劉文汝，冀勝鑫，甄志先,2＊

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,河北保定 071001；2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071000；

3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

國(guó)槐作為我國(guó)的特色樹種，樹冠碩大，姿態(tài)優(yōu)美，具有極高的園林觀賞價(jià)值，在城市綠化中發(fā)揮著重要作用。國(guó)槐帶化病是近年國(guó)槐苗木繁育及園林景觀營(yíng)造中危害比較嚴(yán)重的一種侵染性病害，其發(fā)病后導(dǎo)致國(guó)槐生長(zhǎng)減緩，枝條扁莖、頂端小葉叢生，并最終發(fā)生枯死，不僅給園林生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失，而且近年來(lái)該病發(fā)生日趨嚴(yán)重，有些苗圃中國(guó)槐受害率已達(dá)30%，嚴(yán)重威脅園林綠化生態(tài)效益與觀賞價(jià)值[1-2]。自上世紀(jì)90 年代首次證實(shí)國(guó)槐帶化病為植原體侵染造成以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其關(guān)注較少且研究并不深入。直到近年隨著分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，杜銀銀[3]通過(guò)采用PCR 快速擴(kuò)增及生物信息學(xué)技術(shù)首次明確了國(guó)槐帶化病植原體的分類地位，并對(duì)國(guó)槐帶化病植原體2 個(gè)株系（16Sr ID 與16Sr I-B）之間的遺傳相關(guān)性和親緣關(guān)系進(jìn)行了鑒定分析。但由于植原體觀察及體外培養(yǎng)難度較大[4]，因而很難對(duì)植原體病害的致病機(jī)理及病菌-寄主間互作機(jī)制進(jìn)行深入探究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可以比較精準(zhǔn)的反映寄主受到侵染后不同功能基因的響應(yīng)機(jī)制，現(xiàn)已逐漸成為互作解析和差異基因分析的主要技術(shù)手段[5]。Fan 和Mardi 等人通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，泡桐和墨西哥檸檬在被植原體侵染后，植原體-病菌互作基因表達(dá)上調(diào)，并且功能注釋結(jié)果表明植株的相關(guān)代謝活動(dòng)和信號(hào)通路主要與植物激素有關(guān)[6-7]；萬(wàn)倩蕓[8-9]等人在對(duì)茅蒼術(shù)扁莖機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)扁莖癥狀可能與多種激素代謝通路協(xié)同作用相關(guān)，并且可能主要與病菌寄生后誘發(fā)植物代謝紊亂。而張舒儀等[10]通過(guò)對(duì)棗瘋病植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)及qPCR 后期驗(yàn)證后，認(rèn)為植原體在侵染寄主后可能會(huì)迅速激起激素合成及相關(guān)保護(hù)酶合成基因的表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致激素含量和酶活性代謝紊亂，最終引發(fā)叢生、小葉等癥狀。前人結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)與生理功能驗(yàn)證相結(jié)合可以較為準(zhǔn)確、高效地揭示出植原體病害的致病機(jī)理，但目前關(guān)于國(guó)槐帶化病內(nèi)源激素與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究尚無(wú)報(bào)道。

本研究通過(guò)運(yùn)用高效液相色譜對(duì)病健組織中的生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、玉米素含量進(jìn)行比較分析，并對(duì)感病和健康國(guó)槐枝條進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和對(duì)比，結(jié)合GO 和KEGG 功能注釋，篩選出可能導(dǎo)致國(guó)槐激素代謝紊亂的關(guān)鍵差異基因，旨在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與生理水平相結(jié)合，揭示出國(guó)槐感病枝條扁莖機(jī)理。為國(guó)槐帶化病的防治和抗病品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣品在2019 年5、8、9、11 月中每個(gè)月份的20 日于保定地區(qū)東林水村國(guó)槐苗圃園選擇6 年生國(guó)槐進(jìn)行取樣，隨機(jī)采取6 組樣品（3 株健康樹、3 株感病樹及3 株感病樹的無(wú)癥狀枝條）用消毒高枝剪剪下樹冠頂端2 年生的健康與帶病枝，并將枝條用無(wú)菌剪刀剪成1 cm 小段脫去木質(zhì)部立即放入2 mL 離心管，并用標(biāo)簽標(biāo)記后迅速置于液氮冷凍，分成兩組，一組帶回實(shí)驗(yàn)室于零下20℃～80℃超低溫冰箱保存，用于測(cè)定激素含量。另一組送轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序。

