陳德奎，吳碩，鄒璇，周瑋，陳曉陽，張慶

（廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

氧化應(yīng)激是機(jī)體遭受外界刺激導(dǎo)致代謝失衡，自由基產(chǎn)生效率提高而引起的自由基動態(tài)失衡，是造成機(jī)體細(xì)胞和組織損傷的一種不良反應(yīng)［1］。早期的研究表明，在動物的日常飼糧中添加外源的抗氧化劑能夠有效降低氧化應(yīng)激給動物帶來的傷害［2-4］。同時，在動物生產(chǎn)中，抗生素殘留和細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)問題日益突出，天然植物添加劑的探索成為研究熱點(diǎn)［5］。此外，天然植物添加劑的替代喂養(yǎng)方案能夠提高動物的生長性能，對動物的生長具有積極作用，能夠改善動物腸道的抗氧化性能，提高動物免疫能力，減輕動物對外部的應(yīng)激［4，6］。

香椿（Toona sinensis）自古以來便具有藥用和食用價值［7］。香椿葉中具有豐富的蛋白質(zhì)（16.25%～17.78%）、維生素并富含萜類、皂苷和生物堿，具有抗菌、消炎和消除自由基抗氧化的功能［8］。用成熟的香椿葉飼喂肉羊，其營養(yǎng)價值與優(yōu)質(zhì)苜蓿（Medicago sativa）相近，并能改善動物腸道健康狀況，減少腹瀉的發(fā)生［9］。此外，黃酮類物質(zhì)是香椿葉重要的成分之一［10］。在動物生產(chǎn)中，黃酮類物質(zhì)能夠有效降低動物的氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)動物腸道黏膜形態(tài)和細(xì)菌微生態(tài)環(huán)境，控制胃酸的產(chǎn)生量以治愈胃潰瘍并降低血液中膽固醇和血糖含量，促進(jìn)血液循環(huán)［10-11］。然而，由于香椿的收獲是季節(jié)性的，保存成為香椿葉跨季度飼喂的一個難題。青貯是木本飼料保存的一種常用方式，對香椿葉進(jìn)行青貯能克服香椿葉全年供應(yīng)不均的缺點(diǎn)。

鄰苯二酚（catechol，1，2-dihydroxybenzene，C）又稱兒茶酚，是青貯過程中植物酚經(jīng)微生物代謝的次級產(chǎn)物，具有抑菌性和抗氧化性［12-13］。在青貯中添加鄰苯二酚有助于抑制青貯過程中的不良微生物的生長并提高青貯的抗氧化性。此外，香椿葉的研究主要集中在其主要活性成分黃酮類物質(zhì)方面，關(guān)于香椿葉青貯研究報道較少［14］。因此，本試驗(yàn)旨在研究鄰苯二酚對香椿葉青貯發(fā)酵品質(zhì)、蛋白質(zhì)組分和抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

紅香椿葉（redT. sinensisleaf，RTSL）和綠香椿葉（greenT. sinensisleaf，GTSL）的鮮樣（fresh matter，F(xiàn)M）于2020 年9 月采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北香椿種源試驗(yàn)林，為一年生處于同一生長時期的廣東清遠(yuǎn)種源香椿。鄰苯二酚（分析純）購自上海麥克林生化有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

將新鮮的RTSL 和GTSL 在潔凈的工作臺上用鍘刀切割成1～2 cm 片段，并充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?。分別在RTSL 和GTSL 中取3 份600 g 原料，其中兩份分別添加0.5%鄰苯二酚（0.5%C）和1.0%鄰苯二酚（1.0%C），以不添加鄰苯二酚為對照組（CK），并攪拌均勻。然后，將處理后的原料均勻分裝到聚乙烯密封袋（20 cm×30 cm）中，每袋大概100 g，共6 個處理，每個處理6 個重復(fù)，共36 袋。隨后，用真空密封機(jī)將密封袋中的空氣抽出并密封放置在室內(nèi)保存（27～30 ℃）。在青貯第15 天和第30 天開袋取樣分析青貯發(fā)酵品質(zhì)、化學(xué)成分和抗氧化性。

