趙三增，孔丹宇，辛培勇，褚金芳,5，萬迎朗，凌宏清，劉毅,4

研究報告

AtCPS V326M突變顯著影響赤霉素合成

趙三增1，孔丹宇2，辛培勇3，褚金芳3,5，萬迎朗1，凌宏清4,5，劉毅2,4

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570228 2. 中國科學(xué)院廬山植物園，江西廬山 332900 3. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，國家植物基因研究中心(北京)，中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，北京 100101 4. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點實驗室，中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，北京 100101 5. 中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，北京 100039

赤霉素(gibberellins, GA)是植物激素之一，調(diào)控植物生長和發(fā)育。植物體中赤霉素合成量直接影響植物的形態(tài)和生物量。在赤霉素合成途徑中，柯巴基焦磷酸合酶基因(copalyl diphosphate synthase,)是第一個合酶基因，該基因突變會嚴(yán)重影響赤霉素合成量。本研究通過對根和下胚軸縮短、晚花、叢生、矮化的擬南芥()突變體進(jìn)行圖位克隆，鑒定出的一個等位基因。該等位基因的突變位點是基因的第2768位核苷酸，鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致AtCPS蛋白萜類合酶(Terpene_synth)結(jié)構(gòu)域中的第326位纈氨酸(V)突變成蛋氨酸(M)。通過等位分析確定是的等位基因。遺傳互補實驗顯示AtCPS V326M突變導(dǎo)致植物叢生、矮化等發(fā)育缺陷表型。赤霉素含量測定結(jié)果證明AtCPS V326M突變導(dǎo)致赤霉素的合成量減少。外施赤霉素實驗結(jié)果表明，外施赤霉素能恢復(fù)擬南芥突變體赤霉素合成量降低導(dǎo)致的植株叢生、矮化等發(fā)育缺陷表型。因此，本研究為通過定點突變赤霉素合成酶基因的特定位點改變赤霉素含量來塑造植物理想株高和株型提供理論指導(dǎo)。

赤霉素；基因；根長；株型；株高

赤霉素(gibberellins, GA)是植物經(jīng)典激素之一，主要控制種子萌發(fā)、莖干伸長以及葉片、花和種子發(fā)育等重要過程[1,2]，對植物生長和發(fā)育起著關(guān)鍵調(diào)控作用。在擬南芥()中，赤霉素缺失時，DELLA蛋白與響應(yīng)GA信號促進(jìn)植物生長的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使這些轉(zhuǎn)錄因子不能行使轉(zhuǎn)錄活性，抑制植株生長[3]。當(dāng)赤霉素與其受體GID1結(jié)合，會與DELLA蛋白形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體，E3泛素連接酶復(fù)合體SCFSLY1識別并結(jié)合GA-GID1- DELLA復(fù)合體中的DELLA蛋白，將其泛素化，促使DELLA蛋白通過26S蛋白降解途徑降解，釋放與DELLA蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，啟動GA信號響應(yīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)植株生長[4]。

赤霉素是一類雙萜次生代謝物，目前共發(fā)現(xiàn)136種，按照其發(fā)現(xiàn)順序，分別被命名為GA1～GA136，可分為含20個碳原子和19個碳原子兩大類[1,5,6]。其中具有生物學(xué)活性的赤霉素主要有GA1、GA3、GA4和GA7，都屬于含19個碳原子類赤霉素。在絕大多數(shù)植物中，GA1和GA4是最主要的活性赤霉素形式，并且GA4的活性顯著高于GA1[6]。赤霉素的合成以牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGDP)為前體，整個合成途徑可按照合成場所分為3個階段：第一階段是位于前質(zhì)體的可溶性酶柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase, CPS)和貝殼杉烯合酶(ent-kaurene synthase, KS)將牻牛兒基焦磷酸催化成貝殼杉烯[7]；第二階段是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中貝殼杉烯先被氧化成赤霉素的通用前體GA12，并進(jìn)一步被不同的細(xì)胞色素P450單氧化酶催化成多種不同的赤霉素形式或其中間體；第三階段是由位于細(xì)胞質(zhì)中多基因家族的加雙氧酶GA20氧化酶(GA20ox)、GA3氧化酶(GA3ox)以及GA2氧化酶(GA2ox)依次完成。通過GA20ox和GA3ox的催化作用，生成具有生物學(xué)活性的GA1和GA4，而GA2ox則是將GA1和GA4代謝成不具有生物學(xué)活性的赤霉素[5,8]。