1.2 內(nèi)源激素的高效液相色譜測(cè)定

參考杜紹華等[11]的HPLC 法進(jìn)行提取、純化、分離略有改動(dòng)。稱取樣品1 g 用液氮研磨，加入8 mL 80%的預(yù)冷甲醇，4℃避光浸提12 h；避光超聲1 h，4℃ 12 000 rpm 下離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管；加入0.2 g PVPP 去除酚雜質(zhì)，超聲0.5 h，4℃ 12 000 rpm 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中；用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 值為2.9，用C18純化移入10 mL 試管，加入1 mL pH=8 的甲醇沖洗即進(jìn)樣瓶。試驗(yàn)中以生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素（ZT）、脫落酸（ABA）為標(biāo)樣，并建立標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗(yàn)采用高壓液相色譜儀為日本產(chǎn)HI-TACHI L-7420 型，流動(dòng)相為100%甲醇：0.7%乙酸體積比為55∶40∶5，紫外檢測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速0.7 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 uL。

1.3 總RNA 的提取、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

將國(guó)槐韌皮部用液氮進(jìn)行研磨，用天根生化科技有限公司試劑盒進(jìn)行總RNA 的提取。用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)總RNA 是否存在污染、降解。用Nanodrop 檢測(cè)總RNA 的純度(OD260/280比值)、濃度核酸吸收峰是否正常。用Agilent 2100精確檢測(cè)RNA 的完整性，檢測(cè)指標(biāo)包括：RIN值、28S/18S、圖譜基線有無(wú)上抬、5S 峰。樣品總RNA 檢測(cè)合格后寄到北京組學(xué)生物科技有限公司，進(jìn)行cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建，文庫(kù)構(gòu)建完成之后使用Agilent 2100 對(duì)文庫(kù)的insert size 進(jìn)行檢測(cè)，insert size 符合預(yù)期后用qPCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞ 2 nM），完成庫(kù)檢。庫(kù)檢合格后，用Illumina 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析

對(duì)Raw Data 進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads 獲得高質(zhì)量的CleanData。然后用Quality（Score 或Q-score）進(jìn)行堿基識(shí)別，使用Phred 的公式（Q-score=-10 log10p）來(lái)獲得Phred 堿基質(zhì)量值，準(zhǔn)確計(jì)算出堿基質(zhì)量值與堿基識(shí)別出錯(cuò)的概率的對(duì)應(yīng)關(guān)系。堿基質(zhì)量值越高表明堿基識(shí)別越可靠，準(zhǔn)確度越高。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量的Clean Data，用一款專門為高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序設(shè)計(jì)的組裝軟件Trinity[12]對(duì)其進(jìn)行序列組裝拼接。以Trinity 拼接得到的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列（Ref），將每個(gè)樣品的Clean Reads 對(duì)Ref做比對(duì)分析。并根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等分析。

1.5 內(nèi)源激素差異基因qRT-PCR 驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得內(nèi)源激素相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選差異基因，采用SYBR 法對(duì)篩選的差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證。并以Actin 作為內(nèi)參基因。Actin-F（5′-GAGGGCCCAGGTTCTGA TTT-3′）和 Actin-R（5′-GCACCCACCTGCATT TTACC-3′）。通過(guò)NCBI 設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行熒光定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照以下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，72℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCT[13]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。用 SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用LSD和 Duncan’s 方法進(jìn)行兩兩比較、差異顯著性分析（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病、健國(guó)槐內(nèi)源激素含量變化