1.3 青貯品質(zhì)和微生物數(shù)量分析

1.3.1 發(fā)酵品質(zhì)測定（pH、有機(jī)酸、氨態(tài)氮） 隨機(jī)取10 g 青貯樣，與90 mL 經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min 的無菌蒸餾水充分混合均勻，在-4 ℃浸潤24 h。然后，用中速定性濾紙過濾，取濾液。用pH 計（PHS-3C，上海雷磁）測定濾液的pH 值。部分濾液在-20 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)氨態(tài)氮（NH3-N）和有機(jī)酸的測定。按照王成等［15］的試驗(yàn)方法，用苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N 含量，使用高效液相色譜儀（LCMS-8050，SHIMADZU，日本）測定有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丁酸）含量。

1.3.2 微生物數(shù)量測定 另取10 g 青貯樣，與90 mL 經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min 的無菌生理鹽水充分混合均勻，并用4 層紗布過濾，采用平板計數(shù)法計算微生物群落數(shù)量。取1 mL 濾液，將濾液從10-1等梯度稀釋至10-6倍數(shù)。在30 ℃的厭氧培養(yǎng)箱中，分別用MRS（man rogosa sharpe）瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂17 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2）（環(huán)凱生物科技有限公司，廣州）和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母粉3 g，氯化鈉5 g，乳糖10 g，膽鹽1.5 g，結(jié)晶紫0.002 g，中性紅0.03 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4）（VRBA，環(huán)凱生物科技有限公司，廣州）培養(yǎng)乳酸菌和大腸桿菌48 h。在28 ℃生化培養(yǎng)箱中，用孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基（蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂15 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.1 g，pH 7.2）（環(huán)凱生物科技有限公司，廣州）培養(yǎng)酵母菌和霉菌48 h。菌落數(shù)轉(zhuǎn)化為log10表示，單位為cfu·g-1FM。

1.3.3 營養(yǎng)成分分析 將剩余的青貯樣品在烘箱中105 ℃烘4 h 第一次稱重，后續(xù)每隔0.5 h 稱重一次至恒重，測定干物質(zhì)（dry matter，DM）含量。然后，將烘干后的青貯樣品用粉碎機(jī)粉碎，并過1.18 mm 篩。篩選后的粉樣用于后續(xù)水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、蛋白質(zhì)組分和纖維含量的測定。采用蒽-酮比色法測定WSC 濃度［16］。采用全自動凱氏定氮儀（Kjeltec 8400，F(xiàn)OSS，丹麥）分析粗蛋白（crude protein，CP）含量。按照Licitra 等［17］的方法測定真蛋白（true protein，TP）含量。非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量為CP 含量除去TP 含量后的剩余部分。中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量用A220 纖維分析儀（ANKOM 科技公司，美國）進(jìn)行分析。

1.4 抗氧化性分析

將約0.2 g 粉樣與10 mL 甲醇渦旋混合均勻，置于搖床避光浸提24 h。然后，將提取液在離心機(jī)中3000 r·min-1離心10 min。取上清液約7 mL，在-20 ℃中保存?zhèn)溆?，用于抗氧化性分析。按照He 等［18］的方法，測定自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）清除活性、自由基2，2＇-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2＇-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS］清除活性和鐵離子還原力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）活性，單位為mg trolox·g-1DM。

1.5 總黃酮含量測定

取0.5 mL 稀釋前后的提取液和rutin 標(biāo)準(zhǔn)液（100，200，300，400，500，600，700，800，1000 μg·mL-1，R=0.9981）與0.15 mL 5% NaNO3充分混合，6 min 后加入0.15 mL 的10% AlCl3，再過6 min 加入4%NaOH，并加入2.2 mL 純水。5 min 后測定510 nm 處的吸光值?？傸S酮含量用rutin 當(dāng)量表示（mg rutin·g-1DM）。重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 中的三因素方差分析（Three-way ANOVA）對香椿的發(fā)酵參數(shù)、營養(yǎng)組分和抗氧化性進(jìn)行分析，顯著性差異采用Duncan 多重極差檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時，表示顯著，P＜0.01 時，表示極顯著。并用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析香椿葉青貯抗氧化性與總黃酮含量之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 香椿葉的營養(yǎng)特性、微生物群落和抗氧化性