在被子植物中，和兩個獨立的雙萜合酶基因，分別編碼CPS蛋白和KS蛋白[9]。其中，CPS含有保守結(jié)構(gòu)域DXDD，屬于第二類雙萜合酶，催化完成赤霉素合成途徑中的第一步反應(yīng)，使?fàn)脚夯沽姿嵝纬山沽姿峥掳王5,6]。焦磷酸柯巴酯進(jìn)一步被歸屬第一類雙萜合酶的KS催化成貝殼杉烯。這兩個酶共同作用完成赤霉素合成的第一階段。而在苔蘚等低等植物中，CPS/KS雙萜合酶被認(rèn)為是CPS和KS的融合蛋白，同時存在CPS的保守結(jié)構(gòu)域DXDD和KS的保守結(jié)構(gòu)域DDXXD，是一個既具有CPS酶活又具有KS酶活的雙功能雙萜合酶，可直接將牻牛兒基焦磷酸催化成貝殼杉烯。該酶單獨完成赤霉素合成的第一階段[10]。擬南芥中基因(At4g02780)只有一個拷貝，該基因也被稱為基因，突變后會導(dǎo)致種子萌發(fā)困難，植株極度矮小，葉片小而深綠，花瓣、萼片和雌蕊嚴(yán)重發(fā)育不全、雄性敗育，外施赤霉素可以恢復(fù)突變體表型[7]。過表達(dá)基因，可以顯著提高植株中內(nèi)根–貝殼杉烯和內(nèi)根–貝殼杉烯酸含量，但不影響赤霉素合成途徑中內(nèi)根–貝殼杉烯酸之后的中間產(chǎn)物和活性赤霉素的含量[9]。水稻中有4個基因(～)，其中、負(fù)責(zé)將牻牛兒基焦磷酸催化成內(nèi)根–焦磷酸柯巴酯，是一個假基因，將牻牛兒基焦磷酸轉(zhuǎn)化成同向–焦磷酸柯巴酯。進(jìn)一步研究表明在水稻中基因主要參與赤霉素的合成，而和參與植保素的合成[11～14]。

20世紀(jì)60年代開始的第一次綠色革命，就是利用水稻(L)中的赤霉素合成基因和小麥(L)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的優(yōu)異等位基因培育出矮桿、抗倒伏、高產(chǎn)新品種，極大推動了糧食產(chǎn)量的提升[15,16]。這些研究表明赤霉素對農(nóng)作物的株型、育性以及收獲指數(shù)影響很大。因此，發(fā)掘赤霉素合成量適度的農(nóng)作物基因型仍然是提高作物產(chǎn)量切實可行的辦法之一。本研究在擬南芥EMS (ethyl methyl sulfone)誘變突變體庫中通過圖位克隆的方法克隆了一個等位突變基因。在該突變體中，等位基因的第2768位核苷酸由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)使AtCPS第326位纈氨酸突變成蛋氨酸，致使突變體中赤霉素合成量明顯的降低以及株型顯著改變。本研究結(jié)果以期為如何改善農(nóng)作物赤霉素合成量，構(gòu)建赤霉素合成量適度的農(nóng)作物新品種提供新思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)方法

本研究所用的植物材料是由本實驗室保存的擬南芥的兩種生態(tài)型Columbia-0 (Col-0)和Landsberg(Ler)；突變體是本實驗室保存的基因的T-DNA插入缺失突變體。突變體從擬南芥EMS誘變突變體庫中(Col-0背景)篩選獲得。擬南芥培養(yǎng)基平板培養(yǎng)：將消毒后的擬南芥種子播種在1/2 MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基上，豎直傾斜30°放置在22℃培養(yǎng)箱中，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為15,000 Lx。擬南芥土中培養(yǎng)：將10 d的擬南芥幼苗移栽到培養(yǎng)土中，放置在22℃培養(yǎng)間，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為15,000 Lx。

