寇潔，李嚴(yán)，王鵬，劉紅，劉佳文，王涓，王也，張亮，沈富軍

技術(shù)與方法

大熊貓遺傳多樣性評(píng)估的微衛(wèi)星分型體系優(yōu)化

寇潔1,2，李嚴(yán)1,2，王鵬3，劉紅1,2，劉佳文1,2，王涓1,2，王也1,2，張亮1,2，沈富軍1,2

1. 成都大熊貓繁育研究基地, 成都 610081 2. 四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081 3. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010

微衛(wèi)星作為重要的分子標(biāo)記之一，已被證明在大熊貓種群規(guī)模評(píng)估、親子鑒定和遺傳多樣性分析方面是有效的。目前微衛(wèi)星標(biāo)記在大熊貓()染色體上物理定位方面的報(bào)道較少，而且缺乏微衛(wèi)星基因分型系統(tǒng)的效能評(píng)估以及PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化。本研究基于大熊貓基因組參考序列(ASM200744v2)，分析了34個(gè)大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的染色體定位特征并評(píng)價(jià)了位點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)優(yōu)化34個(gè)STR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，結(jié)合微衛(wèi)星的染色體定位數(shù)據(jù)確定了Ame-μ10標(biāo)記的較低應(yīng)用價(jià)值以及gpz-6重新篩選引物的必要性。本研究有助于提高基因分型結(jié)果的重復(fù)性和可靠性，對(duì)促進(jìn)《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》規(guī)范化應(yīng)用和制定大熊貓保護(hù)策略具有重要意義。

大熊貓；遺傳多樣性；微衛(wèi)星標(biāo)記；STR-PCR

微衛(wèi)星標(biāo)記也被稱作短串聯(lián)重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(short tandem repeats, STRs)。因其具有多等位基因、雜合度高等特點(diǎn)，在種群遺傳變異研究方面應(yīng)用廣泛，是目前大熊貓()個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、遺傳多樣性研究、種群遺傳管理、種群數(shù)量調(diào)查等領(lǐng)域[1～5]最常用的遺傳標(biāo)記。一些廣泛使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其配套引物[6～9]已被初步篩選并收錄于國(guó)家林業(yè)和草業(yè)局最新頒布的《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》(LY/T 2896—2017)，用于推動(dòng)不同科研機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和可比性，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享。

由于微衛(wèi)星分型體系缺乏檢測(cè)效能的評(píng)估以及STR-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，在使用這套技術(shù)規(guī)程時(shí)各科研機(jī)構(gòu)之間檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和數(shù)據(jù)可比性仍然有限，推廣應(yīng)用的問(wèn)題頗多。首先是收錄微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行組合應(yīng)用時(shí)未做組合應(yīng)用價(jià)值的細(xì)致評(píng)估。僅有少數(shù)微衛(wèi)星位點(diǎn)用熒光原位雜交法明確了染色體定位[10]，或用基因分型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了彼此間的連鎖情況[11]。但大多數(shù)微衛(wèi)星的染色體定位、微衛(wèi)星位點(diǎn)之間的連鎖關(guān)系以及同源序列干擾情況仍不明確。用于個(gè)體識(shí)別和遺傳多樣性評(píng)估的多個(gè)微衛(wèi)星可能位于同一染色體上處于連鎖遺傳狀態(tài)，導(dǎo)致分析結(jié)論支撐力不足。其次是技術(shù)規(guī)程對(duì)實(shí)驗(yàn)背景條件的限制不足。技術(shù)規(guī)程推薦的反應(yīng)體系中模板DNA加入量較大，而且反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的通用性不足，可能需要針對(duì)性地優(yōu)化擴(kuò)增條件。野生大熊貓保護(hù)研究領(lǐng)域嚴(yán)重依賴于非損傷性樣品采集，而這類樣品通常含有一定程度的降解DNA和PCR抑制物，模板加入量較多時(shí)易導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗和基因分型錯(cuò)誤[12]。為了提高分型結(jié)果的可靠性，需對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多次獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，直至獲得分型結(jié)果的一致性才能確定基因型[12,13]。這就要求PCR模板加入量必須預(yù)先得到優(yōu)化，使反應(yīng)體系能夠在不影響擴(kuò)增的抑制物濃度和足以進(jìn)行擴(kuò)增的目標(biāo)DNA濃度之間獲得平衡。而擴(kuò)增穩(wěn)定性和特異性的實(shí)現(xiàn)還依賴于反應(yīng)體系中各組分的配合[14]。提高引物設(shè)計(jì)質(zhì)量、調(diào)整體系組分之間的加入量通常能有效改善PCR擴(kuò)增效果。在完整度更高的基因組參考序列中評(píng)估引物擴(kuò)增特異性，并在優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增條件中驗(yàn)證引物應(yīng)用價(jià)值，將有助于提高檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。

