Epichlo? 內(nèi)生真菌對禾草種子萌發(fā)影響研究進展

李春杰，郎鳴曉，陳振江，陳泰祥，劉靜，金媛媛，魏學凱

（1. 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，甘肅省西部草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州大學草地微生物研究中心，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2. 中國林業(yè)科學研究院國家林業(yè)和草原局草原研究中心，北京 100091）

禾草內(nèi)生真菌（grass endophyte）是指能在宿主禾草體內(nèi)完成其全部或部分生命周期而宿主本身不表現(xiàn)外部病癥的一類真菌［1］。本研究中出現(xiàn)的內(nèi)生真菌僅指子囊菌門（Ascomycota）麥角菌科（Clavicipitaceae）的Epichlo?屬。Epichlo?屬內(nèi)生真菌與宿主禾草在協(xié)同進化過程中逐步形成互利共生關(guān)系［2-3］，其在宿主抗旱［4-5］、耐鹽［6］、耐寒［7-8］、耐重金屬［9］等非生物脅迫方面及抗蟲［10］、抗病［11］、抗線蟲［12］等生物脅迫方面均發(fā)揮著積極作用。宿主禾草與Epichlo?內(nèi)生真菌共生可促進植物激素和次生代謝物生成，影響其自身生長發(fā)育［13］，并減少家畜采食［14］。此外，禾草內(nèi)生真菌能夠提高宿主在植物群落中的競爭能力［15］，擴大其分布范圍。正是禾草內(nèi)生真菌在自然系統(tǒng)中產(chǎn)生的積極影響，才引起國內(nèi)外學者的廣泛研究（圖1）。

圖1 國內(nèi)外禾草內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀（1977-2021 年）Fig. 1 Current research status of grass endophyte at China and abroad（1977-2021）

種子萌發(fā)（seed germination）是植物生長發(fā)育的第一階段，是有活力的種子從吸水進行呼吸、物質(zhì)合成等生命代謝活動，到種胚突破種皮露出胚根的一個階段［16］。種子萌發(fā)能力與種子自身內(nèi)部生理狀態(tài)及外部環(huán)境因素有關(guān)，只有在其自身具有生命活力且環(huán)境條件適宜時才能正常萌發(fā)［17］。在這一時期，種子對外界環(huán)境適應(yīng)能力最差［18］，其對脅迫的響應(yīng)尤為明顯。種子活力與萌發(fā)成苗關(guān)乎植物進入自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的時間，直接影響農(nóng)作物產(chǎn)量，對經(jīng)濟和生態(tài)發(fā)展具有重要作用［19］。從質(zhì)量來看，種子萌發(fā)質(zhì)量不僅對其自身播種品質(zhì)和環(huán)境適應(yīng)能力等方面有至關(guān)重要的作用，在植物整個生長發(fā)育過程［20］、物種繁殖、種群維持、植被分布和動態(tài)變化方面也具有重要意義。

Epichlo?內(nèi)生真菌在禾草體內(nèi)的傳播方式有無性型垂直傳播和有性型水平傳播［21-22］，且以無性型垂直傳播為主。在共生體形成種子的過程中，真菌菌絲先侵入花序，并與禾草同步生長，菌絲逐漸伸入種子胚胎，進而侵染胚珠、心皮等部位，胚形成后，菌絲逐漸定殖于胚芽鞘原基及葉原基［14，24］。在這期間，菌絲一直存在于禾草種子胚軸及盾片中，直至種子萌發(fā)［23］。種子內(nèi)菌絲密度最高，主要存在于糊粉層［24］。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠促進種子萌發(fā)、提高禾草種子對其伴生植物的化感作用及宿主禾草的建植速率，進而使宿主禾草占據(jù)有利生長空間與競爭優(yōu)勢［25］。種子萌發(fā)需要多種植物激素共同調(diào)節(jié)，其中赤霉素（gibberellin，GA）和生長素（auxin，IAA）在種子萌發(fā)過程中起主要促進作用，已有研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的高羊茅內(nèi)生真菌中可以產(chǎn)生吲哚乙酸［26］。另外，內(nèi)生真菌能夠促進禾草種子在脅迫環(huán)境下萌發(fā)，其原因可能是帶菌禾草在收到脅迫信號時可誘導細胞間隙的真菌做出某種響應(yīng)傳遞給植物，產(chǎn)生的內(nèi)源信號物質(zhì)可誘導植物激素水平提高，進而抵抗外界不利因素［27-29］。

本研究將對不同生境及處理下Epichlo?內(nèi)生真菌在禾草種子萌發(fā)方面的影響進行扼要總結(jié)，為禾草內(nèi)生真菌共生體抗性機制研究，內(nèi)生真菌資源開發(fā)利用和優(yōu)良草地建植、畜牧業(yè)良性發(fā)展提供理論支持。

