楊英英，趙林姣，楊桂娟，張 玉，付鵬躍,4，胡繼文，劉 瑩，王 楠＊

(1.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心,湖北 宜昌 443002；2.林木遺傳育種國家重點實驗室,中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室,楸樹國家創(chuàng)新聯(lián)盟,北京 100091；3.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,云南 昆明 650224；4.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040)

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是一種常見的檢測基因表達(dá)水平的技術(shù)手段，它可以將常規(guī)PCR 和熒光檢測技術(shù)相結(jié)合，實時監(jiān)控PCR 擴增的過程[1]，具有成本低、靈敏度高、特異性強等特點[2]，被廣泛應(yīng)用于新基因挖掘及功能研究[3]。由于qRT-PCR 技術(shù)的檢測結(jié)果受到樣本、實驗條件、RNA 質(zhì)量及純度、反轉(zhuǎn)錄效率等因素的影響[4]，因此，想要獲取準(zhǔn)確度高的試驗結(jié)果，就必須使用合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)[5]。

在大多數(shù)基因表達(dá)分析研究中，常選用能夠維持細(xì)胞骨架或參與細(xì)胞基本生命過程的管家基因作為內(nèi)參基因，如肌動蛋白基因（Actin）、α/β 微管蛋白基因（TUA/TUB）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH），多聚泛素酶基因（UBQ）以及18S核糖體RNA（18S）等[6]。然而，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，這類管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性也會受到物種和組織差異的影響[7]。如在連翹葉片中UKN1的表達(dá)最穩(wěn)定，但在花和花蕾中最穩(wěn)定的基因是ACT和SDH[8]；在茉莉不同器官（根、莖、葉及花）中篩選出的理想內(nèi)參也存在差異[9]。此外，同一物種內(nèi)參基因的選擇也受不同脅迫條件的影響，如EXP1和PP2A在高鹽脅迫后的北沙參中是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在MeJA 處理后CYP2和α-TUB是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[10]。楊樹不同發(fā)育時期中篩選到的理想內(nèi)參基因是U6-1、EIF4A和PP2A-2[11]，而蘇曉娟等發(fā)現(xiàn)，鋅脅迫下楊樹的actin、ubiquitin、EF1α和18S r RNA基因表達(dá)最為穩(wěn)定[12]，儲文淵等發(fā)現(xiàn)，楊樹在鹽和干旱脅迫下，其新內(nèi)參基因PtRG1，PtRG3和PtRG5比傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)更加穩(wěn)定[13]。因此，內(nèi)參基因并不具有通用性，在開展特定研究材料或?qū)嶒灄l件的實時熒光定量分析前，首先應(yīng)進(jìn)行該物種特異性內(nèi)參基因的篩選[14]。

灰楸（Catalpa fargesiiBur.）是紫葳科、梓屬落葉喬木，是我國珍貴的用材樹種和著名的園林觀賞樹種，素有“木王”之稱。‘麥緣錦楸’是從灰楸實生苗選育出的新品種，其葉片呈現(xiàn)中間綠邊緣黃的特征，目前已通過高干嫁接技術(shù)廣泛應(yīng)用于園林綠化等方面。課題組前期對‘麥緣錦楸’和灰楸的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同顏色部位葉片的色素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在顯著差異[15]。想要進(jìn)一步揭示該生理現(xiàn)象的分子機理，就需要分析‘麥緣錦楸’葉色形成途徑中差異基因的表達(dá)模式[16]，然而，目前尚未見梓樹屬對不同葉色表型篩選內(nèi)參基因的相關(guān)報道，因此，開展‘麥緣錦楸’葉片內(nèi)參基因的選擇研究，以提高基因表達(dá)量的可靠性是十分必要的。本研究借助課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過比較‘麥緣錦楸’和灰楸不同組織部位的基因表達(dá)量，初步篩選出表達(dá)相對穩(wěn)定的6 個基因CfUBC、CfActin11、＞CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1以及本課題組常用的內(nèi)參基因CbuActin[17]，共7 個候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 等軟件綜合分析并篩選出‘麥緣錦楸’不同葉色中表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因；接著以萜類合成相關(guān)基因（CfGES）進(jìn)一步驗證上述分析結(jié)果的可靠性。本研究將使‘麥緣錦楸’與灰楸葉片基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化和定量化更加準(zhǔn)確，并為后期開展‘麥緣錦楸’黃綠葉色分區(qū)形成的分子研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自河南省洛陽市扁擔(dān)趙基地。樣品采集后，立即用刀片將‘麥緣錦楸’葉片黃綠部分切分，分別命名為Y1（黃色）、Y2（綠色），灰楸葉片對應(yīng)部位分別命名為G1、G2（圖1）。切好的葉片用錫箔紙包裹后立即置于液氮中速凍，并轉(zhuǎn)至-80℃保存。所有的樣品均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 灰楸及‘麥緣錦楸’葉片取樣圖[15]Fig.1 Samples of leaves of 'Maiyuanjinqiu' and C.fargesii.[15]