對RTSL 和GTSL 兩種表型香椿葉原料特性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，RTSL 與GTSL 原料的粗蛋白含量分別為12.9% DM 和15.2% DM，其中DM 含量分別為376 和332 g·kg-1FM；WSC 含量分別為86.7 和56.3 g·kg-1DM；NDF 含量分別為244 和309 g·kg-1DM；ADF 含量分別為138 和211 g·kg-1DM。乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌的群落數(shù)量均低于檢測水平（2.00 log10cfu·g-1FM）。此外，RTSL 和GTSL 原料的DPPH 自由基清除活性分別為249 和138 mg trolox·g-1DM；ABTS 自由基清除活性為764 和672 mg trolox·g-1DM；FRAP 活性為202 和112 mg trolox·g-1DM；總黃酮含量為78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM。

2.2 香椿葉的青貯品質(zhì)和微生物種群數(shù)量

與CK 相比，添加鄰苯二酚顯著降低了（P＜0.05）香椿葉青貯pH 值，添加0.5%C 對pH 值降低作用更顯著；添加鄰苯二酚顯著降低了乳酸含量（表1），未檢測到乙酸和丁酸。香椿葉青貯中均未檢測到乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌。

表1 紅香椿葉和綠香椿葉的青貯品質(zhì)及微生物群落分析Table 1 The analysis of fermentation quality and microbial communities of RTSL and GTSL silages

2.3 香椿葉青貯的蛋白質(zhì)組分

與CK 相比，在RTSL 青貯第15 天，1.0%C 處理組中粗蛋白的含量顯著降低，從12.1%降低至10.5%；非蛋白氮和NH3-N 含量均處于較低水平，無顯著差異（表2）。青貯良好地保存了香椿葉蛋白質(zhì)品質(zhì)。

表2 紅香椿葉和綠香椿葉青貯的蛋白質(zhì)組分分析Table 2 The analysis of protein composition of RTSL and GTSL silages（% DM）

2.4 香椿葉青貯的抗氧化性和總黃酮含量

與CK 相比，添加鄰苯二酚顯著提高了香椿葉青貯自由基DPPH 清除活性、FRAP 活性和總黃酮的含量（P＜0.05），用1.0%C 處理效果更顯著（表3）。隨著青貯時間的延長，香椿葉青貯的總黃酮含量和自由基DPPH 的清除能力顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)RAP 活性也顯著降低（P＜0.05），但仍保持在較高水平。為了進(jìn)一步了解總黃酮和抗氧化性之間的關(guān)系，對總黃酮和抗氧化性進(jìn)行Pearson 相關(guān)系數(shù)分析（表4）。Pearson 相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果表明自由基DPPH 清除活性、自由基ABTS 清除活性和鐵離子還原力（FRAP）活性均與總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

表3 紅香椿葉和綠香椿葉青貯的抗氧化性分析Table 3 The analysis of antioxidants activity of RTSL and GTSL silages（mg·g-1 DM）

表4 香椿葉青貯總黃酮與抗氧化性的Pearson 相關(guān)分析Table 4 Pearson correlations between antioxidant activities（DPPH，ABTS，and FRAP）and total flavonoids for RTSL and GTSL silages