為了更好的滿足實(shí)際應(yīng)用需求，本研究以2020年新組裝到染色體層次的大熊貓基因組參考序列(ASM200744v2)[15]為基礎(chǔ)進(jìn)行微衛(wèi)星分型體系的位點(diǎn)特征研究和應(yīng)用價(jià)值評(píng)估，并對(duì)34個(gè)常用大熊貓微衛(wèi)星的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化。本研究可為大熊貓種群遺傳保護(hù)工作提供研究基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》規(guī)范化應(yīng)用和制定大熊貓保護(hù)策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 大熊貓參考基因組

本研究涉及的大熊貓基因組參考序列為最新的ASM200744v2版本[15]。該序列發(fā)布于2020年4月20日，已組裝到染色體層次。下載路徑為：https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF002007445.1。

1.2 擬評(píng)估的大熊貓微衛(wèi)星分型體系

本研究擬評(píng)估的常用微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)源于中華人民共和國(guó)林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》(LY/T 2896—2017) (https://www.forestry.gov. cn/uploadfile/lykj/2017-11/file/2017-11-2-b7b9c90cc9aa49f0a90c8d68d556d9b9.pdf)和國(guó)家發(fā)明專利《一種應(yīng)用于大熊貓親子鑒定的試劑盒》(ZL201010277132.0)，具體信息見(jiàn)表1。這些微衛(wèi)星標(biāo)記已被證明在大熊貓群體中有較高的遺傳多態(tài)性，并被廣泛應(yīng)用于大熊貓個(gè)體識(shí)別和遺傳多樣性評(píng)估。34對(duì)微衛(wèi)星引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并依據(jù)相應(yīng)參考文獻(xiàn)在上游引物或下游引物的5′端添加熒光標(biāo)記。

表1 大熊貓微衛(wèi)星標(biāo)記信息

續(xù)表

編號(hào)1～30為《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》(LY/T 2896—2017)收錄的30對(duì)大熊貓微衛(wèi)星引物，編號(hào)31～34為國(guó)家發(fā)明專利《一種應(yīng)用于大熊貓親子鑒定的試劑盒》(ZL201010277132.0)中參考Lu等[8]補(bǔ)充的4對(duì)大熊貓微衛(wèi)星引物。

1.3 微衛(wèi)星分型體系的預(yù)測(cè)和分析

在參考基因組(ASM200744v2版本)上，利用基于基因組信息預(yù)測(cè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增特異性的Python程序(SPE.V1.py)(《微衛(wèi)星PCR引物特異性鑒定程序》，軟件著作權(quán)登記號(hào)為2021SR0150624)對(duì)表1中的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其配套引物進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。目標(biāo)為：(1)確定微衛(wèi)星位點(diǎn)在參考基因組上的染色體定位；(2)在基因組水平上查找引物同源序列并確定它們?cè)谌旧w上的位置；(3)模擬上述引物可能引起的多位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果。按照上述目標(biāo)，該程序具體分析過(guò)程如下：

(1)將基因組序列存貯在一個(gè)單獨(dú)的字典中，其中字典的鍵是染色體的編號(hào)，字典的值是染色體的序列。

(2)根據(jù)3′端堿基完全匹配個(gè)數(shù)，提取出4種形式的引物3′端堿基序列：第一種形式是上游引物3′端序列在基因組中的所有結(jié)合位點(diǎn)；第二種形式是下游引物反向互補(bǔ)后3′端序列在基因組中的所有結(jié)合位點(diǎn)；第三種形式是下游引物3′端序列在基因組中的所有結(jié)合位點(diǎn)；第四種形式是上游引物反向互補(bǔ)后3′端序列在基因組中的所有結(jié)合位點(diǎn)。

(3)羅列出(2)中第一種形式和第二種形式所有的組合結(jié)果。該組合能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物滿足的條件為：上游引物和下游引物在同一條染色體上，且上游引物位于參考基因組序列的上游。

(4)進(jìn)一步羅列出(2)中第三種形式和第四種形式所有的組合結(jié)果，該組合能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物滿足的條件為：下游引物和上游引物在同一條染色體上，且下游引物位于參考基因組序列的上游。

(5)根據(jù)設(shè)定好的參數(shù)(擴(kuò)增出的最大PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度)，預(yù)測(cè)并分析引物的擴(kuò)增情況，判定正常、疑似多位點(diǎn)擴(kuò)增、疑似連鎖的引物。

(6)預(yù)測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的染色體物理定位情況。

1.4 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

以1個(gè)大熊貓血液純化DNA樣品(譜系號(hào)678，濃度20 ng/μL，純度260/280=1.83)為模板，選擇DNA Polymerase (recombinant) (EP0406) (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、dNTP Mix (10 mmol/L each) (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)和BSA (美國(guó)Promega公司)試劑，利用ProFlex PCR system (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)儀器，將表1中34個(gè)微衛(wèi)星的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序重新進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，采用ABI3500xl遺傳分析儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離與檢測(cè)，并在儀器自帶GeneMapper@ ID-X軟件下分析等位基因型情況。