通過(guò)對(duì)處于生長(zhǎng)期的感病國(guó)槐（BZ）、健康國(guó)槐（JK）和感病國(guó)槐樹上的表象健康枝（BJ）樹皮的內(nèi)源激素含量的測(cè)定，研究該病害發(fā)生期對(duì)國(guó)槐內(nèi)源激素的影響。由圖1 可以看出，BZ、BJ和JK 間的Zeatin、GA、IAA 及ABA 含量變化趨勢(shì)基本一致。Zeatin 含量在8、9 月份達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(shì)，其中8 月份BZ 中的Zeatin 含量顯著高于BJ 和JK，BJ、JK 無(wú)差異。其它月份中三者間無(wú)顯著差異；GA 含量與Zeatin 含量年變化較為相似，在8 月份達(dá)到最高，之后處于下降趨勢(shì)。但其中8 月份BZ 的GA 含量顯著低于JK 和BJ，BJ 其次，BZ 中的GA 含量最低，其它月份三者間并無(wú)差異；而IAA 和ABA 的含量變化呈相反趨勢(shì)，IAA 除5 月份最高外，之后一直呈下降趨勢(shì)，并在11 月份達(dá)到最低，其中JK 含量最高，BJ 其次，BZ 中的IAA 含量最低。ABA 則是從5 月份開始一直呈上升趨勢(shì)，在11 月份達(dá)到最高，BZ 中的含量顯著高于JK 和BJ，BJ 與JK 的ABA 含量在5、8、9 月份中均無(wú)差異。

圖1 病健國(guó)槐內(nèi)源激素含量Fig.1 Content of endogenous hormones in the diseased and heathy

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝分析

通過(guò)對(duì)國(guó)槐感病樣本（BZ1、BZ2、BZ3）和健康樣本（JK1、JK2、JK3）進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得26 499 450、22 444 628、33 026 072、37 221 613、28 464 069 和27 856 864 條Raw Reads，在去除含有接頭的Reads 以及低質(zhì)量的Reads（包括去除N 的比例大于10%的Reads）后，最終得到20 427 416、17 402 101、25 556 038、28 443 464、21 878 012 和21 192 357 條Clean reads。其 中Q20堿基百分比分別是98.20%、98.16%、98.05%、97.95%、97.93%和97.99%，GC 堿基含量則均約達(dá)到44%（表1）。經(jīng)過(guò)過(guò)濾后，最終得到可靠的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，并進(jìn)行下一步生物學(xué)分析。

表1 每個(gè)樣品有效測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of valid sequencing data of each sample

2.3 Unigne 功能基因注釋

采用BLAST[14]軟件對(duì)Unigene 序列與NR、Swiss-Prot[15]、GO[16]、COG/KOG[17]、KEGG[18]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共獲得Unigne 注釋功能信息有72 637條，占全部Unigene 的60%，其中NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的信息最多，而COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋信息最少。通過(guò)使用KOBAS2.0[15]獲得Unigene 在KEGG 中的KEGG Orthology 結(jié)果，在預(yù)測(cè)Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER[17]軟件與Pfam[19]數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene 的注釋信息（表2）。

表2 Unigene 功能注釋統(tǒng)計(jì)Table 2 Unigene function annotation statistics

2.4 感病國(guó)槐與正常國(guó)槐基因表達(dá)差異分析

通過(guò)采用EBSeq[20]對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，并采取Fold Change≥2 且FDR＜0.01 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。如圖2 所示，綠點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)基因，紅點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)基因，藍(lán)色的點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因。其中共得到差異表達(dá)基因數(shù)目4 714條，國(guó)槐帶化病樣品相對(duì)于健康國(guó)槐樣品上調(diào)基因有2 283 條，下調(diào)基因有2 431 條。這些結(jié)果表明，國(guó)槐在受到植原體侵染后其植物體內(nèi)多數(shù)的基因表達(dá)受到抑制。

圖2 國(guó)槐帶化病株和健康株之間差異表達(dá)基因的火山圖Fig.2 Volcanic diagram of differentally expressed genes between locust striated and healthy plants