1 正常萌發(fā)條件

內(nèi)生真菌垂直傳播特性在宿主生長階段發(fā)揮作用，因此共生體種子的萌發(fā)也必將受到內(nèi)生真菌影響［30］。White 等［31］指出，內(nèi)生真菌通過產(chǎn)生生長素和具有相似功能的生物堿，或調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素水平，進而促進植物生長。研究發(fā)現(xiàn)，帶菌（E+）黑麥草（Lolium perenne）和高羊茅（Festuca arundinacea）種子在適宜萌發(fā)條件下其發(fā)芽率比不帶菌（E-）種子高約10%，且種子飽滿度更高［32］。周景樂［33］通過比較不同養(yǎng)分供應(yīng)下E+和E-野大麥（Hordeum brevisubulatum）種子發(fā)芽指標，發(fā)現(xiàn)E+野大麥種子萌發(fā)情況始終優(yōu)于E-種子。但也有研究指出，禾草內(nèi)生真菌對黑麥草［30］和高羊茅［34］種子發(fā)芽率影響不顯著，卻能縮短發(fā)芽所需時間，推測其原因可能是內(nèi)生真菌與宿主種子競爭營養(yǎng)而迫使種子提前發(fā)芽。內(nèi)生真菌對禾本科種子的萌發(fā)影響雖存在差異，但總的來說其對禾草種子萌發(fā)具有積極作用。

2 脅迫

2.1 非生物脅迫

2.1.1 干旱及滲透脅迫 種子萌發(fā)需要充足的水分以活化相關(guān)酶、分解貯藏有機物、完成新陳代謝。近年來，人口增長和社會發(fā)展加劇了溫室氣體排放和全球氣候變化進程，使得農(nóng)田干旱趨勢日益加重［35］。加大灌溉開發(fā)與發(fā)展力度是緩解干旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展所面臨困境的主要措施。然而在我國，農(nóng)業(yè)灌溉用水嚴重不足，長此以往，將會改變禾草形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，導致禾草細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能破壞。內(nèi)生真菌的侵染可增強宿主禾草耐旱性能已被多次證實，其通過增強宿主植物根系、葉片發(fā)育，調(diào)節(jié)宿主葉片氣孔活動及滲透勢以抵抗干旱脅迫［13］。因此，利用內(nèi)生真菌提高禾草自身抗旱性或耐旱性是應(yīng)對干旱脅迫的一項行之有效的手段。

PEG模擬干旱實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能顯著提高鵝觀草（Roegneria kamoji）［36］、醉馬草（Achnatherum inebrians）［37］的發(fā)芽率，且在干旱初期，內(nèi)生真菌通過促進胚芽、胚根生長及提高幼苗含水量，以抵抗外界不利因素，保證種子正常萌發(fā)［36］。另有研究表明，內(nèi)生真菌與黑麥草［30，38］共生除了能夠在干旱水平下提高種子的發(fā)芽率和促進胚根生長，還可以縮短種子發(fā)芽所需時間。然而在高羊茅［39］種子萌發(fā)實驗中，E+種子的耐旱能力低于E-，這可能與內(nèi)生真菌的侵染在種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生自毒物質(zhì)有關(guān)，也可能是在種子萌發(fā)初期，內(nèi)生真菌的生長消耗了種子自身有限的營養(yǎng)物質(zhì)而使E+種子處于劣勢。在許多研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌往往對胚根生長有顯著影響，而對胚芽生長影響較?。?3，40］，可能的原因是內(nèi)生真菌能夠調(diào)節(jié)宿主種子中營養(yǎng)元素分配或激素生成，通過促進植物根系發(fā)育，吸收更多水分來保證宿主種子在干旱脅迫下成活［41］。Epichlo?內(nèi)生真菌對不同共生體組合間影響的差異與共生體基因型、生活史及生存環(huán)境條件相關(guān)。建議通過轉(zhuǎn)錄組學對耐旱常用模式禾草內(nèi)生真菌共生體進行深入分子機制研究，挖掘耐旱相關(guān)基因，為今后禾草內(nèi)生真菌耐旱種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。

2.1.2 酸堿脅迫 酸堿環(huán)境對禾草種子萌發(fā)的影響是建立鹽堿化禾草草地的關(guān)鍵問題之一［6］。土壤酸化會降低土壤緩沖體系的緩沖能力，施用石灰等堿性物質(zhì)是改良土壤酸化的傳統(tǒng)手段，但長期施用會使土壤養(yǎng)分失衡，且在復酸化過程中，土壤會由于堿性物質(zhì)消耗而再度酸化，以至于加劇其酸化程度。土壤理化性質(zhì)對植物自身理化性質(zhì)有關(guān)鍵影響，植物體內(nèi)環(huán)境pH 對其自身生長發(fā)育和細胞內(nèi)多種生理生化代謝起重要作用［42］，且直接影響植物吸收養(yǎng)分和水分的能力。不適宜環(huán)境將會導致植物對營養(yǎng)元素吸收不佳，進而導致植株發(fā)育不良，根系不發(fā)達［43］。有研究發(fā)現(xiàn)Epichlo?內(nèi)生真菌能緩解酸堿脅迫環(huán)境對禾草的影響［44］，因此利用內(nèi)生真菌提高禾草宿主的酸堿耐性成為一種理想禾草育種手段。