20 μL PCR反應(yīng)體系優(yōu)化：在《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》對(duì)PCR產(chǎn)物質(zhì)量要求的基礎(chǔ)上，以擴(kuò)增重復(fù)性好、目的片段亮度好、大小符合預(yù)期、目的片段附近無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增帶、操作方便為原則，在技術(shù)規(guī)程推薦PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，控制34對(duì)引物的試劑環(huán)境，組合各變量因素條件，分別篩選34對(duì)引物各自的最適反應(yīng)體系。設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)分別依次優(yōu)化最適退火溫度范圍、反應(yīng)Buffer類型、引物工作液用量、酶用量、dNTP用量、Mg2+用量和模板DNA用量。

PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化：以分型結(jié)果中特異性峰峰型正常且信號(hào)強(qiáng)度好、無(wú)明顯異常峰型、操作方便為原則，以《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》推薦PCR擴(kuò)增程序?yàn)閷?duì)照，在優(yōu)化后的最適反應(yīng)體系條件下，針對(duì)34對(duì)引物分別優(yōu)化延伸時(shí)間和擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。

1.5 最優(yōu)PCR擴(kuò)增條件的電泳效果驗(yàn)證

以1個(gè)大熊貓血液純化DNA樣品(譜系號(hào)678，濃度20 ng/μL，純度260/280=1.83)為模板，分別在兩種PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行優(yōu)化效果的驗(yàn)證。對(duì)照組按照《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》中“10.2 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序”執(zhí)行，待測(cè)組則按照本研究?jī)?yōu)化的PCR擴(kuò)增條件執(zhí)行。在各自要求的試劑品牌條件中配制反應(yīng)體系，在 ProFlex PCR system (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)儀器環(huán)境下設(shè)置退火溫度為55℃，然后進(jìn)行擴(kuò)增。5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

1.6 基因分型分析

根據(jù)1.3軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，隨機(jī)選取軟件預(yù)測(cè)結(jié)果為正常的兩對(duì)引物作為對(duì)照組，疑似多位點(diǎn)擴(kuò)增引物和疑似連鎖引物分別作為兩類待測(cè)組，以30個(gè)大熊貓血液純化DNA樣品(濃度20～60 ng/μL，純度260/280=1.13～1.97，譜系關(guān)系見(jiàn)附圖1)為模板，按照優(yōu)化后的最適反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，采用ABI3500xl遺傳分析儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離與檢測(cè)，并在儀器自帶GeneMapper@ ID-X軟件下分析等位基因型情況。先根據(jù)微衛(wèi)星目的片段長(zhǎng)度范圍和核心序列堿基重復(fù)數(shù)，確定理論上可能的目的片段長(zhǎng)度。結(jié)合軟件自動(dòng)判定基因型結(jié)果和分型圖譜，在考慮酶加A堿基效應(yīng)的前提下，對(duì)最終分型結(jié)果進(jìn)行人工校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星分型體系的預(yù)測(cè)和分析結(jié)果

引物分析結(jié)果顯示，30對(duì)引物被判定為高應(yīng)用價(jià)值的正常引物；引物Ame-μ11與panda-44被判定為疑似連鎖引物，應(yīng)用價(jià)值待實(shí)驗(yàn)評(píng)估；引物Ame- μ10和gpz-6的3′端堿基結(jié)合參考基因組非目標(biāo)位置的能力強(qiáng)，被判定為應(yīng)用價(jià)值不高的疑似多位點(diǎn)擴(kuò)增引物(附表1)。

位點(diǎn)的染色體分布預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)顯示，32個(gè)位點(diǎn)匹配上參考基因組特定區(qū)域的可能性高，被判定為單位點(diǎn)微衛(wèi)星。但Ame-μ11與panda-44在參考基因組上存在連鎖不平衡可能性，兩個(gè)預(yù)測(cè)目標(biāo)位置之間的距離為3,514,165 bp，位點(diǎn)應(yīng)用價(jià)值待實(shí)驗(yàn)評(píng)估。另外2個(gè)位點(diǎn)Ame-μ10和gpz-6在染色體上有較大概率呈現(xiàn)多位點(diǎn)分布。

表2 大熊貓染色體中32個(gè)微衛(wèi)星分布情況

“+”表示正義鏈，“–”表示反義鏈。

2.2 優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件及其驗(yàn)證結(jié)果

優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序見(jiàn)表3和表4。用大熊貓血液DNA對(duì)優(yōu)化獲得的STR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化效果驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。電泳結(jié)果顯示，待測(cè)組和對(duì)照組電泳條帶均符合《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》對(duì)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量檢測(cè)要求。但待測(cè)組模板用量為對(duì)照組的16%，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相對(duì)更少，非特異性擴(kuò)增程度更輕。