2.5 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析

2.5.1 差異表達(dá)基因GO 功能分析 通過(guò)對(duì)感病與健康國(guó)槐轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋富集分析，結(jié)果可分為3 大類：細(xì)胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物學(xué)過(guò)程（biological process）。其中注釋到細(xì)胞組成有7 個(gè)，分子功能10 個(gè)，生物學(xué)過(guò)程3 個(gè)（圖3）。細(xì)胞組成中以膜的組成成分（783 個(gè)）和質(zhì)膜（141）中差異表達(dá)基因最多，另外膜的組成成分、運(yùn)動(dòng)蛋白復(fù)合物等離子組分以及細(xì)胞壁等差異表達(dá)基因富集表達(dá)均達(dá)到顯著水平；分子功能中以蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶（136 個(gè)）和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄（84 個(gè)）差異表達(dá)基因最多，而在木糖葡聚糖、木糖葡聚糖轉(zhuǎn)化和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄等富集基因中達(dá)到顯著水平；生物學(xué)過(guò)程中蛋白磷酸化中的差異表達(dá)基因居多并達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明細(xì)胞組成和分子功能的基因富集更為顯著，這說(shuō)明在國(guó)槐受到植原體侵染以后，細(xì)胞和分子功能方面均發(fā)生明顯的差異變化，并可能受到上述富集差異基因的調(diào)控。

圖3 差異表達(dá)基因GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.5.2 差異表達(dá)基因KEGG 注釋 在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因的通路（Pathway）注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。通過(guò)對(duì)差異基因(2 539個(gè))進(jìn)行KEGG 功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)差異基因被富集到48 條代謝通路，本研究挑選了富集最顯著的20 條pathway 條目在圖中進(jìn)行展示（圖4）。其中代謝通路從低到高依次為：戊糖和葡萄糖醛酸互相轉(zhuǎn)化、卟啉和葉綠素代謝、AMPK 信號(hào)通路、癌變中的微型核糖核酸、多巴胺能受體、半光氨酸和蛋氨酸代謝、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、MAPK 信號(hào)通路、溶酶體、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、RNA 降解、抗原加工和傳遞、苯丙氨酸合成、Ras 信號(hào)通路、內(nèi)噬作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原互作、淀粉和蔗糖代謝、Toll 受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和NF-KB信號(hào)傳導(dǎo)途徑。其中，匯集差異基因最多的Toll受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和NF-KB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑均表現(xiàn)為顯著下調(diào)，另外，控制細(xì)胞內(nèi)噬作用、減數(shù)分裂以及抗原加工與傳遞同樣表現(xiàn)為顯著下調(diào)。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG 富集Fig.4 Distribution of differentially expressed gene KEGG

2.5.3 國(guó)槐激素差異表達(dá)基因代謝通路 感病國(guó)槐和正常國(guó)槐激素代謝通路的差異基因被注釋到25 個(gè)DEGs（圖5）。由圖可知，其中有7 個(gè)下調(diào)基因（綠色標(biāo)注），8 個(gè)上調(diào)基因（紅色標(biāo)注）。其中，在色氨酸代謝通路上（生長(zhǎng)素），AUX1 節(jié)點(diǎn)上有3 個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)，而在GH3 節(jié)點(diǎn)有3 個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)。而在玉米素信號(hào)傳導(dǎo)代謝通路上（細(xì)胞分裂素），CRE1 基因節(jié)點(diǎn)上涉及到7 個(gè)差異基因下調(diào)；AHP 節(jié)點(diǎn)上有3 個(gè)差異基因下調(diào)；ARR-A 節(jié)點(diǎn)處有3 個(gè)差異基因下調(diào)。二萜生物合成（赤霉素）代謝通路上關(guān)鍵調(diào)控基因TF 涉及13 個(gè)差異基因上調(diào)。生長(zhǎng)素、玉米素合成關(guān)鍵基因的下調(diào)以及赤霉素合成基因的上調(diào)，可能是導(dǎo)致國(guó)槐枝條頂端生長(zhǎng)停滯、發(fā)生橫向卷曲生長(zhǎng)的主要原因。類胡蘿卜素生物合成（脫落酸）代謝途徑中，ABF 調(diào)控關(guān)鍵基因涉及10 個(gè)差異基因上調(diào)，產(chǎn)生這種原因可能與植原體的致病因子的基因干擾或植物體受到脅迫產(chǎn)生的自激反應(yīng)有關(guān)。

