牟泓曄，周小杰，楊永春，王曉杜，周瑩珊,2,*，宋厚輝,*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程研究中心，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江省動(dòng)物醫(yī)學(xué)與健康管理國(guó)際科技合作基地，中澳動(dòng)物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬()的單股環(huán)狀無(wú)囊膜DNA病毒。其中豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是主要的致病型病毒，在臨床中常引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，皮炎腎病綜合征，繁殖障礙以及呼吸道、腸道和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。2015年，一種新型的豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)被發(fā)現(xiàn)。這兩種病毒感染在臨床上有相似的繁殖障礙和呼吸道、腸道癥狀，給臨床檢測(cè)和防治帶來(lái)一定困難。因此，急需建立一種檢測(cè)方法對(duì)PCV2和PCV3的臨床感染進(jìn)行快速鑒別區(qū)分，以便及時(shí)做好防治和控制病原工作。

目前針對(duì)PCV2和PCV3的檢測(cè)方法有普通PCR檢測(cè)、普通二重PCR檢測(cè)、單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)、蛋白瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)、抗體膠體金免疫層析檢測(cè)、間接ELISA檢測(cè)等檢測(cè)方法，這些檢測(cè)方法均能對(duì)PCV2和PCV3病原進(jìn)行特異性檢測(cè)，但尚存在不足還需進(jìn)一步完善。因此，本研究基于已有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)針對(duì)PCV2和PCV3特異性序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物和1對(duì)探針，應(yīng)用man探針?lè)p重?zé)晒舛縋CR技術(shù)建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)區(qū)分PCV2和PCV3的定量檢測(cè)方法，為PCV2和PCV3混合感染的診斷提供了特異、靈敏、快速的初步檢測(cè)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及病料

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經(jīng)商品化試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的PCV2和PCV3病料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。181份來(lái)自浙江省不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)豬胸腔附近的肌肉及全血樣品由本室采集并保存。

1.2 試劑及儀器

ProbeqPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自武漢市藤源恒峰生物科技有限公司，小提質(zhì)粒試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京天根公司，Trizol試劑購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司。

MX3000P型熒光定量PCR儀購(gòu)自Agilent(美國(guó))，SynergyH1型酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek(美國(guó))，全自動(dòng)樣品快速研磨儀購(gòu)自上海凈信公司，低溫高速離心機(jī)和小型高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf(德國(guó))。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank發(fā)表的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列，利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)PCV2和PCV3特異性引物和Man探針。其中，PCV2的2條引物序列分別為5′-TCACCTATGACCCCTATG-3′和5′-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度117 bp；PCV3的2條引物序列分別為5′-TGGCTCAACACATATGAC-3′和5′-ACGGACTTGTAACGAATC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度125 bp。針對(duì)PCV2和PCV3設(shè)計(jì)的探針序列分別為FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1和HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1。設(shè)計(jì)的引物和探針均由杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行合成

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和鑒定

使用病毒核酸提取試劑盒分別提取PCV2、PCV3陽(yáng)性病料核酸作為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的基因。反應(yīng)條件均為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，52 ℃ 5 s，68 ℃ 5 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，PCR鑒定為陽(yáng)性后由上海金唯智生物科技有限公司測(cè)序鑒定后測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

本研究建立在單重?zé)晒舛繉?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用矩陣法調(diào)整引物和探針的濃度，以此確定一個(gè)優(yōu)化后的反應(yīng)體系。以PCV2和PCV3質(zhì)粒為DNA模板，分別稀釋到1×10拷貝·μL，再依次進(jìn)行10倍稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)

使用病毒核酸提取試劑盒提取PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PEDV、TGEV核酸后，將各病毒DNA和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，利用優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)其特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將PCV2和PCV3的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行1∶1混合作為混合質(zhì)粒，作10倍稀釋，稀釋后的濃度為1.0×10～1.0×10拷貝·μL進(jìn)行敏感性檢測(cè)，以ddHO為陰性對(duì)照，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度差異。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別以濃度為10、10、10拷貝·μL的1.7節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)品混合物作為模板分別進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，選取3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)品模板分別擴(kuò)增，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)檢測(cè)其重復(fù)性。

1.9 臨床樣品符合率檢測(cè)

