇提取法測定[15]。

1.3.3 耐鹽閾值計算

多數(shù)植物以其植株生物量下降50%時的鹽濃度作為該植物的耐鹽閾值[16-17]。該試驗以NaCl 鹽處理14 d 后亞柄薹草株高、冠幅、干重為因變量(y)，以NaCl 濃度為自變量(x)建立回歸方程，最終以因變量比對照處理下降50%時所對應(yīng)的最低鹽濃度作為亞柄薹草的耐受閾值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行多元回歸分析及單因素方差分析，采用Duncan 法進行多重比較，顯著性水平設(shè)定為0.05，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Excel 2016 進行圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫對亞柄薹草生長的影響

亞柄薹草的株高、冠幅、干重均隨著NaCl 濃度的增加呈下降趨勢，但各自的變化不同(表1)。當(dāng)NaCl 濃度為50 mmol·L-1時，鹽脅迫對亞柄薹草株高的影響不顯著(P＞ 0.05)，當(dāng)NaCl 濃度大于50 mmol·L-1時亞柄薹草株高顯著降低(P＜ 0.05)。當(dāng)NaCl 濃度為300 mmol·L-1時，亞柄薹草株高較對照降幅最大，為63.72%。低濃度鹽脅迫對亞柄薹草冠幅的影響較小，當(dāng)NaCl 濃度為300 mmol·L-1時顯著抑制了亞柄薹草冠幅的生長，較對照下降了55.10%。各脅迫濃度處理下的干重與對照存在顯著差異(P＜0.05)，干重在鹽脅迫濃度達到200、300 mmol·L-1時降幅最大，較對照分別下降了44.57%和55.22%。

表1 NaCl 脅迫對亞柄薹草生長指標(biāo)的影響Table 1 Effects of NaCl stress on growth index of Carex subpediformis

2.2 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片質(zhì)膜透性和丙二醛含量的影響

亞柄薹草葉片相對電導(dǎo)率隨著鹽濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(圖1)，各處理之間差異顯著(P＜ 0.05)。當(dāng)脅迫濃度增加到200 和300 mmol·L-1時，亞柄薹草葉片的相對電導(dǎo)率分別為53.17%和62.73%，比對照提高了20.80 和30.37 百分點。亞柄薹草丙二醛含量隨著鹽濃度增加呈逐漸上升趨勢(圖1)。當(dāng)含鹽量在50～300 mmol·L-1時，MDA 含量均與對照差異顯著(P＜ 0.05)；但當(dāng)鹽濃度為200～300 mmol·L-1時差異不顯著(P＞ 0.05)。

圖1 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片質(zhì)膜透性和丙二醛含量的影響Figure 1 Effects of NaCl stress on leaf membrane permeability and malondialdehyde (MDA) content of Carex subpediformis

2.3 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片抗氧化酶活性的影響

在鹽脅迫處理下，亞柄薹草葉片SOD 活性和POD 活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且峰值均出現(xiàn)在100 mmol·L-1，分別較對照提高了221.09%和224.42%，說明100 mmol·L-1NaCl 可能是亞柄薹草的最佳耐受鹽度(圖2)。各處理間SOD 活性都存在顯著差異(P＜ 0.05)，POD 活性在50 mmol·L-1時，與對照相比差異不顯著(P＞ 0.05)，僅比對照升高了2.52%。當(dāng)NaCl 濃度超過100 mmol·L-1時，SOD 和POD 活性均有明顯的降低，說明此時亞柄薹草受到鹽害加重，自身防御系統(tǒng)被破壞，從而兩種抗氧化酶活性降低。

圖2 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響Figure 2 Effects of NaCl stress on leaf SOD and POD activity of Carex subpediformis

2.4 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片游離脯氨酸和可溶性糖含量的影響

亞柄薹草葉片的游離脯氨酸含量隨NaCl 濃度增加，呈先增后減的趨勢，各濃度脅迫處理均與對照形成顯著差異(P＜ 0.05)，當(dāng)NaCl 濃度為100 mmol·L-1時其含量急劇上升且達到峰值，為對照的5.02 倍；當(dāng)脅迫濃度超過100 mmol·L-1時，游離脯氨酸含量降低(表2)。

亞柄薹草葉片中可溶性糖含量變化與游離脯氨酸變化趨勢相似，但有所不同。在低鹽濃度下(50 mmol·L-1)與 對 照 相 比 差 異 不 顯 著(P＞ 0.05)；在100 mmol·L-1時上升幅度最大，較對照增加了73.85% (表2)。說明亞柄薹草可以通過增加可溶性糖來適應(yīng)鹽脅迫，但隨著NaCl 濃度增加，超過可受脅迫程度，不能正常生長，可溶性糖含量降低。

表2 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片游離脯氨酸和可溶性糖含量的影響Table 2 Effects of NaCl stress on leaf proline and soluble sugar content of Carex subpediformis