圖5 植物激素傳導(dǎo)（Ko04075）路徑Fig.5 Pathway map of phytohormone transmission (ko04075)

2.5.4 國(guó)槐激素差異表達(dá)基因qRT-PCR qRT-PCR驗(yàn)證本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組差異基因數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選獲得與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸代謝相關(guān)基因共6 個(gè)（表3），其中，與生長(zhǎng)素代謝相關(guān)基因AUX 1 個(gè)（GHLAX5），與細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)受體CRE1 相關(guān)基因3 個(gè)（GHAHK4、GHAHP4和GHARR8），調(diào)控赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)基因TF 1 個(gè)（GHTF），脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子相關(guān)基因ABF 1 個(gè)（GHABF2）。通過(guò)對(duì)上述6 個(gè)激素代謝關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量表達(dá)驗(yàn)證，如圖6 所示，雖然定量表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果具有一定差異，但表達(dá)趨勢(shì)較為一致，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素代謝關(guān)鍵基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)，赤霉素和脫落酸代謝關(guān)鍵基因表現(xiàn)為顯著上調(diào)。

圖6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.6 Validation of differentially expressed genes using qRT-PCR

表3 差異表達(dá)基因qRT-PCR 引物Table 3 Primers of differentially expressed genes QRT-PCR

3 討論

多數(shù)研究認(rèn)為，植原體在侵入植物體后，產(chǎn)生的某種產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)激素失衡，進(jìn)而導(dǎo)致植物體表型生長(zhǎng)發(fā)生改變，出現(xiàn)小葉、叢生等癥狀[21-22]。因而通過(guò)研究病株機(jī)體內(nèi)源激素含量進(jìn)而解釋植原體病害的致病機(jī)理逐漸成為植原體病害研究的主要手段。趙錦等[23]研究發(fā)現(xiàn)棗瘋病株在1 年中的發(fā)育旺盛期內(nèi)玉米素含量表現(xiàn)為異常顯著升高，而且在生長(zhǎng)后期內(nèi)玉米素含量也顯著高于健株。Kesumawati[24]的研究結(jié)果也表明在八仙花受到植原體感染的組織中含有較高含量的玉米素。另外，有研究認(rèn)為玉米素和生長(zhǎng)素的比例變化失調(diào)可能是導(dǎo)致植物體發(fā)生小葉、叢枝等病狀的主要因素[23,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)國(guó)槐在受到植原體侵染以后，其生長(zhǎng)旺盛的8 月份期間，病枝內(nèi)玉米素顯著高于健樹和病樹上的無(wú)癥狀枝，而在其他月份并未產(chǎn)生較大差異；但在旺盛生長(zhǎng)期內(nèi)病枝中的赤霉素、生長(zhǎng)素含量則均顯著低于健樹和病樹上的無(wú)癥狀枝，在旺盛生長(zhǎng)期內(nèi)的玉米素含量與生長(zhǎng)素比例的嚴(yán)重失衡可能是導(dǎo)致國(guó)槐感病枝條發(fā)生小葉和叢枝的主要原因，與前人得出的玉米素含量的顯著增加是導(dǎo)致器官分化方向改變，進(jìn)而引起叢枝的結(jié)果較為一致[23]。而且生長(zhǎng)素、赤霉素的顯著降低也可能是導(dǎo)致國(guó)槐病枝向內(nèi)卷曲和停止伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的主要原因[27]。