表3 優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系

*建議Ame-μ11、Panda-44和Ame-μ14按照最大DNA參考加入量執(zhí)行。

表4 優(yōu)化的PCR擴(kuò)增程序

2.3 基因分型結(jié)果

30個(gè)大熊貓血液純化DNA樣品的6個(gè)微衛(wèi)星分型結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)表5和附圖1整理出的11組親代及其子代的微衛(wèi)星分型結(jié)果見(jiàn)表6，典型分型圖譜見(jiàn)圖2。分型結(jié)果顯示(表5)，所有位點(diǎn)均獲得有效擴(kuò)增。2個(gè)疑似連鎖微衛(wèi)星(Panda-44和Ame-μ11)的分型結(jié)果不符合連鎖遺傳規(guī)律，位點(diǎn)和引物的應(yīng)用價(jià)值再評(píng)估結(jié)果良好。11組親代及其子代的微衛(wèi)星分型結(jié)果顯示(表6)，疑似多位點(diǎn)微衛(wèi)星gpz-6出現(xiàn)了2個(gè)PCR復(fù)制滑脫現(xiàn)象；對(duì)照微衛(wèi)星Ame-μ19出現(xiàn)了3個(gè)PCR復(fù)制滑脫現(xiàn)象；在11個(gè)分組內(nèi)部，其余的分型結(jié)果均符合預(yù)期，親子關(guān)系成立。分型圖譜結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度符合預(yù)期，各基因座之間擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)平衡。2個(gè)疑似連鎖微衛(wèi)星(Panda-44見(jiàn)圖2A，Ame-μ11見(jiàn)圖2B)、2個(gè)對(duì)照微衛(wèi)星(GPL-29見(jiàn)圖2C，Ame-μ19見(jiàn)圖2D)均有信號(hào)明顯的主峰，在主峰小于核心序列重復(fù)單位的位置無(wú)明顯PCR復(fù)制滑脫所形成的“stutter峰”，也無(wú)明顯非特異性峰，表明引物特異性好且PCR反應(yīng)體系組分添加比例適宜；沒(méi)有出現(xiàn)由3′端加A堿基不全所形成的比目的峰少一個(gè)堿基的“雙尖峰”，表明擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間設(shè)置合適。2個(gè)疑似多位點(diǎn)微衛(wèi)星(Ame-μ10見(jiàn)圖2E、F、G和H，gpz-6見(jiàn)圖2I、J、K和L)均有連續(xù)的多峰；主峰附近雜峰(圖2箭頭所示)的峰高或峰面積為主峰的25%～50%；在所有檢測(cè)個(gè)體的分型結(jié)果中，雜峰在主峰位置少2～8 bp處固定出現(xiàn)，排除“stutter峰”或“雙尖峰”可能性，判定為非特異性擴(kuò)增峰；非特異性峰與目的峰有融合現(xiàn)象(圖2L圓圈所示)。Ame-μ10和gpz-6的分型結(jié)果表明，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序不能消除非特異性擴(kuò)增；部分非特異性擴(kuò)增峰信號(hào)可能干擾分型結(jié)果判讀。提示Ame-μ10和gpz-6需要提升擴(kuò)增特異性，引物直接應(yīng)用價(jià)值不高。

圖1 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

M：D2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～34：與表1微衛(wèi)星編號(hào)相對(duì)應(yīng)。

表5 6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的基因分型結(jié)果

*表示分型結(jié)果不符合連鎖遺傳規(guī)律。

表6 11組親代及其子代的基因分型結(jié)果

*表示該分組內(nèi)引物的親子鑒定結(jié)果異常，可能存在一個(gè)或數(shù)個(gè)重復(fù)單元的PCR復(fù)制滑脫現(xiàn)象；#表示該等位基因均未在雙親中檢出，可能存在一個(gè)或數(shù)個(gè)重復(fù)單元的PCR復(fù)制滑脫現(xiàn)象。