彭清青等［44］發(fā)現(xiàn)，在偏中性（pH 6～11）及酸性（pH 4～5）環(huán)境中，E+醉馬草、中華羊茅（Festuca sinensis）和野大麥種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率總體上均大于E-，且在酸堿環(huán)境下E+種子異狀發(fā)芽率小于E-。對不同pH 磚紅壤浸提液處理的多年生黑麥草種子進行萌發(fā)實驗，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)隨著酸脅迫的增強，E+種子各項萌發(fā)指標均高于相應(yīng)的E-種子，說明內(nèi)生真菌能促進多年生黑麥草在酸脅迫環(huán)境中的萌發(fā)，同時擴大種子對酸脅迫的耐受范圍，增強其對酸脅迫的抵抗力［45］。關(guān)于堿脅迫，萬志文［46］發(fā)現(xiàn)，E+醉馬草幼苗的株高、根長在一定范圍內(nèi)均隨pH 升高而增加，且醉馬草內(nèi)生真菌共生體對強堿的耐受性大于強酸。分析這些結(jié)果可以得出，內(nèi)生真菌能夠擴展宿主對酸堿環(huán)境適應(yīng)性的范圍，進而提高其生存的競爭優(yōu)勢。而對于烈性毒草醉馬草而言，寬泛的酸堿適應(yīng)性是其侵害北方退化草地的原因之一［44］。因此，找到一種有效防除醉馬草-內(nèi)生真菌共生體的方法是草地生態(tài)修復行之有效的手段。過高的pH 環(huán)境通過抑制根系發(fā)育和ATP 合成進而影響植物生長［46］。先前的研究證明內(nèi)生真菌能夠促進胚根發(fā)育，增強根系活力［47］，內(nèi)生真菌的增益作用是否體現(xiàn)在萌發(fā)期緩減胚根的酸堿毒害有待進一步研究。

2.1.3 鹽脅迫 土壤鹽漬化造成的資源和環(huán)境生態(tài)問題是全世界面臨的一大挑戰(zhàn)，據(jù)報道，全球接近20%的耕地和50%的灌溉地受鹽分影響［48］。土壤中過量鹽離子會抑制種子萌發(fā)［49］，對植物造成離子毒害、滲透脅迫和氧化脅迫［50］。鹽漬化土壤的改良主要有工程、化學、物理、生物4 種措施，其中生物措施最為環(huán)保健康，尤以耐鹽植物對土壤改良最為理想科學［50］。許多研究表明［6，51］，Epichlo?內(nèi)生真菌能提高多種禾草耐鹽性，因此，利用內(nèi)生真菌進行耐鹽禾草的研究與育種成為許多科學家的研究重點。

種子在萌發(fā)時對鹽表現(xiàn)敏感。有學者通過比較E+與E-種子萌發(fā)指標，發(fā)現(xiàn)德蘭臭草（Melica transsilvanica）［51］、醉馬草［52］、中華羊茅［53］和野大麥［6］E+種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率均高于E-，特別在300 和400 mmol·L-1NaCl 濃度下，E+野大麥種子發(fā)芽率顯著高于E-，同時，內(nèi)生真菌能促進宿主在高鹽環(huán)境中胚芽和胚根的生長。另外，鹽脅迫抑制了黑麥草［54］、中華羊茅［53］種子發(fā)芽率，但E+種子發(fā)芽率下降趨勢更緩，且低鹽環(huán)境對E+種子萌發(fā)抑制不顯著［54］。內(nèi)生真菌提高禾草耐鹽機理研究已取得一定進展，其中光合能力、氮代謝、氮利用、葉片相對含水量、可溶性糖、脯氨酸含量、過氧化物酶活性及離子比率均參與到禾草植株耐鹽活動中［51-55］，但關(guān)于內(nèi)生真菌對禾草種子耐鹽萌發(fā)機理影響的研究較少，種子生理狀態(tài)不同于植株，內(nèi)生真菌對種子耐鹽機理是否與其產(chǎn)生生物堿或刺激宿主自身合成生物堿及其他次生代謝物有關(guān)，是否通過形態(tài)和生理兩方面進行調(diào)控有待進一步研究。

2.1.4 重金屬脅迫 隨著現(xiàn)代社會發(fā)展，尾氣排放，農(nóng)藥、化肥［9］的大量使用，導致重金屬污染問題日益嚴峻。重金屬離子的排放嚴重破壞了土壤和水質(zhì)，當土壤中重金屬含量大于植物對其自凈能力時，則會表現(xiàn)出毒害癥狀，這對植物的生長發(fā)育與代謝活動造成嚴重的影響，并通過食物鏈進入人體，對人類健康構(gòu)成威脅［56-57］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠提高宿主禾草對某些重金屬的耐受性，因此利用禾草-內(nèi)生真菌共生體進行土壤重金屬修復是生態(tài)修復的理想手段。

Epichlo?內(nèi)生真菌能在適宜重金屬濃度下增加宿主禾草對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而促進植物生長［56］，并在一定范圍內(nèi)對過量重金屬如銅（Cu）、鋅（Zn）、鋁（Al）、鉛（Pb）等造成的植物體內(nèi)水平衡紊亂、細胞膜透性降低、細胞損傷，胚乳蛋白破壞起到緩解作用［57-58］，進而緩減重金屬脅迫對帶菌禾草種子的萌發(fā)抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，E+醉馬草種子在錳（Mn2+）脅迫處理下，其發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)均顯著大于E-種子［57］。在Pb［58］、鎘（Cd）［59］脅迫下，E+德蘭臭草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)均顯著高于E-，特別是在Pb 濃度大于800 mg·L-1時，內(nèi)生真菌能夠降低德蘭臭草幼苗中Pb 含量。植物在低濃度重金屬脅迫中，通過排斥、固定、抗氧化酶、絡(luò)合等方式以達到解毒的目的，同時，重金屬離子能夠通過刺激金屬硫蛋白和植物螯合態(tài)合成而促進脅迫蛋白的積累。然而，當重金屬濃度超過一定閾值時，植物中蛋白酶和淀粉酶受到抑制而影響植物正常生理代謝［58］。有報道稱，內(nèi)生真菌緩解重金屬離子毒害的機制可能與其產(chǎn)生的酚類物質(zhì)與重金屬螯合而使重金屬活性降低有關(guān)［58］，而內(nèi)生真菌的侵染是否參與及如何調(diào)節(jié)植物脅迫蛋白合成、調(diào)控重金屬在宿主種子中的分配；內(nèi)生真菌是否通過影響種子內(nèi)部生理變化拓寬宿主植物對重金屬脅迫耐受范圍還需進一步探究。