1.2 菌株、質(zhì)粒、引物合成

本實驗所用的菌株包括：大腸桿菌菌株DH5α；農(nóng)桿菌菌株GV3101；本實驗所用的轉(zhuǎn)化載體為；本研究所有引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 根長和下胚軸測定實驗

對在22℃、16 h光照/8 h黑暗條件下1/2 MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)10 d的擬南芥幼苗的主根和下胚軸的長度進(jìn)行測定，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)每個基因型不少于20株。根長和下胚軸的顯著性差異的統(tǒng)計分析采用-test檢驗。

1.4 F2群體構(gòu)建

利用擬南芥Col-0為母本，突變體為父本進(jìn)行雜交，雜交F1植株用來驗證突變基因的顯隱性，雜交F1植株自交后得到的F2群體用來考察性狀分離比。以Ler為母本，突變體為父本進(jìn)行雜交得到雜交F1植株，F(xiàn)1植株經(jīng)自交一代獲得F2分離群體，選取矮化單株用于后續(xù)圖位克隆。

1.5 圖位克隆

圖位克隆方法詳見參考文獻(xiàn)[17]，分子標(biāo)記引物序列見表1。

1.6 擬南芥基因組DNA、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取擬南芥Col-0植株幼嫩蓮座葉，放入2 mL離心管中，細(xì)胞破碎儀破碎后，加入500 μL 65℃預(yù)熱的CTAB溶液，振蕩搖勻。65℃水浴中放置20 min。冷卻至室溫后，加入300 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻。1000 r/min離心10 min，吸上層液體至新離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻。–20℃放置40 min。12,000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用70%乙醇清洗1～2次，干燥后加入超純水溶解，放入–80℃儲存。

表1 分子標(biāo)記引物序列

取擬南芥Col-0植株幼嫩蓮座葉，使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)依照說明書提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄使用SuperScript III Reverse Transcriptase試劑盒(美國Invitrogen公司)，使用方法參照說明書。

1.7 ga1-168遺傳互補載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選

利用引物p-I LP(5′-GTTTTG-CAAACTCGATCTAC-3′)和p-I(5′-GGCTTTAAAAAGCTCTGT-3′)，以Col-0基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增基因的啟動子區(qū)。用引物CDS-I(5′-ATGTCT-CTTCAGTATCATG-3′)和CDS-I(5′-CTAGACTTTTTGAAACAAG-3′)，以反轉(zhuǎn)錄的Col-0 cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出的基因編碼區(qū)。通過酶切連接的方法，將啟動子和編碼區(qū)片段連接到載體中。將連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，轉(zhuǎn)化載體經(jīng)擴(kuò)繁后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中。取生長狀況良好，有大量花苞的突變體植株，通過滴花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植株，利用Kan抗性篩選獲得互補株系。

1.8 CPS蛋白序列的比對

小立碗蘚()、江南卷柏()、無油樟()、甜菜()、甘藍(lán)()、毛果楊()、大豆()、葡萄()、水稻、玉米()和高粱() CPS蛋白序列在Ensemble Plants (https://plants.ensembl.org/index.html)通過AtCPS蛋白比對獲得，CPS蛋白序列比對結(jié)果通過Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)完成。

1.9 GA3噴施實驗

對土中培養(yǎng)2周的擬南芥幼苗，噴施50 μmol/L GA3，每天噴施一次，連續(xù)噴施7 d后觀察表型。

1.10 赤霉素測定

赤霉素的定量測定方法參照文獻(xiàn)[18]。取土里正常培養(yǎng)30 d的野生型Col-0和突變體地上部，在研缽中用液氮充分研磨后，用90%的甲醇水溶液提取100 mg的液氮研磨粉末，加入需要檢測GA的標(biāo)記物各2 ng作為內(nèi)參。將赤霉素初提物通過固相萃取柱萃取后融入40%甲醇中，通過UPLC- MS/MS進(jìn)行定量檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 ga1-168的突變基因是AtCPS基因