3 討論

借助測(cè)序技術(shù)和各種生物信息學(xué)工具，大量微衛(wèi)星位點(diǎn)被識(shí)別并篩選用于大熊貓遺傳多樣性分析[9,16,17]。盡管相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性，但在使用成套微衛(wèi)星標(biāo)記分析大熊貓遺傳多樣性時(shí)，結(jié)論的客觀可靠性仍是個(gè)問(wèn)題。一部分原因是利用傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)方法挖掘了大量?jī)蓧A基重復(fù)標(biāo)記。而這類標(biāo)記發(fā)生滑鏈效應(yīng)的可能性較高[18]。另一部分原因是研究機(jī)構(gòu)選取的標(biāo)記組合不統(tǒng)一。由于缺乏微衛(wèi)星在染色體上的物理定位研究，選取標(biāo)記組合中的多個(gè)位點(diǎn)可能在同一染色體上連鎖。因此需要在設(shè)計(jì)微衛(wèi)星組合進(jìn)行個(gè)體識(shí)別、遺傳多樣性評(píng)估之前，先分析各位點(diǎn)的特點(diǎn)，再篩選出獨(dú)立表達(dá)的優(yōu)質(zhì)微衛(wèi)星組合。但目前僅有少量微衛(wèi)星位點(diǎn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了其在染色體上的定位或者相互之間的連鎖關(guān)系[10,11]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用終端的鑒定需求。與其他模式動(dòng)物大量的成熟微衛(wèi)星相比，大熊貓優(yōu)質(zhì)微衛(wèi)星標(biāo)記的數(shù)量有限，不利于現(xiàn)有微衛(wèi)星分型系統(tǒng)效能的進(jìn)一步提升。大熊貓基因組在染色體層次上完整度更高的組裝，彌補(bǔ)了“晶晶”基因組草圖的缺陷，為解決微衛(wèi)星物理定位需求、再評(píng)估位點(diǎn)和引物質(zhì)量提供了便利。本研究通過(guò)軟件分析，獲得了32個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在大熊貓參考基因組上的定位，并證實(shí)這些微衛(wèi)星具有一定應(yīng)用價(jià)值。該結(jié)果將為今后各機(jī)構(gòu)研究大熊貓遺傳數(shù)據(jù)奠定理論基礎(chǔ)。

圖2 6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記典型分型圖譜

A：Panda-44，譜系號(hào)717；B：Ame-μ11，譜系號(hào)717；C：GPL-29，譜系號(hào)537；D：Ame-μ19，譜系號(hào)598；E：Ame-μ10，譜系號(hào)537；F：Ame-μ10，譜系號(hào)532；G：Ame-μ10，譜系號(hào)765；H：Ame-μ10，譜系號(hào)857；I：gpz-6，譜系號(hào)1017；J：gpz-6，譜系號(hào)1016；K：gpz-6，譜系號(hào)703；L：gpz-6，譜系號(hào)801。紅色箭頭表示非特異性峰，紅色圓圈表示非特異性峰與目的峰的融合現(xiàn)象；圖橫坐標(biāo)為片段大小(bp)，縱坐標(biāo)為熒光信號(hào)強(qiáng)度。

作為全國(guó)第4次大熊貓調(diào)查的輔助調(diào)查手段，微衛(wèi)星與非損傷性遺傳取樣法的聯(lián)用對(duì)大熊貓保護(hù)研究做出了巨大貢獻(xiàn)。在大熊貓遺傳樣本采集壓力較大的現(xiàn)狀下，采取措施提升現(xiàn)有微衛(wèi)星分型體系的擴(kuò)增效率是必要的。PCR擴(kuò)增可能會(huì)因?yàn)楦鞣N原因而失敗。即使是同一物種也會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)背景條件的不同而存在差異性的最適反應(yīng)體系[19～21]。因此幾乎每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)室硬件、模板質(zhì)量和試劑供應(yīng)情況，預(yù)先優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件。缺乏統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)背景導(dǎo)致各科研機(jī)構(gòu)的分型數(shù)據(jù)不能被有效共享。對(duì)此，國(guó)家林業(yè)局制定并推動(dòng)《大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程》應(yīng)用，以期提高數(shù)據(jù)可比性。但該技術(shù)規(guī)程對(duì)試劑品牌、操作規(guī)程等實(shí)驗(yàn)背景的限制不夠明確，在強(qiáng)調(diào)靈活操作的同時(shí)也未細(xì)致篩選標(biāo)記組合以及提出針對(duì)性的優(yōu)化建議。在這種變量因素較多的條件下，模板質(zhì)量和加入量可能會(huì)顯著影響PCR擴(kuò)增結(jié)果[14,22]。因此，本研究通過(guò)控制試劑、儀器等背景條件，采取單因素考察方法調(diào)整包括酶、模板、Mg2+、引物、dNTP等在內(nèi)的多個(gè)變量因素，獲得了34套微衛(wèi)星分型體系的最適擴(kuò)增條件供研究人員參考。相對(duì)于原技術(shù)規(guī)程，不僅增加了DNA利用效率，而且提升了PCR擴(kuò)增質(zhì)量，更有利于各種應(yīng)用場(chǎng)景下鑒定結(jié)果的重現(xiàn)性和數(shù)據(jù)可比性。但需要指出的是，本研究中使用的模板為大熊貓血液純化DNA，在反應(yīng)體系中的模板加入量為參考加入量。對(duì)于非損傷性的糞便樣本，大熊貓DNA在背景DNA中的相對(duì)含量取決于研究者富集動(dòng)物細(xì)胞的效率，整體質(zhì)量則取決于樣本保存質(zhì)量以及PCR抑制物去除效率[23]。建議根據(jù)前人的方法[24～26]先盡量富集和純化大熊貓DNA并確定其在提取產(chǎn)物中的大致濃度，結(jié)合本研究中的參考加入量，再開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，相對(duì)于其他引物，Ame-μ11、Panda-44和Ame-μ14雖有一定的擴(kuò)增特異性，但目的條帶亮度難以大幅度優(yōu)化提升。這提示上述引物的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，建議涉及非損傷性DNA時(shí)慎重使用。