2.1.5 溫度脅迫 溫度在種子萌發(fā)階段起關(guān)鍵作用，種子的正常萌發(fā)和出苗均與溫度息息相關(guān)［60］。種子通過萌發(fā)時對環(huán)境溫度變化的感知以檢測植被冠層和土壤埋藏深度是否適合后續(xù)植物生長［61］。當前，全球氣候變化及過度放牧，使得天然草地的生長受到威脅，因此，研究如何提高不同生境下禾草種子萌發(fā)適應(yīng)性對草地修復及草種擴繁具有重要意義。

Epichlo?內(nèi)生真菌可提高野大麥在高溫（30 ℃）和低溫（10 ℃）脅迫下種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，而在極限高溫（35 ℃）和低溫（5 ℃）下，內(nèi)生真菌并不能促進種子萌發(fā)［41］，可能的解釋是極限溫度抑制了種子自身的萌發(fā)或內(nèi)生真菌在該溫度下失活甚至死亡，內(nèi)生真菌的侵染能夠使宿主種子有更低的基點溫度和更高的上限溫度。有學者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠促進中華羊茅［62］、醉馬草［63］種子在不同低溫脅迫下種子的萌發(fā)及胚根、胚芽生長。通過進一步探究E+、E-種子萌發(fā)中的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)這些基因與生物堿合成、脂肪酸代謝等途徑有關(guān)。生物堿是內(nèi)生真菌提高禾草抗逆性能的重要物質(zhì)，而不飽和脂肪酸含量的增加能夠使膜脂相變溫度降低，進而保證低溫脅迫下的膜流動性，此兩者均可能是內(nèi)生真菌提高宿主在低溫脅迫下萌發(fā)的重要機制。通過代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)E+醉馬草種子中逆境防御蛋白、脅迫應(yīng)激蛋白和一些參與代謝途徑的相關(guān)酶大量表達［63］。說明內(nèi)生真菌除了能夠激活宿主種子自身防御應(yīng)激反應(yīng)外，還能加速能量代謝與消耗，以抵消低溫脅迫對種子萌發(fā)帶來的負面效應(yīng)。E+種子高發(fā)芽率和發(fā)芽速度能夠提高禾草建植速度，使禾草占據(jù)有利的生長空間和競爭優(yōu)勢，這對干旱、寒冷及熱帶地區(qū)草地建植有積極影響。因此，禾草-內(nèi)生真菌共生體耐寒耐熱功能基因的挖掘、分子機理的探究與驗證及生理生化機制將對未來禾草育種具有重要意義。

2.2 生物脅迫

在自然環(huán)境中，植物的萌發(fā)生長過程不可避免地受到細菌、真菌、病毒和害蟲等生物侵害，提高宿主植物耐受生物脅迫的方法成為各國科學家的研究熱點。內(nèi)生真菌通過產(chǎn)生麥角生物堿（ergot alkoloids，ergonovine 和ergine 為代表）、吲哚雙萜類（indolditerpene，lolitrem B 為代表）、吡咯并吡嗪類（pyrrolopyrazine，peramine 為代表）及飽和吡咯類化合物（pyrrolizidine，loline 為代表）4 大類生物堿［64-65］，對禾谷縊管蚜（Rhopalosiphum padi）、朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）［4］、亞洲小車蝗（Oedaleus decorus）和針毛收獲蟻（Messor aciculatus）［10］等昆蟲產(chǎn)生毒性，或是降低禾草的適口性，進而提高宿主禾草對昆蟲的抗性［66］。然而，由于昆蟲主要采食禾草植株，其對禾草種子萌發(fā)階段的負面效應(yīng)尚不明確，關(guān)于帶菌禾草的萌發(fā)質(zhì)量對后續(xù)植物生長及產(chǎn)生生物堿致毒劑量等抗蟲機理有待進一步研究驗證。