通過篩選擬南芥Col-0 EMS誘變突變體庫，篩選出一個突變株(圖1：A和B)。該突變體生長1周的幼苗根較野生型短，為野生型根長的4/5；下胚軸的長度也較野生型短，僅為野生型的2/5 (圖1C)。在16 h光照/8 h黑暗的光照條件下，突變體的抽薹時間比野生型晚一周左右。株型呈叢生狀，株高是野生型的一半(圖1D)。以野生型Col-0和為親本，構(gòu)建F2分離群體，在1348株F2植株中呈現(xiàn)突變體表型(根短、下胚軸短、晚花)的個體為342株，其余1006個植株表型與野生型相近。經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)F2群體分離比符合3∶1的理論值(c2=0.0989，c20.05,1=3.84)，由此推測，突變體表型是受單個隱性基因控制。

利用擬南芥Ler生態(tài)型與雜交得到的F2分離群體進(jìn)行圖位克隆，突變體基因定位于4號染色體短臂的SSLP分子標(biāo)記CIW5與F2C21之間。通過進(jìn)一步遺傳精細(xì)定位分析，將突變基因定位于CAPS分子標(biāo)記T5J8I和T5J8178 III之間。通過對這兩個分子標(biāo)記之間的9個基因進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)突變位點位于基因的第7個外顯子的第2768位，核苷酸從鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致AtCPS蛋白第326位的纈氨酸(V)突變成蛋氨酸(M)。經(jīng)Pfam domain分析，發(fā)現(xiàn)V326位于Terpene_ synth(272～478 aa)結(jié)構(gòu)域中(圖2)。

圖1 突變體ga1-168的表型分析

A：Col-0和幼苗在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d的根長表型；B：Col-0和幼苗在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d后主根長度統(tǒng)計分析；C：Col-0和幼苗在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d后下胚軸長度統(tǒng)計分析；D：Col-0和幼苗在土中生長的株高表型。誤差線上方不同的小寫字母標(biāo)示代表彼此間有統(tǒng)計學(xué)差異(<0.05)，若無標(biāo)示或用相同字母標(biāo)示則代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 突變體ga1-168的圖位克隆

黑色豎線代表分子標(biāo)記；虛線指示為兩標(biāo)記間區(qū)段的放大；黑色方框代表外顯子，黑色方框之間的線代表內(nèi)含子；淡黃色方框代表AtCPS蛋白的(Terpene_synth) (272～478 aa)結(jié)構(gòu)域，其中第326位的纈氨酸(V)突變成蛋氨酸(M)。紅色圓點代表染色體著絲粒，藍(lán)色方框代表AtCPS蛋白的萜類合酶C (Terpene_synth_C) (522～596 aa)結(jié)構(gòu)域。

2.2 V326在植物進(jìn)化過程中高度保守

為檢測V326的保守性，利用AtCPS的蛋白序列在EnsemblePlants網(wǎng)站比對，獲取小立碗蘚、江南卷柏、無油樟、甜菜、甘藍(lán)、毛果楊、大豆、葡萄、水稻、玉米和高粱共11個物種的17個同源基因。通過Clustal Omega比對發(fā)現(xiàn)，V326位點在所檢測物種的同源基因中都是保守的。僅在參與植保素合成，而不參與赤霉素合成的水稻OsCPS4蛋白中該位點突變演化成亮氨酸(L)(圖3)。該結(jié)果提示V326位點對CPS的蛋白功能十分重要。

圖3 CPS V326區(qū)域比對結(jié)果

利用Clustal Omega在17個物種中對CPS蛋白序列進(jìn)行比對，紅色*代表V326位點，最后的一列數(shù)字代表其左側(cè)氨基酸在CPS蛋白中的位置。Pp：小立碗蘚；Sm：江南卷柏；Atr：無油樟；Bv：甜菜；Bo：甘藍(lán)；Pt：毛果楊；Gm：大豆；Vv：葡萄；Os：水稻；Zm：玉米；Sb：高粱。

2.3 AtCPS V326M導(dǎo)致ga1-168生長發(fā)育缺陷表型

為確定基因突變導(dǎo)致了的表型，本研究采用基因的啟動子驅(qū)使自身的基因編碼序列，通過轉(zhuǎn)基因的方式構(gòu)建出互補株系com。comT2代純合單插入株系的根長與野生型Col-0一致(圖4A)，株型和株高也與野生型一致(圖4：B和C)，這說明基因能完全互補突變體的生長發(fā)育缺陷表型。將T-DNA插入突變體與進(jìn)行雜交，雜交F1植株的根長與一致(圖4：B和C)，F(xiàn)1植株的株型和株高也與一致(圖4A)，等位分析表明與的突變基因是等位基因。