Ame-μ10為定位在大熊貓3號(hào)染色體近著絲粒長(zhǎng)臂端的微衛(wèi)星標(biāo)記[10]，是由Lu等[8]基于克隆和探針雜交技術(shù)從DNA文庫(kù)中篩選所得，近年來(lái)在大熊貓遺傳保護(hù)領(lǐng)域應(yīng)用頻率相對(duì)較高[1,4,27～29]。但本研究證實(shí)，引物Ame-μ10易導(dǎo)致多位點(diǎn)擴(kuò)增，且利用最優(yōu)擴(kuò)增條件不能完全消除分型結(jié)果中非特異性擴(kuò)增峰的影響。兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記更有可能發(fā)生PCR滑鏈效應(yīng)，產(chǎn)生相對(duì)較多的“stutter”峰產(chǎn)物[18]。而過(guò)多的“stutter”峰產(chǎn)物將會(huì)增加峰型判斷難度，導(dǎo)致分型錯(cuò)誤率上升[30,31]。在電泳分析雜合子時(shí)，兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記也會(huì)因等位基因堿基差異較小而增加分型判斷的難度。因此喬麥菊等[5]主張加大對(duì)穩(wěn)定性更強(qiáng)的四堿基標(biāo)記的使用。本研究分析了3對(duì)兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星引物，其中Ame-μ19出現(xiàn)了相對(duì)高頻的PCR滑鏈效應(yīng)，導(dǎo)致這部分分型結(jié)果不符合親子關(guān)系的理論預(yù)期(表6)。而已經(jīng)開展的野外大熊貓遺傳多樣性研究大多以兩堿基微衛(wèi)星為主，從提升技術(shù)規(guī)程系統(tǒng)效能的角度考慮，繼續(xù)利用兩堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)以及重新篩選引物的意義不大。四堿基重復(fù)的gpz-6是Huang等[9]根據(jù)大熊貓“晶晶”基因組草圖篩選所得，因其在非損傷性樣本來(lái)源DNA的PCR擴(kuò)增中表現(xiàn)良好而備受關(guān)注[3,4,9,32]。本研究結(jié)果中，引物gpz-6理論上結(jié)合參考基因組非目標(biāo)位置的能力較強(qiáng)；分型結(jié)果中非特異性擴(kuò)增峰不易被消除且存在干擾目的峰信號(hào)的可能性(圖2L)；在11組親子關(guān)系的鑒定結(jié)果中，有2組親子(表6)的基因分型結(jié)果不符合理論預(yù)期。gpz-6位點(diǎn)應(yīng)用價(jià)值雖高，但有重新提升引物設(shè)計(jì)質(zhì)量的必要性。

綜上所述，本研究通過(guò)序列比對(duì)，獲取了32個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的染色體定位信息；優(yōu)化微衛(wèi)星分型的PCR擴(kuò)增條件，確定了Ame-μ10標(biāo)記的較低應(yīng)用價(jià)值以及引物gpz-6重篩選的必要性。但本研究涉及的樣本量較少，對(duì)標(biāo)記應(yīng)用價(jià)值的評(píng)估方法較為單一。大熊貓參考基因組序列完整度還存在繼續(xù)提升的可能性。在未來(lái)的研究中可以借助大量個(gè)體的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，應(yīng)從多個(gè)角度綜合分析微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值，并采用其他測(cè)序數(shù)據(jù)解讀工具輔助判斷微衛(wèi)星組合的檢測(cè)系統(tǒng)效能。需要指出的是，本研究中部分引物的設(shè)計(jì)長(zhǎng)度與匹配到參考基因組上的序列長(zhǎng)度有出入(表2)，優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件不能完全消除非特異性擴(kuò)增情況(圖1)。這提示過(guò)去一直使用的微衛(wèi)星引物可能需要繼續(xù)優(yōu)化設(shè)計(jì)質(zhì)量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究分析了6對(duì)微衛(wèi)星引物在30個(gè)DNA中的基因分型圖譜。受研究條件限制，未能繼續(xù)分析其余28對(duì)微衛(wèi)星引物。在未來(lái)的研究中，還需要進(jìn)一步評(píng)估這些引物的應(yīng)用價(jià)值，繼續(xù)提升微衛(wèi)星分型的系統(tǒng)效能。

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[1] Ma TX, Hu YB, Russo IRM, Nie YG, Yang TY, Xiong LJ, Ma S, Meng T, Han H, Zhang XM, Bruford MW, Wei FW. Walking in a heterogeneous landscape: dispersal, gene flow and conservation implications for the giant panda in the Qinling Mountains., 2018, 11(10): 1859– 1872.