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與cDNA 合成 RNA 提取按照EASY spin 植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）的操作說明進(jìn)行。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 樣品的完整性，并利用超微量紫外分光光度計探頭（Nanodrop 2000）檢測所提取RNA 的濃度與純度。利用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara，RR047A），將RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得的cDNA 樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選內(nèi)參基因的篩選 以課題組前期未發(fā)表的‘麥緣錦楸’和灰楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依據(jù)，選取FPKM 值大于100 且在樣品間無顯著差異表達(dá)的6 個基因（CfUBC、CfActin、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1）為候選基因，加上課題組前期常用的CbuActin[17]共7 個內(nèi)參基因。

1.2.3 引物設(shè)計及特異性檢測 根據(jù)引物設(shè)計原則，利用在線工具Primer 3 Plus 設(shè)計內(nèi)參基因及CfGES基因引物，引物大小為18～27 bp，Tm 值在58～61℃，擴增長度為150～250 bp，GC 含量為40%～60%，并在NCBI 上對引物進(jìn)行特異性檢測。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。以各候選基因引物做普通PCR 擴增，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 內(nèi)參基因及CfGES 基因的引物設(shè)計Table 1 Primer design for internal reference genes and CfGES gene

1.2.4 實時熒光定量PCR 將cDNA 模板混合稀釋8 倍后，按照Takara 公司的TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 試劑盒（Takara，RR420A）說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR 實驗。反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，DNA 模板1 μL，dd H2O 7.4 μL。每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，所有操作均在冰上進(jìn)行。利用LightCycler480 實時熒光定量PCR 儀對各樣品進(jìn)行擴增，PCR 擴增程序為：95℃預(yù)變性30 s；定量分析40 個循環(huán)：95℃ 變性5 s，60℃退火30 s；融解曲線：95℃ 5 s，60℃ 1 min 后緩慢上升至95℃；降溫：50℃ 30 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和分析 將各樣品得到的Ct值按公式Q=E(minCt-sampleCt)（E為擴增效率，默認(rèn)值為2；minCt為基因在樣品中的最小Ct值；sampleCt為基因在樣品中的Ct值）進(jìn)行計算，將得到的Q值導(dǎo)入GeNorm 和NormFinder 軟件中進(jìn)行穩(wěn)定性分析。將各樣品得到的Ct值輸入到BestKeeper軟件中，得到候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性（M值）、穩(wěn)定值（SV 值）、變異系數(shù)（CV 值）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD 值），進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。使用3 款軟件分析后，將各樣品得到的Ct值輸入到在線網(wǎng)站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/forresearchers/）中進(jìn)行綜合分析，得出最適合‘麥緣錦楸’不同葉色部位穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

1.2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 分別以綜合分析排名最靠前的2 個基因為內(nèi)參，對萜類合成基因CfGES的表達(dá)情況進(jìn)行分析，qRT-PCR 方法參照1.2.4，結(jié)合CfGES基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對2 個內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與質(zhì)量檢測

Nanodrop 檢測到所有樣品總RNA 的OD260/280及OD260/230值均在1.8～2.2 之間，說明所提RNA純度較好，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 樣品完整性（圖2），各樣品的28S 和18S 條帶明顯，說明總RNA 完整性較好，均可用于后續(xù)試驗。

圖2 ‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位總RNA 電泳圖Fig.2 Total RNA electrophoresis of different leaf color parts of 'Maiyuanjinqiu' and C.fargesii.