植原體的功能基因組較小，在侵染寄主后，其基因組片段會(huì)整合到植物的細(xì)胞基因組中，研究發(fā)現(xiàn)植原體基因組缺乏脂肪酸和氨基酸合成等基本的生化途徑[23]，因而可能主要通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控幫助其完成寄生，并會(huì)對(duì)寄主植物產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，植原體的簡(jiǎn)單基因組中存在編碼致病效應(yīng)因子蛋白的基因，部分致病效應(yīng)因子通過(guò)與標(biāo)靶蛋白相結(jié)合干擾寄主植物的正常代謝以達(dá)到干擾寄主植物防御功能的目的[4]，翠菊黃化植原體叢枝株系所產(chǎn)生的致病效應(yīng)蛋白SAP11AYWB 能夠通過(guò)靶標(biāo)作用寄主的TCP 轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響寄主植物體內(nèi)的抗體活性甚至使得該類轉(zhuǎn)錄因子失活，導(dǎo)致叢枝癥狀的產(chǎn)生[28]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)國(guó)槐帶化病枝條內(nèi)的多數(shù)基因表達(dá)受到抑制，細(xì)胞組分與分子功能富集差異基因最多，并且差異基因多數(shù)注釋到植物的免疫應(yīng)答機(jī)制、植物-病原互作和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，其中Toll 受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和NF-KB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑匯集差異基因最多，且均表現(xiàn)為顯著下調(diào)，有研究指出Toll 受體在動(dòng)物體內(nèi)主要通過(guò)識(shí)別來(lái)自細(xì)菌和病毒的侵入信號(hào)及細(xì)胞損傷狀況，進(jìn)而對(duì)免疫應(yīng)答起到關(guān)鍵調(diào)控作用[29]，而NF-KB 信號(hào)通路作為Toll 受體信號(hào)傳導(dǎo)激活的下游通路，常與Toll 受體在免疫機(jī)制中形成聯(lián)控作用[30]，這說(shuō)明國(guó)槐枝條在受到植原體侵染以后，機(jī)體調(diào)控免疫應(yīng)激的能力顯著降低，細(xì)胞衰亡程度加快。另外，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明在激素代謝通路中調(diào)控生長(zhǎng)素代謝的響應(yīng)因子AUX1 的表達(dá)顯著下調(diào)，這與前人得到的在表達(dá)植原體致病蛋白“天狗蛋白”的植物中生長(zhǎng)素響應(yīng)因子顯著下調(diào)，且生長(zhǎng)素含量顯著降低的結(jié)果較為一致[31]。同樣，Jennifer研究表明擬南芥組氨酸激酶（CRE）作為一種玉米素受體，可能在玉米素功能信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[32]，而Riefler 等人研究結(jié)果也指出植物體內(nèi)的玉米素含量可能受到CRE 受體的反饋抑制，在CRE 受體突變的植株中積累了更高含量的細(xì)胞分裂素[33]，本研究結(jié)果表明在玉米素代謝通路中，CRE1 受體基因表達(dá)顯著下調(diào)，另外負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂發(fā)育的A 型ARRs 基因[32]表達(dá)也顯著下調(diào)，這與前人報(bào)道稱泡桐叢枝病枝發(fā)病后，病枝內(nèi)玉米素代謝通路基因表達(dá)顯著上調(diào)[34]的研究結(jié)果相反，但這些結(jié)果說(shuō)明國(guó)槐帶化病枝內(nèi)積累的較高含量細(xì)胞分裂素以及細(xì)胞增生進(jìn)而發(fā)生橫向生長(zhǎng)可能與CRE1 和A 型ARRs 等基因的顯著下調(diào)表達(dá)有關(guān)，具體原因則需要對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步功能驗(yàn)證。另外本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組篩選得到的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸代謝通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果表明表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較為一致，這說(shuō)明本研究所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證準(zhǔn)確性較高。綜上，可能正是由于國(guó)槐病株內(nèi)源激素代謝關(guān)鍵基因表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸的含量積累發(fā)生變化，這與前人在對(duì)篩選得到的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量表達(dá)驗(yàn)證后[10,34]所得到的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)探究國(guó)槐帶化病株內(nèi)激素含量與基因表達(dá)之間的變化聯(lián)系，認(rèn)為國(guó)槐植株在受到病原侵染以后，其病枝內(nèi)玉米素、生長(zhǎng)素和赤霉素的代謝關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致病枝內(nèi)的玉米素和生長(zhǎng)素比例失衡，以及赤霉素顯著降低，這可能是導(dǎo)致國(guó)槐病枝表現(xiàn)叢生、小葉及枝條帶化生長(zhǎng)的主要原因。本工作為進(jìn)一步深入研究國(guó)槐帶化病及其防治工作提供了理論基礎(chǔ)。