[2] Qiao MJ, Zhou YM, Connor T, Li RG, Tang D, Zhang HM, Ran JH. Diagnosing zygosity in giant panda twins using short tandem repeats., 2018, 21(6): 527–532.

[3] Qiao MJ, Connor T, Shi XG, Huang J, Huang Y, Zhang HM, Ran JH. Population genetics reveals high con-nectivity of giant panda populations across human distur-bance features in key nature reserve., 2019, 9(4): 1809–1819.

[4] Dai QL, Li JW, Yang Y, Li M, Zhang K, He LY, Zhang J, Tang B, Liu HP, Li YX, Zhu LF, Yang ZS, Dai Q. Genetic diversity and prediction analysis of small isolated giant panda populations after release of individuals., 2020, 16: 1176934320939945.

[5] Qiao MJ, Ran JH, Zhang HM. The application of micro-satellite markers in giant panda research., 2019, 39(1): 103–110.

喬麥菊, 冉江洪, 張和民. 微衛(wèi)星標(biāo)記在大熊貓研究中的應(yīng)用進(jìn)展. 獸類學(xué)報(bào), 2019, 39(1): 103–110.

[6] Shen FJ, Watts P, Zhang ZH, Zhang AJ, Sanderson S, Kemp SJ, Yue BS. Enrichment of giant panda microsate-llite markers using dynal magnet beads., 2005, 32(5): 457–62.

沈富軍, Phill Watts, 張志和, 張安居, Stephanie San-derson, Steve J. Kemp, 岳碧松. Dynal磁珠富集大熊貓微衛(wèi)星標(biāo)記. 遺傳學(xué)報(bào), 2005, 32(5): 457–462.

[7] Zhang YP, Wang W, Su B, Fan ZY, Zhang HM, He TM, Ryder OA. Screening and application of giant panda microsatellite DNA., 1995, 16(4): 301–306.

張亞平, 王文, 宿兵, 范志勇, 張和民, 何廷美, Oliver A. Ryder. 大熊貓微衛(wèi)星DNA的篩選及其應(yīng)用. 動(dòng)物學(xué)研究, 1995, 16(4): 301–306.

[8] Lu Z, Johnson WE, Menotti-Raymond M, Yuhki N, Martenson JS, Mainka S, Huang SQ, Zheng ZH, Li GH, Pan WS, Mao XR, O’Brien SJ. Patterns of genetic diversity in remaining giant panda populations., 2001, 15(6): 1596–1607.

[9] Huang J, Li YZ, Du LM, Yang B, Shen FJ, Zhang HM, Zhang ZH, Zhang XY, Yue BS. Genome-wide survey and analysis of microsatellites in giant panda (), with a focus on the applications of a novel microsatellite marker system., 2015, 16(1): 61.

[10] 田亮. 應(yīng)用微衛(wèi)星進(jìn)行大熊貓親子鑒定及微衛(wèi)星在染色體上的物理定位[學(xué)位論文]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[11] Wu H, Zhan XJ, Zhang ZJ, Zhu LF, Yan L, Li M, Wei FW. Thirty-three microsatellite loci for noninvasive genetic studies of the giant panda ()., 2009, 10: 649–652.

[12] Taberlet P, Griffin S, Goossens B, Questiau S, Manceau V, Escaravage N, Waits LP, Bouvet J. Reliable genotyping of samples with very low DNA quantities using PCR., 1996, 24(16): 3189–3194.

[13] Navidi W, Arnheim N, Waterman MS. A multiple-tubes approach for accurate genotyping of very small DNA samples by using PCR: statistical considerations., 1992, 50(2): 347–359.

[14] Ghaffari S, Hasnaoui N. Microsatellite amplification in plants: optimization procedure of major PCR components., 2013, 1006: 139–146.

[15] Fan HZ, Wu Q, Wei FW, Yang FT, Ng BL, Hu YB. Chromosome-level genome assembly for giant panda provides novel insights into Carnivora chromosome evolution., 2019, 20(1): 267.

[16] Tu HM, Zhou C, Wang GN, Cheng ML, Yue BS, Meng Y. Development of polymorphic microsatellite markers forbased on RNA-sequencing., 2020, 39(1): 15–22.

涂洪梅, 周闖, 王冠楠, 成美玲, 岳碧松, 孟楊. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的大熊貓多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選. 四川動(dòng)物, 2020, 39(1): 15–22.

[17] Song XH, Shen FJ, Huang J, Huang Y, Du LM, Wang CD, Fan ZX, Hou R, Yue BS, Zhang XY. Transcriptome-Derived tetranucleotide microsatellites and their associated genes from the giant panda ()., 2016, 107(5): 423–430.