3 討論

早前的研究表明，采摘時期、表型性狀及種源均會對香椿的營養(yǎng)成分以及生物活性造成一定的差異［9］。耿涌杭等［19］發(fā)現(xiàn)采摘時期對香椿的飼用品質(zhì)有較大的影響，不同的采摘時期香椿蛋白質(zhì)含量為13.2% DM 至22.7% DM 不等，蛋白質(zhì)含量隨香椿生長時期延長而降低。 RTSL 原料CP 含量為12.9%DM，GTSL 原料CP 含量為15.2% DM，較早前的調(diào)查偏低，可能是由于本研究中RTSL 和GTSL原料生長年限相對較長。香椿葉富含黃酮類成分，具有清除自由基、抗癌、抗菌和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的藥用性能；還具有降血壓、降血脂和擴(kuò)張動脈等功能［20］。本研究中，RTSL 和GTSL 原料中總黃酮含量分別為78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM，含量較高。香椿葉的提取物能夠降低血漿中的三酰甘油水平，從而減少動物肝臟脂肪細(xì)胞［21］。本研究中，香椿葉青貯自由基DPPH 清除活性均高于130 mg trolox·g-1DM；自由基ABTS 清除活性均高于670 mg trolox·g-1DM；FRAP 活性均高于110 mg trolox·g-1DM，具有較高的抗氧化性。在飼料中添加抗氧化劑，能夠有效降低脂肪的氧化酸敗，并且能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動物生長發(fā)育［22-23］。因此，香椿具有較高的營養(yǎng)價值，并具有降低動物生產(chǎn)中的氧化應(yīng)激的潛力。

在青貯過程中，香椿葉的pH 值（2.12～5.00）在較小的范圍內(nèi)波動，這可能與乳酸菌低于2.00 log10cfu·g-1FM 有關(guān)。此外，在所有香椿葉青貯中均未檢測到大腸桿菌、霉菌和酵母菌等不良微生物，這可能與香椿葉自身的抑菌活性有關(guān)。香椿葉提取物對大腸桿菌、金色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌活性［24］。因此，香椿葉在青貯過程中，蛋白質(zhì)得到了良好的保存。香椿葉青貯30 d 后蛋白質(zhì)水解指標(biāo)NPN 和NH3-N 含量略微增加，但處于較低水平，TP 得到了良好的保存。隨著青貯時間的延長，NPN 和NH3-N 的含量增加［25］。青貯后的微生物數(shù)量統(tǒng)計以及蛋白質(zhì)組分變化表明，在香椿葉的青貯過程中，幾乎無不良微生物發(fā)酵。青貯是保存香椿葉的一種可行方式。

香椿葉的生物活性與黃酮類化合物、類脂素、植物醇和香豆素等多種植物化學(xué)成分密切相關(guān)［26］。黃酮類化合物是植物酚類的一個重要亞群，多羥基結(jié)構(gòu)使其具有較高的抗氧化性［27］。青貯30 d 后，RTSL 和GTSL 中總黃酮含量分別從78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM 降低到了57.0 和22.3 mg rutin·g-1DM，這可能與酚類易分解的特點(diǎn)有關(guān)，而香椿葉之間總黃酮含量的差異可能與香椿葉的品種有關(guān)。經(jīng)Pearson 相關(guān)分析表明，香椿葉青貯的抗氧化性（DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP）與總黃酮含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。青貯30 d 后，雖然香椿葉青貯總黃酮含量隨著青貯時間的延長而下降了，但依舊表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性。含鄰苯二酚的抗氧化劑能通過非酶作用清除自由基來防止脂質(zhì)過氧化，從而降低機(jī)體的氧化應(yīng)激，減少疾病的發(fā)生［28］。與預(yù)期一致，添加鄰苯二酚顯著提高了香椿葉青貯的總黃酮含量，從而提高自由基DPPH 的清除活性和FRAP 的還原力活性，但自由基ABTS 的清除活性無明顯變化，鄰苯二酚提高青貯抗氧化性效果顯著。香椿葉中添加鄰苯二酚進(jìn)行青貯后作為飼料添加劑，不僅具有調(diào)節(jié)飼料營養(yǎng)品質(zhì)的潛力，而且具有提高動物機(jī)體抗氧化性的潛力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，香椿葉具有較高的營養(yǎng)價值。青貯過程中，香椿葉的蛋白質(zhì)含量無顯著變化，NPN 和NH3-N 的含量維持在低水平，青貯的方式有效保存了香椿葉的營養(yǎng)品質(zhì)。添加鄰苯二酚對香椿葉進(jìn)行青貯，青貯的總黃酮含量得到了顯著提高，自由基DPPH 清除活性和FRAP 活性也得到了顯著提高。鄰苯二酚有效提高了香椿葉青貯的抗氧化性。