2.2 內(nèi)參基因引物的特異性篩選

圖3 顯示：所有引物均能擴增出單一且亮的條帶，無引物二聚體，條帶大小與預(yù)期相符，引物特異性完好，可用于后續(xù)檢測分析。對7 個候選內(nèi)參基因在各個樣品的qRT-PCR 分析表明：各基因Ct值均在23～35，且溶解曲線都呈現(xiàn)顯著單一的峰（圖4），表明qRT-PCR 所用引物可與模板cDNA特異性結(jié)合并擴增靶基因。

圖3 7 種內(nèi)參基因的PCR 擴增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of seven reference genes.

圖4 7 個內(nèi)參基因溶解曲線Fig.4 Real-time PCR melting curves of seven reference genes

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度分析 7 個候選內(nèi)參基因中，CfActin的平均Ct值最大，為26.459，說明該基因的表達(dá)豐度最低；CfGADPH的平均Ct值最小，為20.91，說明該基因的表達(dá)豐度最高。7 個內(nèi)參基因的表達(dá)豐度大小排序依次是：CfGADPH ＞ CbuActin ＞ CfEF-1 ＞ CfMADH＞ CfPP2A ＞CfUBC ＞ CfActin（圖5）。

圖5 7 個內(nèi)參基因平均Ct 值Fig.5 Average Ct values of seven reference genes

2.3.2 GeNorm 分析 GeNorm 是通過比較計算內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值，以確定表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。該軟件以M=1.5 作為臨界點，低于該值表明基因的表達(dá)相對穩(wěn)定，且M 值越小表示內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定[18]。GeNorm 分析結(jié)果表明：7 個候選內(nèi)參基因的M 值均小于1.5（表2），即各候選內(nèi)參的表達(dá)都相對穩(wěn)定，穩(wěn)定性排名從高到低依次是：CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfPP2A＞CfActin11＞CfUBC ＞CbuActin。為確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，進(jìn)一步通過配對變異系數(shù)Vn/ (n+1)，得出以4 個候選基因同時做為內(nèi)參基因的效果最佳，2 個組合使用次之（圖6）。

表2 GeNorm 軟件分析下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Analysis of the expression stability of reference genes in leaves by GeNorm

圖6 GeNorm 軟件分析最適合內(nèi)參基因數(shù)目Fig.6 The number of the most suitable reference genes analyzed by GeNorm software

2.3.3 NormFinder 分析 NormFinder 的計算原理與GeNorm 相似，該軟件是基于Excel 結(jié)合組間方差與組內(nèi)方差計算SV 值，來確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。SV 值的大小與基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。Norm-Finder 分析結(jié)果（表3）顯示：CfUBC、CbuActin、CfActin11、CfPP2A、CfGADPH、CfEF-1、CfMADH基因在葉片不同顏色部位的表達(dá)穩(wěn)定值分別為0.406、0.520、0.329、0.340、0.068、0.095、0.062，其中，CfMADH、CfEF-1和CfGADPH的SV 值最小，說明這3 個基因的穩(wěn)定性較強。

表3 NormFinder 軟件分析‘麥緣錦楸’及灰楸不同葉色部位內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Analysis of the expression stability of reference genes by NormFinder software