從浙江省不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)采集到181份臨床豬肉和全血樣品，豬肉樣品通過(guò)磁珠研磨裂解提取核酸，全血離心后取上層血清利用Trizol法抽提核酸，分別通過(guò)本研究中構(gòu)建的雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法和普通熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行PCV2(GB/T35901-2018)和PCV3(T/CVMA X8-2019)檢測(cè)后分析其陽(yáng)性符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2和PCV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

PCV2和PCV3重組質(zhì)粒以陽(yáng)性病料核酸為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別在117 bp和125 bp出現(xiàn)目的條帶(圖1)，表明成功擴(kuò)增出目的基因。根據(jù)公式計(jì)算pMD-PCV2和pMD-PCV3的初始拷貝數(shù)分別為1.07×10拷貝·μL和1.2×10拷貝·μL。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，建立的雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)總體系20 μL，其中Premix酶10 μL，上下游引物均為0.4 μL(0.2 μmol·L)，探針均為0.8 μL(0.2 μmol·L)，模板各2 μL，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。

M，DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)記；1，PCV3基因；2，PCV2基因。M，DL2000 DNA Marker;1，PCV3 gene;2，PCV2 gene.圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

采用上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，分別以8個(gè)稀釋度(1.0×10拷貝·μL～1.0×10拷貝·μL)的PCV2和PCV3標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制PCV2和PCV3的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，二者標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-3.258和-3.408，相關(guān)系數(shù)分別為0.995和0.996，線性關(guān)系良好。

圖2 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of TaqMan fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

將建立的雙重?zé)晒舛糠椒▽?duì)PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PCV3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅PCV2和PCV3呈陽(yáng)性，其余均為陰性，表明該檢測(cè)方法特異性良好(圖3)。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該檢測(cè)方法所能檢測(cè)的PCV2和PCV3的最低檢測(cè)濃度均為10 拷貝·μL(圖4)，而常規(guī)PCR對(duì)PCV2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為10拷貝·μL，對(duì)PCV3為10拷貝·μL(圖5)。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。

1，豬圓環(huán)病毒2型；2，豬圓環(huán)病毒3型；3，豬繁殖與呼吸綜合征??；4，偽狂犬病病毒；5，豬細(xì)小病毒；6，豬瘟病毒(CSFV)；7，豬流行性腹瀉病毒；8，豬傳染性胃腸炎病毒；9，ddH2O。1，PCV2;2，PCV3;3，PRRSV;4，PRV;5，PPV;6，CSFV;7，PEDV;8，TGEV;9，ddH2O.圖3 雙重?zé)晒舛縋CR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specificity detection results of duplex fluorescence quantitative PCR

1～8，pMD-PCV2質(zhì)粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；9，PCV2陰性對(duì)照；a～h，pMD-PCV3質(zhì)粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；i，PCV3陰性對(duì)照。下同。1-8，1.0×108-1.0×101 copies·μL-1 of pMD-PCV2;9，PCV2 negative control;a-h，1.0×108-1.0×101 copies·μL-1 of pMD-PCV3;i，PCV3 negative control.The same as below.圖4 雙重?zé)晒舛縋CR敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity detection results of duplex fluorescence quantitative PCR

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

分別以倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物作為模板進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，PCV2和PCV3的所有重復(fù)樣品的組內(nèi)和組間的變異系數(shù)(CV)均小于2%(表1)，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

表1 PCV2與PCV3標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Reproducibility test of PCV2 and PCV3 standard products

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

將采集的浙江省181份豬肉及全血樣品用建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)(表2)，結(jié)果顯示，樣品中PCV2陽(yáng)性檢出率為50.83%(92/181)，PCV3陽(yáng)性檢出率為37.57%(68/181)，PCV2與PCV3混合感染陽(yáng)性檢出率為12.15%(22/181)。普通熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示PCV2陽(yáng)性檢出率為50.28%(91/181)，PCV3陽(yáng)性檢出率為36.46%(66/181)，PCV2與PCV3混合感染陽(yáng)性檢出率為11.60%(21/181)，根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算符合率的方法(標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法與本文中建立的檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品數(shù)的比值)，兩種方法檢測(cè)PCV2和PCV3的符合率分別為98.91%和97.06%，PCV2和PCV3混合感染符合率為95.45%，表明所建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)普通熒光PCR檢測(cè)符合率較高，可用于臨床檢驗(yàn)。