Li 等［67］發(fā)現(xiàn)在多年生老芒麥（Elymus sibiricus）種子萌發(fā)階段，Epichlo?內(nèi)生真菌能夠提高宿主對細交鏈孢（Alternaria alternata）、小 孢 殼 二 孢（Ascochyta leptospora）、離 蠕 孢（Bipolaris sorokinianum）及 燕 麥 鐮 孢（Fusarium avenaceum）的抗性，同時，帶菌醉馬草幼苗對離蠕孢、新月彎孢（Curvularia lunata）、銳頂鐮孢（Fusarium acuminatum）和細交鏈孢有不同程度的抑制。該結(jié)論與張永雯［55］的研究結(jié)果一致，即在接種細交鏈孢菌、密實鏈格孢菌（Alteruaria compacta）、半裸鐮刀菌（Fusarium incarnatum）等13 種種帶病原真菌后，E+野大麥種子萌發(fā)的各項指標均大于E-種子。種帶病原真菌通過釋放某些代謝產(chǎn)物或有毒物質(zhì)來降低一些酶的活性，抑制某些氨基酸的合成，進而對種子萌發(fā)造成影響。蛋白組學分析表明，內(nèi)生真菌侵染的宿主中，三萜類物質(zhì)蛋白表達量明顯提高，三萜類物質(zhì)作為植物中的一種次生代謝產(chǎn)物，其在植物抗病抗蟲方面具有重要作用［63，68］。內(nèi)生真菌與植物的共生可增強宿主對病原菌的抗性，除了保護性生物堿的作用外，也與內(nèi)生真菌在植物組織上形成菌絲網(wǎng)而造成對病原菌的“生態(tài)位排斥”有關(guān)。另外，有研究指出內(nèi)生真菌作為一種外源生物因素，在與植物共生過程中可能被識別為病原真菌而提前誘發(fā)出植物的防御反應(yīng)［67，69］，因此在病原真菌入侵時，帶菌植物已經(jīng)適應(yīng)或已具備較為成熟的防御體系。這些研究結(jié)果說明內(nèi)生真菌提高種子在生物脅迫下的萌發(fā)能力，不僅與其誘導植物產(chǎn)生相關(guān)防御反應(yīng)及代謝產(chǎn)物有關(guān)，還可能與內(nèi)生真菌自身菌絲的定殖與生長有關(guān)。而關(guān)于內(nèi)生真菌在禾草種子萌發(fā)及成苗階段對病原菌侵入、擴展以及共生體拮抗物質(zhì)生成的調(diào)控等抗病機理還需進一步探究。

綜上所述，在不同脅迫處理下，內(nèi)生真菌對宿主種子萌發(fā)各項指標均產(chǎn)生積極影響，說明內(nèi)生真菌可提高宿主植物在萌發(fā)階段非生物和生物脅迫抗性。但同時也存在內(nèi)生真菌對宿主種子萌發(fā)有抑制作用和無顯著影響的研究結(jié)果，其原因可能是內(nèi)生真菌參與宿主禾草的抗性機制與植物基因型、內(nèi)生真菌基因型、共生體適應(yīng)性及生長環(huán)境密切相關(guān)。帶菌種子在脅迫下萌發(fā)能力更強可能是由于其作為一種生物異源物質(zhì)，在宿主內(nèi)部形成長期脅迫，因此植物提前適應(yīng)或提高了對外界環(huán)境的敏感度［70］。

表1 內(nèi)生真菌對宿主在不同脅迫下種子萌發(fā)影響Table 1 Effects of grass endophyte on seed germination of hosts under different stresses

3 化感作用

化感作用（allelopathy）是指植物向其周圍環(huán)境釋放的某些化學物質(zhì)對周圍植物或微生物造成有利或不利影響的作用［72-74］。植物間的化感作用在種子萌發(fā)、幼苗存活、植物物種分布和種群結(jié)構(gòu)及演替方面都發(fā)揮著作用［73］。同時，其與植物種類、生育期、生長部位、生態(tài)型、內(nèi)生真菌侵染及化感物質(zhì)濃度等有關(guān)［75］。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌通過提高宿主植物的化感作用，進而提高宿主在種間及種內(nèi)的競爭優(yōu)勢，以獲取更多的營養(yǎng)和生長空間［75］。有些化感作用在種子萌發(fā)、幼苗存活、植物物種分布及種群結(jié)構(gòu)和演替方面也發(fā)揮著積極作用［74］。草粉法［75］和浸提液法［76］是研究植物通過化感作用對其他植物種子萌發(fā)產(chǎn)生影響的常用方法，除此以外發(fā)酵液法和揮發(fā)油法也逐漸應(yīng)用于化感作用的研究（表2）。

表2 內(nèi)生真菌引起的不同化感作用對禾草種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different allelopathy caused by grass endophyte on germination of grass seeds

3.1 草粉及浸提液

研究者通過將E+羊草（Leymus chinensis）制作成草粉并配制成一定濃度的稀釋液，探究克氏針茅（Stipa krylovii）種子在不同濃度草粉液下種子萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)相比于E-羊草草粉浸提液，E+羊草草粉浸提液整體上呈現(xiàn)出低濃度促進，高濃度抑制的效應(yīng)［76］。楊松等［75］通過濾紙萌發(fā)試驗表明，與E-相比，E+披堿草草粉浸提液能夠抑制高羊茅、黑麥草、草地早熟禾（Poa pratensis）種子的發(fā)芽率及高羊茅種子的發(fā)芽速度；E+醉馬草草粉浸提液可降低多年生黑麥草和草地早熟禾的發(fā)芽率，卻可提高高羊茅種子的發(fā)芽率［77］，但無論帶菌與否，草粉液處理均會抑制此三者的萌發(fā)。然而，這些結(jié)果與盆栽試驗結(jié)果并不一致。通過將采集自6 個不同地理種群中華羊茅制作成的草粉浸提液處理黑麥草種子，發(fā)現(xiàn)不同地理種群及帶菌與否對黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)影響有所不同，且不同受體種子對同一地理種群的中華羊茅效應(yīng)也不同，但總體上表現(xiàn)為抑制趨勢［78］?？梢姡滩輧?nèi)生真菌共生體對不同禾草的化感作用存在差異，這種差異不僅與不同種禾草及內(nèi)生真菌基因型有關(guān)，還可能與草粉濃度、草粉采集部位、采集生育期等因素有關(guān)。內(nèi)生真菌與植物共生能在宿主植物中產(chǎn)生多種化感物質(zhì)，這些化感物質(zhì)通過調(diào)節(jié)植物自身離子平衡、水勢和呼吸等機制以調(diào)節(jié)植物生理生化過程［76］。