2.4 ga1-168赤霉素合成量顯著降低

是擬南芥赤霉素合成途徑中的第一個關(guān)鍵基因，直接影響擬南芥的赤霉素合成量。的表型也暗示在中赤霉素合成量減少。采集在16 h光照/8 h黑暗條件下生長30 d的Col-0和的地上部分材料，通過質(zhì)譜檢測赤霉素合成途徑的14種關(guān)鍵赤霉素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Col-0中的赤霉素含量普遍高于。其中GA12、GA15、GA34在Col-0中的含量分別為0.603±0.048 ng/g、0.505±0.007 ng/g、1.000±0.071 ng/g，而在中的含量僅為0.019±0.004 ng/g、0.246±0.015 ng/g、0.149±0.018 ng/g (表2)。另外，GA4、GA9、GA20、GA24、GA44、GA51在Col-0中的含量分別為0.466±0.026 ng/g、0.207±0.014 ng/g、0.399±0.013 ng/g、1.550±0.081 ng/g、0.220±0.026 ng/g、0.732±0.059 ng/g，而中則沒有檢測到這幾種赤霉素(表2)。其余的赤霉素GA1、GA7、GA8、GA19和GA53在Col-0和的樣品中都沒有被檢測到。

圖4 突變體ga1-168突變基因的確定

A：土中生長40 d的Col-0、、突變體、互補植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1的株高表型；B：Col-0、、突變體、互補植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d的根長表型；C：Col-0、、突變體、互補植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1根長表型的統(tǒng)計分析；D：對移栽到土里的和小苗連續(xù)噴施GA37 d后的表型。誤差線上方不同的小寫字母標(biāo)示代表彼此間有統(tǒng)計學(xué)差異(<0.05)，若無標(biāo)示或用相同字母標(biāo)示則代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 Col-0和ga1-168中赤霉素含量(ng/g FW)

ND：未檢測到。

2.5 外施赤霉素GA3可以恢復(fù)ga1-168表型

為進(jìn)一步確認(rèn)的株型和株高的表型是由于赤霉素缺失導(dǎo)致，本研究對移栽到土里的和小苗噴施50 μmol/L GA3，連續(xù)噴施7 d后，在株型和株高上都與野生型Col-0一致，而的表型僅得到部分恢復(fù)(圖4D)。結(jié)果表明，的叢生株型和較矮株高的表型是由赤霉素缺失導(dǎo)致。

3 討論

3.1 CPS基因的進(jìn)化

藻類低等生物中可能沒有赤霉素的內(nèi)源合成，因為比對發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻()沒有的同源基因。基因在細(xì)菌、真菌和植物中廣泛存在。基因存在方式主要有兩種：一種是在真菌和苔蘚植物中的CPS/KS融合蛋白，同時具有CPS和KS酶的酶活；另外一種方式是細(xì)菌和維管植物中獨立的CPS蛋白。基因在某些物種中還演化成多個同源基因，如在江南卷柏、毛果楊和水稻中都有3個基因。已有報道證實水稻的3個基因中，僅參與赤霉素的合成途徑，而與已特化成合成植保素的合成基因[11～14]。江南卷柏也有同源基因存在功能特化，不再參與赤霉素的合成[19]。這預(yù)示毛果楊中的某些基因也有可能不再參與赤霉素合成。另外，雖然處于植物進(jìn)化不同階段的江南卷柏、毛果楊和水稻都有3個基因，但這些物種中基因的復(fù)制應(yīng)該是獨立進(jìn)行的。因為處于這3個物種進(jìn)化中間的一些物種，如無油樟、大豆以及玉米等都只有一個基因。