1～8，pMD-PCV2質(zhì)粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；9，PCV2陰性對(duì)照；a～h，pMD-PCV3質(zhì)粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；i，PCV3陰性對(duì)照。1-8，1.0×108-1.0×101copies·μL-1 of pMD-PCV2;9，PCV2 negative control;a-h，1.0×108-1.0×101copies·μL-1 of pMD-PCV3;i，PCV3 negative control.圖5 普通PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sensitivity detection results of ordinary PCR

表2 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of clinical samples

3 討論

豬圓環(huán)病毒感染在臨床上多引起皮炎腎病綜合征和繁殖障礙等疾病，PCV2和PCV3均具有易感性，常通過(guò)呼吸道和消化道等途徑感染豬群，各年齡段的豬群均易感且發(fā)病癥狀各不相同，常與其他傳染性病毒交叉感染給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)威脅。并且研究發(fā)現(xiàn)，PCV2與PCV3兩種致病型也?；旌细腥?，兩者引起的臨床癥狀相似，給臨床診斷帶來(lái)一定難度。因此，需要一種檢測(cè)手段對(duì)其進(jìn)行鑒別。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，已有多種檢測(cè)手段能對(duì)PCV2和PCV3進(jìn)行特異性檢測(cè)，尤其是熒光定量PCR的發(fā)展，對(duì)臨床檢測(cè)有重要意義。我國(guó)已有針對(duì)PCV2病原的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但目前尚未有對(duì)PCV2和PCV3檢測(cè)的OIE標(biāo)準(zhǔn)，使得臨床上PCV2和PCV3的檢測(cè)受限，并且目前也沒(méi)有針對(duì)PCV2和PCV3的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法來(lái)對(duì)其進(jìn)行區(qū)別。因此，本研究設(shè)計(jì)了一種雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法能精準(zhǔn)地檢測(cè)出圓環(huán)病毒2型和3型，對(duì)PCV2和PCV3的早期鑒別診斷有重要意義。

本研究以PCV2和PCV3的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，可擴(kuò)增出曲線，當(dāng)模板濃度為10 拷貝·μL時(shí)仍可檢測(cè)到熒光信號(hào)；對(duì)比文獻(xiàn)[7]中普通二重PCR檢測(cè)方法，本研究建立的檢測(cè)方法不需跑膠驗(yàn)證更高效便捷，無(wú)試劑對(duì)人體造成毒害作用，且只能特異性地?cái)U(kuò)增出圓環(huán)病毒，其他病毒均呈陰性；對(duì)比文獻(xiàn)[6]普通PCR核酸檢測(cè)只能單一檢測(cè)出PCV2，本研究可對(duì)PCV2和PCV3進(jìn)行特異性區(qū)分；對(duì)比文獻(xiàn)[9]中建立的多克隆抗體檢測(cè)方法造價(jià)低，更適用于針對(duì)臨床中大批量樣品的檢測(cè)；另外本研究中應(yīng)用的man探針技術(shù)比文獻(xiàn)[8]中染料法檢測(cè)精度更高并能對(duì)PCV2與PCV3進(jìn)行特異性區(qū)分。因此，本研究中建立的雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法對(duì)PCV2與PCV3的鑒別診斷及流行病學(xué)檢測(cè)提供了新的試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)臨床檢測(cè)有重要的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文建立的針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型和3型的TaqMan雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法，可以同時(shí)、快速、特異性地檢測(cè)出PCV2和PCV3，通過(guò)對(duì)其的試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法特異性良好，僅能檢測(cè)出PCV2和PCV3陽(yáng)性，其他病毒均為陰性。最低檢測(cè)極限PCV2和PCV3均能達(dá)到10 拷貝·μL，靈敏性良好。組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于2%，可重復(fù)性良好。181份來(lái)自浙江省臨床樣品的PCV2和PCV3的檢測(cè)陽(yáng)性符合率分別為98.91%和97.06%，PCV2和PCV3混合感染陽(yáng)性符合率為95.45%，適用于臨床樣品的檢測(cè)。因此，本研究建立的PCV2和PCV3雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法對(duì)于臨床上的早期檢測(cè)具有一定實(shí)際意義，對(duì)于PCV2和PCV3的預(yù)防和控制具有重要價(jià)值。