3.2 發(fā)酵液

通過將黑麥草種子浸泡于分離自醉馬草的甘肅內(nèi)生真菌（Epichlo? gansuensis）、分離自披堿草的內(nèi)生真菌（E. bromicola）和分離自中華羊茅的中國內(nèi)生真菌（E. sinensis）制成的發(fā)酵液并附加干旱處理，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵液浸種后的黑麥草種子無論是否處于干旱脅迫下，其發(fā)芽率均可顯著提高，而對于發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，不同內(nèi)生真菌發(fā)酵液在不同干旱處理下對黑麥草種子萌發(fā)的效應(yīng)不一致［79］。另外，內(nèi)生真菌發(fā)酵液的濃度對其化感效應(yīng)影響極大［80-81］。中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對中華羊茅種子的萌發(fā)有不同的促進和抑制作用，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢在40 倍發(fā)酵液稀釋下能顯著提高，而在其他濃度下均表現(xiàn)為抑制作用［81］。關(guān)于內(nèi)生真菌發(fā)酵液對禾草種子萌發(fā)影響研究較多，但僅有少量針對Epichlo?屬。內(nèi)生真菌純培養(yǎng)能產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，通過優(yōu)良菌株的篩選和微生物發(fā)酵［65］，或許能夠為生防資源研究提供新的思路。另外，內(nèi)生真菌發(fā)酵液是否在多種附加處理下發(fā)揮作用尚不明確。已有的研究表明Epichlo?內(nèi)生真菌發(fā)酵液倍數(shù)及種類影響其化感作用，這為禾草內(nèi)生真菌發(fā)酵液的開發(fā)利用提供實踐基礎(chǔ)。

3.3 揮發(fā)油

揮發(fā)油作為一種新的化感作用研究材料，通過將草粉在水蒸氣蒸餾裝置中蒸餾得到揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)萃取、干燥得到粗提物。通過將E+、E-醉馬草揮發(fā)油粗提物作用于黑麥草種子，發(fā)現(xiàn)相較于E-，E+醉馬草揮發(fā)油粗提物對黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著的抑制作用，即內(nèi)生真菌增強了醉馬草揮發(fā)油的化感抑制作用，同時隨著揮發(fā)油濃度的增加，對黑麥草萌發(fā)指標的抑制作用也隨之增加，且其幼苗生長差異也越來越大［82］。關(guān)于內(nèi)生真菌揮發(fā)油的作用在多科、屬植物上均有研究，這為我們研究禾草-內(nèi)生真菌共生體對禾本科植物的化感作用機理以及利用優(yōu)良禾草-內(nèi)生真菌共生體對其他科屬植物進行生長調(diào)節(jié)研究提供了一個新的思路。

3.4 伴生

同一群落中，各植物間對生態(tài)資源的競爭不可避免，故一種群落中某種植物的生長勢必會對其伴生種產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，帶菌醉馬草除自毒性以外，釋放的化感物質(zhì)對其伴生種也有影響。黃璽等［83］研究表明，帶菌醉馬草可抑制其常見伴生種針茅（Stipa capillata）及硬質(zhì)早熟禾（Poa sphondylodes）種子萌發(fā)和幼苗生長。內(nèi)生真菌的存在能夠提高醉馬草對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，在促進自身生長的同時抑制其競爭者，從而表現(xiàn)出強的競爭力［40］。內(nèi)生真菌侵染可增強禾草本身對其伴生植物的化感抑制作用，通過對禾草內(nèi)生真菌共生體及其伴生植物資源調(diào)查，根據(jù)其生活史及生態(tài)位定義種群之間資源利用的相似與競爭等關(guān)系，進而判斷在生態(tài)系統(tǒng)中種群及群落的演化方向，并對其可能出現(xiàn)的問題進行有針對性的研究。

異株相克，即一種生物釋放出對另一種生物有抑制或促進作用的物質(zhì)［84］，是植物間化感作用基本原理，植物生長環(huán)境受到競爭、壓力及干擾的綜合影響，其中，競爭在決定群落性質(zhì)方面扮演重要角色［85］。植物的競爭策略多樣，種間差異、幼苗出土時間、空間分布、相鄰植物體型、競爭期時間、生物因素、地上地下競爭、土壤養(yǎng)分、水分等，其中生物因素包括真菌和食草動物的作用是影響競爭的重要因子［83］，內(nèi)生真菌侵染能有效增強宿主植物的化感作用。然而，化感作用的方向、強度與內(nèi)生真菌、宿主及受體植物基因型、二者生存環(huán)境以及化感物質(zhì)的濃度和形式有關(guān)。植物自身含有萜類、黃酮、酚和酯等活性成分，這些成分在植物與其他物種競爭方面可能發(fā)揮著積極作用。然而，先前的研究結(jié)論得出的帶菌植物對受體禾草種子萌發(fā)表現(xiàn)出“低濃度促進，高濃度抑制”的作用規(guī)律，這些作用的改變可能是由于內(nèi)生真菌在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的生物堿、多酚類物質(zhì)、有機酸、脂肪族類和醌類等活性物質(zhì)參與到了植物的化感作用當中［82］，進而調(diào)節(jié)或改變了宿主植物在植物各方面競爭當中的表現(xiàn)。