[18] Morin PA, Chambers KE, Boesch C, Vigilant L. Quantitative polymerase chain reaction analysis of DNA from noninvasive samples for accurate microsatellite genotyping of wild chimpanzees ()., 2001, 10(7): 1835–1844.

[19] Wang ZY, Guo HL, Liu JX. Optimization of SSR-PCR system onspp. by orthongonal design., 2007, 5(z1): 201–206.

王志勇, 郭海林, 劉建秀. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化狗牙根SSR-PCR反應(yīng)體系. 分子植物育種, 2007, 5(z1): 201–206.

[20] Patiguli M, Zhang YH, LI PY, Abulaiti. Preliminary analysis on optimization of EST-SSR PCR reaction system and genetic diversity forL., 2014, 37(2): 112–118.

帕提古麗·麥麥提敏, 張延輝, 李培英, 阿不來(lái)提. 狗牙根EST-SSR反應(yīng)體系優(yōu)化及其遺傳多樣性初步分析. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 37(2): 112–118.

[21] Long T, Huang CQ, Liu GD. Optimization of SSR-PCR reaction system forby orthogonal design., 2016, 35(1): 198–205.

龍?zhí)? 黃春瓊, 劉國(guó)道. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化狗牙根SSR-PCR反應(yīng)體系. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(1): 198– 205.

[22] Johnson PCD, Haydon DT. Maximum-likelihood estimation of allelic dropout and false allele error rates from microsatellite genotypes in the absence of reference data., 2007, 175(2): 827–842.

[23] Shan L, Hu YB, Wei FW. Opportunities and challenges of fecal DNA technology in molecular ecology researches., 2018, 38(3): 235–246.

單磊, 胡義波, 魏輔文. 糞便DNA分析技術(shù)在分子生態(tài)學(xué)研究中的機(jī)遇與挑戰(zhàn). 獸類學(xué)報(bào), 2018, 38(3): 235–246.

[24] Zhu Y, Liu HY, Yang HQ, Li YD, Zhang HM. Factors affecting genotyping success in giant panda fecal samples., 2017, 5: e3358.

[25] Wan QH, Zhu L, Wu H, Fang SG. Major histocompatibility complex class II variation in the giant panda ()., 2006, 15(9): 2441–2450.

[26] Zhang BW, Wei FW, Li M, Lü XP. A simple protocol for DNA extraction from faeces of the giant panda and lesser panda., 2004, 50(3): 452–458.

張保衛(wèi), 魏輔文, 李明, 呂曉平. 大熊貓和小熊貓糞便DNA提取的簡(jiǎn)易方法. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2004, 50(3): 452–458.

[27] Zhu LF, Hu YB, Qi DW, Wu H, Zhan XJ, Zhang ZJ, Bruford MW, Wang JL, Yang XY, Gu XD, Zhang L, Zhang BW, Zhang SN, Wei FW. Genetic consequences of historical anthropogenic and ecological events on giant pandas., 2013, 94(10): 2346–2357.

[28] Shan L, Hu YB, Zhu LF, Yan L, Wang CD, Li DS, Jin XL, Zhang CL, Wei FW. Large-scale genetic survey provides insights into the captive management and reintroduction of giant pandas., 2014, 31(10): 2663–2671.

[29] Hu YB, Nie YG, Wei W, Ma TX, Van Horn R, Zheng XG, Swaisgood RR, Zhou ZX, Zhou WL, Yan L, Zhang ZJ, Wei FW. Inbreeding and inbreeding avoidance in wild giant pandas., 2017, 26(20): 5793–5806.

[30] Taberlet P, Waits LP, Luikart G. Noninvasive genetic sampling: look before you leap., 1999, 14(8): 323–327.

[31] Bowler DE, Benton TG. Causes and consequences of animal dispersal strategies: relating individual behaviour to spatial dynamics., 2005, 80(2): 205–225.

[32] Guo W, Mishra S, Wang CD, Zhang HM, Ning RH, Kong FL, Zeng B, Zhao JC, Li Y. Comparative study of gut microbiota in wild and captive giant pandas ()., 2019, 10(10): 827.

附圖1 30個(gè)大熊貓的譜系關(guān)系圖

Supplementary Fig. 1 The pedigree diagram of 30 giant pandas

在Pedigraph軟件(https://animalgene.umn.edu/download-pedigraph)制作的譜系關(guān)系圖中，每個(gè)個(gè)體都由一個(gè)節(jié)點(diǎn)來(lái)表示。節(jié)點(diǎn)內(nèi)的標(biāo)簽是個(gè)體的譜系號(hào)。圓圈表示雌性，方形表示雄性。用彩色線將子代與其親代聯(lián)系起來(lái)?；疑?jié)點(diǎn)代表本實(shí)驗(yàn)涉及的30只大熊貓。

附表1 兩對(duì)微衛(wèi)星引物(Ame-μ10、gpz-6)的擴(kuò)增情況