2.5 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片葉綠素含量的影響

隨著NaCl 脅迫濃度的升高，亞柄薹草葉片葉綠素含量先上升后下降(表3)。隨著鹽濃度的增大，亞柄薹草葉綠素a 在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時相比對照達到峰值，為1.92 mg·g-1，并與其他處理之間差異顯著(P＜ 0.05)，且隨著土壤含鹽量的升高，葉綠素a 含量顯著降低。亞柄薹草葉綠素b 與葉綠素a變化趨勢相近，但各處理均與對照差異顯著。亞柄薹草葉綠素a + b 在脅迫濃度為300 mmol·L-1時顯著低于對照，降幅為33.01%。NaCl 處理對亞柄薹草葉綠素a/b 影響較小，各處理之間差異不顯著(P＞ 0.05)，在鹽濃度為50 mmol·L-1時達到最大，為1.63 mg·g-1。

表3 NaCl 脅迫對亞柄薹草葉片葉綠素含量的影響Table 3 Effects of NaCl stress on leaf chlorophyll content of Carex subpediformis

2.6 NaCl 脅迫下亞柄薹草耐鹽閾值的確定

為進一步研究亞柄薹草對不同濃度NaCl 脅迫的耐鹽程度，分別以株高、冠幅、干重3 個指標(biāo)為因變量(y)，以NaCl 濃度為自變量(x)進行回歸分析，建立回歸方程(圖3)?？梢钥闯觯旮?、冠幅、干重與鹽濃度之間二次曲線模型的R2值均高于線性模型R2值，F(xiàn)統(tǒng)計量的顯著值都等于0.00，遠遠小于0.01，說明兩個模型都顯著，并且都具備常數(shù)項，因此二次曲線函數(shù)關(guān)系擬合效果最優(yōu)。從3 個回歸方程可知，以干重作為因變量求出的耐鹽閾值最小(169 mmol·L-1)，說明以干重生物量下降50%的鹽濃度作為亞柄薹草耐鹽閾值更符合實際。因此，可初步認為亞柄薹草在NaCl 的脅迫下耐鹽閾值為169 mmol·L-1。

圖3 NaCl 濃度與株高、冠幅和干重的曲線擬合Figure 3 Curve-fitting of NaCl concentration and plant height, crown width, and dry weight

3 討論與結(jié)論

灌溉水中的高鹽濃度會導(dǎo)致植物生長減少，限制葉片擴展，并改變地上部分和根系之間的關(guān)系[18]。本研究通過分析不同濃度NaCl 脅迫下亞柄薹草株高、冠幅、和干重的變化發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高其形態(tài)特征表現(xiàn)呈下降趨勢，說明鹽分通過滲透作用和毒性作用降低植物生長，通過根系的運動降低水力傳導(dǎo)率，從而減少水分，使植物失水嚴(yán)重，干重隨之下降。低濃度鹽脅迫對亞柄薹草形態(tài)特征的影響較小，說明亞柄薹草對低鹽濃度具有一定的適應(yīng)性，隨著鹽濃度的增加亞柄薹草的生長受到明顯的抑制。該結(jié)果與大穗結(jié)縷草(Zoysia macrostachya)[19]在鹽脅迫下水分吸收與運輸能力受限，從而引起葉片水分下降，使植物受害的研究結(jié)果類似。但也有研究表明，低濃度的鹽脅迫對植物生長起促進作用，但與本研究不符，這是因為不同植物間耐鹽性不同[20]。

細胞膜在維持植物細胞的穩(wěn)定和正常新陳代謝活動上發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21]。本研究中，鹽濃度增大使亞柄薹草葉片相對電導(dǎo)率逐漸升高，對植物的傷害加劇，細胞膜受害程度加重，電解質(zhì)外滲率上升，使得亞柄薹草生長受到抑制。有研究表明植物在逆境條件下常常發(fā)生膜脂過氧化并產(chǎn)生MDA，MDA的含量可以反映質(zhì)膜受到的傷害程度[22]。本研究中亞柄薹草MDA 含量隨著鹽濃度增加呈逐漸上升趨勢，表明亞柄薹草體內(nèi)膜脂過氧化受損，而細胞膜脂的損傷，導(dǎo)致細胞內(nèi)可溶性物質(zhì)外滲，破壞了細胞內(nèi)酶及代謝作用區(qū)域，細胞代謝紊亂，使植株出現(xiàn)毒害癥狀，最終抑制亞柄薹草的生長。該結(jié)論與楊佳鑫等[23]在梅花(Prunus mume)和山桃(Prunus davidiana)耐鹽生理特性研究中鹽脅迫對其丙二醛含量影響的結(jié)論一致。