4 其他

4.1 CO2濃度

隨著現(xiàn)代社會對化石燃料的大量消耗及對土地的不合理開發(fā)，大氣中CO2濃度逐年升高，CO2是植物光合作用的原料，其濃度增加能夠在一定程度上促進植物生長發(fā)育及增加干物質(zhì)積累［86］，而對于其在種子萌發(fā)過程中的作 用 報 道 存 在 差 異［87］。陳 薇 等［34］和 師 志 冰 等［87］分 別 通 過CO2和 內(nèi) 生 真 菌 在 高 羊 茅 和 羽 茅（Achnatherum sibiricum）種子上的交互作用試驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌在羽茅種子發(fā)芽以及高羊茅幼苗長和幼根長的增益作用在高濃度CO2條件下更為顯著；總的來說，CO2濃度的增加加大了E+和E-種子之間的生長差異［34］。CO2主要通過增加植物光合作用提高對內(nèi)生真菌的光合供給，進而對禾草-內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)生影響，因此內(nèi)生真菌與CO2互作的增益效應(yīng)在萌發(fā)后才可能顯現(xiàn)出來。通過分析CO2濃度對禾草-內(nèi)生真菌共生體萌發(fā)的影響，有助于通過種子萌發(fā)情況預測全球氣候變化，同時，也能夠預測在全球氣候變化中禾草-內(nèi)生真菌共生體的競爭能力甚至是種群分布與優(yōu)勢物種［87］。因此，探究內(nèi)生真菌與CO2互作機理及綜合反應(yīng)機制對將來禾草內(nèi)生真菌共生體育種也有積極意義。

4.2 保存時間

內(nèi)生真菌在種子中的活力變化受到種子儲藏時間、溫度及濕度的影響，隨著種子儲藏年限的加長，內(nèi)生真菌在種子中的活力隨之降低，當內(nèi)生真菌完全喪失活力時，種子萌發(fā)將不再受到內(nèi)生真菌的影響［88］。金文進等［89］研究發(fā)現(xiàn)，在同等貯藏年限下，E+中華羊茅種子的發(fā)芽指標與苗長、根長整體上顯著優(yōu)于E-，而對于過長的保存年限，內(nèi)生真菌的增益效應(yīng)并未體現(xiàn)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在具有更高發(fā)芽率的草甸羊茅（Festuca pratensis）種子中，內(nèi)生真菌活力也更高［90］。有研究對不同保存年限下醉馬草種子進行萌發(fā)試驗，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的侵染能緩解貯存年限對種子萌發(fā)的負效應(yīng)。醉馬草種子在貯藏1～2 年后，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長及苗長均顯著降低，但E+種子萌發(fā)力始終強于E-。通過對其活力指標測定，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可能通過在宿主植物種子中的代謝活動，緩解質(zhì)膜受損程度，提高種子脫氫酶和酸性磷酸酯酶活性，以延緩種子自然衰老進程［88］。內(nèi)生真菌與宿主植物共生，二者共同消耗種子中的營養(yǎng)物質(zhì)，隨著貯藏年限的增加，內(nèi)生真菌獲得的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，進而失去活力。因此可以得出結(jié)論，內(nèi)生真菌對種子的增益效應(yīng)是有限的。農(nóng)事作業(yè)中，種子的貯藏不可避免，探究關(guān)于內(nèi)生真菌在宿主種子中代謝活動的生理生化機制，并有針對性地進行育種工作，或許對今后農(nóng)事生產(chǎn)具有重要價值。

5 展望

我國幅員遼闊，禾草種質(zhì)資源豐富，有超過225 個屬的禾本科植物，目前，已在早熟禾屬、羊茅屬、披堿草屬等70 多種禾草中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌共生［14］。近年來，隨著我國居民生活水平的提高及對環(huán)境綠化的重視，草坪業(yè)發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍擴大，逐漸發(fā)展為人類生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一［91］。隨著對內(nèi)生真菌與宿主禾草共生關(guān)系及互作響應(yīng)研究的加深，內(nèi)生真菌對宿主禾草在生長發(fā)育及抗性生理上的增益作用日益體現(xiàn)，內(nèi)生真菌對種子萌發(fā)的影響也越來越受到廣大研究者的關(guān)注。有研究表明，與石南科植物共生的內(nèi)生真菌可以通過菌絲侵入破壁進而促進種子萌發(fā)［92］，能否以此為參考，發(fā)掘出促進禾草種子萌發(fā)的內(nèi)生真菌，研究其多樣性、專一性、共生及對環(huán)境脅迫的抗性萌發(fā)機制，對利用內(nèi)生真菌開展禾草植物種質(zhì)創(chuàng)新、物種保護及繁育研究等有重大意義。