2.3.4 BestKeeper 分析 BestKeeper 通過計算變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）來反映內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，CV 和SD 的值與基因的穩(wěn)定性負(fù)相關(guān)，其中，SD 值的默認(rèn)閾值為1.0，低于該值即認(rèn)為表達(dá)穩(wěn)定[19]。BestKeeper 分析結(jié)果（表4）顯示：在灰楸及‘麥緣錦楸’葉片中，7 個基因的SD 值均小于1.0，說明各基因的表達(dá)均較為穩(wěn)定，并且穩(wěn)定性從高到低排序依次是：CfActin11、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1、CbuActin、CfPP2A、CfUBC，其中CfActin11的CV 和SD 值最?。–V=0.80；SD=0.21），表達(dá)最為穩(wěn)定；CfUBC的CV 和SD 值最大（CV=2.35；SD=0.62），其表達(dá)最不穩(wěn)定。

表4 BestKeeper 軟件分析灰楸及‘麥緣錦楸’不同葉色部位內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper software was used to analyze the expression stability of internal reference genes in different leaf color sectors of Maiyuanjinqiu and C.fargesii.

2.3.5 綜合性分析 對GeNorm、NormFinder 以及BestKeeper 3 種軟件的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，綜合評估基因的表達(dá)穩(wěn)定性。將各基因在不同樣品中的Ct值導(dǎo)入在線網(wǎng)站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/for-researchers/）中。結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性綜合排名由高到低依次為CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfActin11＞CfPP2A＞CfUBC＞CbuActin(圖7)，其中，CfMADH和CfEF-1的表達(dá)穩(wěn)定性最好，符合qRT-PCR 實驗內(nèi)參基因的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

圖7 RefFinder 分析7 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性綜合排名Fig.7 Stability ranking of seven genes by RefFinder analysis

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

分別以CfMADH和CfEF-1為內(nèi)參，分析萜類合成酶基因CfGES在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位（Y1、Y2、G1、G2）的表達(dá)量差異，以驗證軟件預(yù)測結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明：單獨或組合使用CfMADH及CfEF-1基因為內(nèi)參時，CfGES基因的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致（圖8）。因此，本研究結(jié)果表明：單獨使用CfMADH、CfEF-1基因或組合使用這2 個基因，能夠準(zhǔn)確校準(zhǔn)‘麥緣錦楸’不同葉色部位的熒光定量結(jié)果。

圖8 CfGES 在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位的基因表達(dá)量差異Fig.8 The expression differences of CfGES among different leaf color sectors of 'Maiyuanjinqiu'and C.fargesii .

3 討論

基因表達(dá)分析是分子生物學(xué)科中最為重要的研究內(nèi)容之一，qRT-PCR 是當(dāng)前最常用的檢測基因表達(dá)情況的技術(shù)手段，常用來檢測基因在不同樣品、組織、生長發(fā)育時期及特定實驗條件下的表達(dá)模式[20]。對基因進(jìn)行表達(dá)情況分析時，必須選擇準(zhǔn)確的內(nèi)參基因做標(biāo)準(zhǔn)化分析[21-22]。眾多研究中發(fā)現(xiàn)，管家基因可作為內(nèi)參基因來進(jìn)行表達(dá)量分析。然而近年來有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因并不具有通用性，需要根據(jù)特定的物種或?qū)嶒灄l件來確定最適宜的內(nèi)參基因[23-24]。如GADPH在黃山欒樹、銀杏、肉桂和大葉清化桂中穩(wěn)定表達(dá)[25-27]，但在絲瓜和苧麻中卻被認(rèn)為是最不理想的內(nèi)參基因[28-29]。18SrRNA基因在紅豆杉多種處理下都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性[30]，但在稻瘟病菌侵染的水稻、靈芝及紅木不同處理下該基因的表達(dá)最不穩(wěn)定[31-32]。目前尚未發(fā)現(xiàn)能在各類實驗條件下都穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，所以研究者需要根據(jù)自己的實驗條件找到可以作為標(biāo)準(zhǔn)化的基因進(jìn)行定量分析。

GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 是基因組研究中篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因最常見的計算軟件，本研究應(yīng)用3 款軟件及1 個分析網(wǎng)站對7 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，這7 個內(nèi)參基因在‘麥緣錦楸’和灰楸葉片中均穩(wěn)定表達(dá)，但穩(wěn)定性排名略有差異：在GeNorm 和NormFinder 中均得出CfMADH和CfEF-I是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在BestKeeper中CfMADH和CfEF-I的排名卻分別居于第2 和第4名，排名的差異可能是由于3 款軟件所設(shè)定的統(tǒng)計學(xué)算法不同所導(dǎo)致的。GeNorm 和NormFinder 的原理基本相似，都是將qRT-PCR 所得到的Ct值轉(zhuǎn)化為基因相對表達(dá)量，再進(jìn)行最適內(nèi)參的分析，每個候選基因的穩(wěn)定性取決于單個樣品的最小Ct值；而BestKeeper 則直接在內(nèi)置公式中輸入各基因表達(dá)的Ct值來進(jìn)行分析，候選基因的穩(wěn)定性與每個樣品Ct值的離散程度相關(guān)，因此，該算法易受極端值影響，無法規(guī)避系統(tǒng)誤差[33-34]。考慮到每款軟件的局限性，筆者利用RefFinder 對這3 款軟件得出的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，確定了7 個候選內(nèi)參基因在‘麥緣錦楸’葉片中的穩(wěn)定性排名依次是：CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfActin11＞CfPP2A＞CfUBC＞CbuActin。在GeNorm 分析的內(nèi)參基因變異系數(shù)配對值來看，n=4 時，Vn/ (n+1)的比值最小，是最佳的內(nèi)參基因組合數(shù)量，n=2 次之，但綜合考慮實驗成本及樣品用量問題本文認(rèn)為組合使用2 個候選基因作為內(nèi)參更為合適，此前也有研究認(rèn)為以2 個或2 個以上基因為內(nèi)參更能校準(zhǔn)定量分析實驗上的系統(tǒng)偏差[35]。

萜類物質(zhì)（葉綠素、胡蘿卜素）在葉色形成過程中有重要的作用。在本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，萜類合成酶基因CfGES在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位中差異表達(dá)，可以驗證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。CbuActin是課題組前期利用同源克隆法獲得的內(nèi)參基因[17]，在‘麥緣錦楸’和灰楸葉片中其M＜1.5（M=0.790），符合作為內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)，但本研究通過軟件分析排名最好的內(nèi)參基因是CfMADH和CfEF-1。筆者分別以這2 個最適合的內(nèi)參基因及其組合來校準(zhǔn)CfGES的表達(dá)量，結(jié)果表明單獨或組合使用CfMADH和CfEF-1時，CfGES的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步表明了本實驗結(jié)果的可靠性。本研究所篩選到的最適內(nèi)參基因CfMADH和CfEF-1均為真核生物中常見的管家基因，在其他觀賞性樹種（紫薇、花葉唐竹等）的不同葉色葉片中也被報道可作為理想內(nèi)參基因[36-38]。此外，本研究材料中CfUBC和CfActin11在‘麥緣錦楸’葉片中穩(wěn)定性不佳，但在其他物種（如景寧木蘭、板栗）中卻表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性[39-40]，這些結(jié)論也體現(xiàn)了內(nèi)參基因不具有通用性的特點。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)課題組前期研究及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出7 個候選基因（CfUBC、CfActin11、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1及CbuActin），結(jié)合qRT-PCR 技術(shù)及GeNorm、NormFinder和BestKeeper等內(nèi)參分析軟件對各候選基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明CfMADH和CfEF-1是最適合‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位的內(nèi)參基因，萜類合成基因CfGES驗證了軟件分析結(jié)果的可靠性。本研究優(yōu)化了紫葳科植物‘麥緣錦楸’內(nèi)參基因的選擇，將為‘麥緣錦楸’葉色形成的分子生物學(xué)機制提供理論基礎(chǔ)，也將為課題組及其它植物研究選擇合適內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。