鹽分會限制植物中CO2的固定，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，這是由活性氧(ROS)[如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基]的過度產(chǎn)生和積累介導(dǎo)的[24]，這種反應(yīng)會導(dǎo)致膜脂過氧化、酶抑制和核酸損傷破壞細胞代謝癥狀的出現(xiàn)。為了應(yīng)對活性氧，植物實施了包括酶和非酶抗氧化機制的復(fù)雜防御系統(tǒng)[25]。SOD 和POD 作為抗氧化酶可以有效地清除自由基，保護酶系統(tǒng)，并控制膜脂過氧化，維持機體新陳代謝平衡，從而使植物減輕逆境傷害[26]。在鹽脅迫處理下，亞柄薹草葉片SOD 活性和POD 活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且峰值均出現(xiàn)在100 mmol·L-1，表明亞柄薹草在輕度鹽脅迫下體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活性增強，清除了過多的氧自由基，從而保持活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，使其免受傷害；但 在 鹽 濃 度 為200～300 mmol·L-1時SOD 和POD 活性下降說明在中高鹽脅迫下體內(nèi)代謝紊亂，超過了亞柄薹草自身保護能力，打破了保護酶系統(tǒng)清除能力，使植物受到嚴(yán)重的傷害。該結(jié)果與3 種李屬(Prunus)彩葉植物[27]在鹽脅迫下通過抗氧化酶活性增強來清除過多的自由基，且抗氧化酶活性的變化可以反映植物在鹽脅迫下的受害程度的研究結(jié)果一致。

暴露于鹽脅迫下的植物的常見反應(yīng)有滲透調(diào)節(jié)增加、細胞壁彈性變化、飽和干重比降低和水質(zhì)外體百分比增加等。有毒離子和相容溶質(zhì)的積累和區(qū)隔以增加滲透耐受性是植物耐鹽性的機制之一[28]。氣孔開放的滲透調(diào)節(jié)過程是通過溶質(zhì)的運動發(fā)生的，這些溶質(zhì)被稱為滲透壓細胞，影響細胞間的水分運動[29]。在有機滲透壓細胞中，脯氨酸(Pro)是最重要和最有效的相容溶質(zhì)[30]。除了作為滲透保護劑外，據(jù)報道，Pro 還具有抗氧化特性，它可以作為分子伴侶在脫水過程中保護生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而賦予植物對環(huán)境脅迫的耐受性[31]。在本研究中，亞柄薹草葉片游離脯氨酸含量隨NaCl 濃度的增加呈先增后減的趨勢，且當(dāng)NaCl 濃度大于50 mmol·L-1時脯氨酸大量積累且與對照形成顯著差異，說明隨著鹽濃度的增加，游離脯氨酸通過迅速積累來調(diào)節(jié)植物受到的滲透脅迫，保持細胞滲透平衡，減緩植物受到的傷害。葉片可溶性糖含量，隨NaCl 濃度增加，呈先升后降的趨勢。糖在鹽脅迫下的滲透保護、滲透調(diào)節(jié)、碳儲存和自由基清除中起著核心作用，Ruan[32]報道，鹽脅迫下可溶性糖的增加可能與蔗糖磷酸合酶活性和淀粉磷酸化酶活性降低有關(guān)。可溶性糖含量在低鹽濃度下(50 mmol·L-1)與對照相比變化較小，說明在低鹽濃度下滲透脅迫作用的影響還比較小，然而隨著鹽濃度的升高，可溶性糖含量降低，說明可溶性糖可以減緩因滲透脅迫對植物造成的傷害，但是超過其承受范圍，合成就會受到抑制，含量下降。本研究結(jié)論與北美豆梨(Pyrus calleryana)[33]通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解滲透脅迫對植物造成傷害的研究結(jié)果一致。

植物在光合作用過程中，葉綠素對光能的吸收、傳遞與轉(zhuǎn)化起著至關(guān)重要的作用，其含量的變化會受到環(huán)境中鹽害的影響[34-35]。植物在鹽堿條件下，葉綠素含量會有所下降，但在本研究中，低鹽條件下(50～100 mmol·L-1)葉綠素含量逐漸積累，這可能是由于受到脅迫的植物葉片中每單位葉面積的葉綠體數(shù)量增加所致[8]；在鹽濃度超過200 mmol·L-1時葉綠素含量下降，說明高鹽分加速了亞柄薹草葉綠素的降解，使更多的葉綠素遭到破壞[36]。

多年來，許多研究將耐鹽性閾值視為提高植物耐鹽性的具體目標(biāo)。植物耐鹽性通常通過繪制相對產(chǎn)量作為根區(qū)鹽度的連續(xù)函數(shù)來表示，或者，鹽積累到地上部的動態(tài)過程。這兩種關(guān)系通常由兩個相交的線性區(qū)域表示，這兩個區(qū)域確定了：1)一個特征閾值，在此閾值之后產(chǎn)量開始下降；2)一個特定的斜率，它定義了鹽度增加時產(chǎn)量的下降[37-38]。綜上，雖然NaCl 脅迫下亞柄薹草的生長受到了不同程度的抑制，但以植物的株高、冠幅、干重等指標(biāo)建立回歸方程，可以計算出亞柄薹草的耐鹽閾值[39]。本研究計算發(fā)現(xiàn)，以干重生物量下降50%求出的耐鹽閾值濃度最小，可以作為亞柄薹草耐鹽閾值的確定指標(biāo)，因此初步確定了亞柄薹草的耐鹽閾值為169 mmol·L-1，說明亞柄薹草對鹽脅迫具有一定的耐受性，為今后亞柄薹草耐鹽機制的深入研究提供數(shù)據(jù)支持，并為亞柄薹草野生資源開發(fā)與利用提供理論參考。