種子萌發(fā)在禾草農(nóng)業(yè)發(fā)展中扮演重要角色，通過了解種子萌發(fā)特征才能進一步對植物進行深入的研究與開發(fā)。種子萌發(fā)需要適宜的水分、溫度等環(huán)境因素，這些環(huán)境因素協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。然而近年來，全球環(huán)境逐漸惡化，生物賴以生存的自然環(huán)境資源面臨各種威脅，其中以鹽脅迫和重金屬脅迫問題最為突出，我國鹽漬土面積約1×108hm2，其分布范圍廣，類型多［93］，同時每年因重金屬污染造成的直接經(jīng)濟損失高達200 多億元［94］，因此，提高禾草種子在不同環(huán)境脅迫下的萌發(fā)率是草地禾草建植的關(guān)鍵問題之一，也是禾草能否在脅迫環(huán)境中生存的基礎(chǔ)。內(nèi)生真菌與禾草共生能促進禾草種子在脅迫環(huán)境下萌發(fā)，對于如何提高禾草種子在不良條件下的萌發(fā)指標，除了改良利用現(xiàn)有土地和其他環(huán)境資源以及采用對應(yīng)的工程措施外，利用內(nèi)生真菌資源對禾草種子進行種質(zhì)創(chuàng)新，通過分子生物學、生理生化機制以及基因改良手段，深入研究在脅迫環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子和基因在不同時空條件的選擇性表達，從根本上探究內(nèi)生真菌提高禾草萌發(fā)抗性能力，以達到有效利用內(nèi)生真菌資源和改善脅迫環(huán)境的目的。

種子休眠（seed dormancy）是指有生活力的種子在適宜萌發(fā)環(huán)境下不能萌發(fā)的現(xiàn)象［95］。就植物而言，種子休眠能夠使其規(guī)避地震、沙塵暴等自然災害及抵御旱澇、冷熱等特殊氣候情況，以保證物種延續(xù)，是植物生態(tài)適應(yīng)的特征，但這卻阻礙了禾草育種的發(fā)展，其對野生物種的人工繁育阻礙尤為明顯。種子休眠是由遺傳和環(huán)境共同影響，國際社會在破除禾草種子休眠研究方面有一定基礎(chǔ)，但種子的萌發(fā)與休眠是一個復雜的生理過程。通過研究禾草種子解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，種子附屬物，如稃和種皮是影響種子萌發(fā)的重要因素，其可能對胚根胚芽的伸長產(chǎn)生機械阻礙，抑制水分和氣體交換，阻礙種子內(nèi)部抑制物的外漏或調(diào)整種子對光的響應(yīng)［95］，在石南科植物種子中發(fā)現(xiàn)，帶內(nèi)生真菌的種子菌絲能夠突破外種皮，侵入到種皮與胚之間，胚徑向伸長，根分化且被菌絲覆蓋，在胚胎發(fā)育成熟期，菌絲進入細胞表皮外切向壁以進行營養(yǎng)交換，而未與內(nèi)生真菌共生的種子其種皮厚且存在包被［92］。內(nèi)生真菌菌絲在禾草種子中較多分布于內(nèi)表皮，其在種子萌發(fā)進程中除了起到促進植物激素產(chǎn)生的作用，在突破種皮和通過菌絲吸收營養(yǎng)物質(zhì)方面是否發(fā)揮作用還需進一步研究。內(nèi)生真菌共生能夠提高宿主的化感作用，但作用效果與方向和植物種類、化感物質(zhì)濃度有關(guān)，研究作物及牧草不同品種間的化感作用，進一步研究化感作用在種間差異機制，通過選育合適的禾草-內(nèi)生真菌共生體作為綠肥作物或覆蓋作物，以在草坪或農(nóng)田中抑制雜草種子萌發(fā)、防治雜草危害和促進優(yōu)質(zhì)草坪建植。

內(nèi)生真菌對禾草種子在不同生境下萌發(fā)影響的分子機理是今后研究的方向之一。結(jié)合傳統(tǒng)育種方法和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，明確內(nèi)生真菌對宿主禾草萌發(fā)有利影響的生理生化機制，充分利用禾草內(nèi)生真菌對特定宿主的優(yōu)良特性，對禾草進行定向改良［96］，建立針對不同生境及需求的禾草內(nèi)生真菌共生體種質(zhì)資源庫，對內(nèi)生真菌在禾草育種作用方面有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌基因組中存在能夠使家畜中毒的基因［97］，這為利用內(nèi)生真菌進行牧草育種帶來新的挑戰(zhàn)，內(nèi)生真菌對禾草種子萌發(fā)的影響不應(yīng)僅關(guān)注于良好萌發(fā)指標這一淺層研究，通過對內(nèi)生真菌在禾草種子中的分布及其基因組中產(chǎn)堿基因、抗性基因和共生基因特征及表達的研究，分析其在禾草種子萌發(fā)過程中發(fā)揮的作用、萌發(fā)后對環(huán)境適應(yīng)性及對采食者甚至人類的潛在危險進行風險評估，以期得到有利于動物健康及生態(tài)建設(shè)的目標共生體?，F(xiàn)有的內(nèi)生真菌對宿主禾草種子萌發(fā)影響多為脅迫環(huán)境下生理響應(yīng)、生長指標及生態(tài)位競爭等宏觀方面，而對造成這些差異的分子機理分析還存在欠缺，因此，針對微觀機理的研究具有較大潛力。目前，隨著內(nèi)生真菌共生對不同科種子萌發(fā)影響及內(nèi)生真菌對宿主植物抗性影響的分子機制研究的不斷深入，為選育具有優(yōu)良特性的禾草種質(zhì)提供了更多啟示。因此，應(yīng)結(jié)合宏觀生理指標與微觀分子機制針對禾草植株的需求特性、物種特異性和內(nèi)生真菌功能基因多樣性，分別選育出滿足不同需求的禾草內(nèi)生真菌共生體，以將內(nèi)生真菌資源充分利用。