3.2 V326對CPS酶活的重要性

本研究發(fā)現(xiàn)AtCPS蛋白的326位氨基酸從纈氨酸(V)突變成蛋氨酸(M)后，擬南芥合成赤霉素的能力顯著下降，這一結(jié)果暗示V326對AtCPS酶活十分重要。V326處于萜類合酶(Terpene_synth)結(jié)構(gòu)域中，在檢測的植物CPS中(除OsCPS4外)該位點高度保守，且與V326相鄰的P325和D327也都是保守的。這暗示該區(qū)域可能對CPS的功能十分重要。蛋白結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明雖然V326不參與底物的直接結(jié)合，但其所處位置卻與底物發(fā)生成環(huán)反應(yīng)的位置十分接近[20]。因此，V326M突變有可能直接影響底物的成環(huán)反應(yīng)效率。另外，雖然纈氨酸與蛋氨酸的極性相同，但蛋氨酸的側(cè)鏈較纈氨酸側(cè)鏈長，除V326可能直接影響到CPS酶活外，較長的側(cè)鏈影響底物的結(jié)合效率或裝載效率，這也可能是導(dǎo)致CPS酶活下降的原因。除此之外，經(jīng)Alphafold分析CPS的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)V326與D110可以形成一個氫鍵[21]，該氫鍵可能對保持CPS酶活非常重要，所以V326M會嚴(yán)重影響CPS酶活。

3.3 赤霉素是影響糧食產(chǎn)量的重要激素

赤霉素作為經(jīng)典的植物激素之一，參與植物的生長發(fā)育過程。帶來第一次綠色革命的是利用水稻赤霉素合成基因和小麥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的優(yōu)異等位變異，其中基因編碼GA20ox，該基因的突變導(dǎo)致水稻中的赤霉素合成量減少，優(yōu)異等位變異使水稻植株變矮、抗倒伏、高產(chǎn)、收獲指數(shù)顯著提高[15,16]。但這并不表示赤霉素在糧食產(chǎn)量上的潛力已經(jīng)被完全挖掘。Hu等[22]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻基因，得到一系列高產(chǎn)的突變體。本研究發(fā)現(xiàn)的V326位點是一個影響AtCPS酶活的關(guān)鍵位點，該位點的突變會顯著降低體內(nèi)赤霉素的合成量。因此，可以通過定點編輯糧食作物中基因的這一位點或其他一些影響CPS酶活的關(guān)鍵位點[20,23]，實現(xiàn)糧食作物最適赤霉素合成量，從而進(jìn)一步提高糧食作物的收獲指數(shù)和產(chǎn)量。

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AtCPS V326M significantly affect the biosynthesis of gibberellins

Sanzeng Zhao1, Danyu Kong2, Peiyong Xin3, Jinfang Chu3,5, Yinglang Wan1, Hong-Qing Ling4,5, Yi Liu2,4

Gibberellins are a class of typical phytohormones, which regulate plant growth and development. The contents of gibberellins dramatically affect the morphology and biomass of plant. The encoding protein of copalyl diphosphate synthasegene() catalyzes the first-step in the biosynthetic pathway of gibberellins. The mutation in this gene may significantly affect the contents of gibberellins in plants. In this study, we found an EMS-triggered mutant,, showing short roots, short hypocotyls, late flowering and dwarf. Map-based cloning revealed that the causal gene ofwas, an allele ofgene. The encoding protein ofwas AtCPS V326M which was resulted from a single-point mutation (guanine to adenine at nucleotide 2768) ofgene. Protein domain analysis showed that V326 was located in the Terpene_synth domain. The allelism test demonstrated thatwas an allele ofgene. The transgenic complementation ofindicated that AtCPS V326M led to the dwarf and bushy phenotype of. The endogenous gibberellins contents analysis suggested that the gibberellins contents ofwere much lower than that of wild-type. The exogenous GA3application assay uncovered that application of GA3can complement the dwarf and bushy phenotype ofcaused by low endogenous gibberellins contents. Therefore, this study suggested that it is an elegant way to create the ideal plant architecture and height by site-directed mutating the gibberellin biosynthetic genes.

gibberellins;gene; root length; plant architecture; plant height

2021-11-26;

2022-01-19;

2022-02-22

國家自然科學(xué)基金青年項目(編號：31900171)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31900171)]

趙三增，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: 834395875@qq.com

凌宏清，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: hqling@genetics.ac.cn

劉毅，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: yiliu609@outlook.com

10.16288/j.yczz.21-405

(責(zé)任編委: 儲成才)