丁燕玲，王鵬飛，楊朝云，周小南，趙志艷，張巖峰，史遠(yuǎn)剛，康曉龍

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

miRNA是一類非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為18～22個(gè)核苷酸，其主要通過種子序列與靶基因的3′UTR區(qū)特定序列互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)或誘導(dǎo)使其降解，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的生物學(xué)過程。肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育直接影響肉牛的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)，肌細(xì)胞的增殖分化是肌肉組織正常發(fā)育的指標(biāo)，而miRNA是成肌細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程的重要調(diào)控因子。研究表明，-1、-133和-206是肌肉中特異性表達(dá)的miRNAs，-133可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，而-1和-206可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，且-133表達(dá)量的上調(diào)與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換有關(guān)聯(lián)；-378、-143能夠分別靶向2和5基因，調(diào)節(jié)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化；-204通過靶向1基因，在免疫炎癥相關(guān)的組織中發(fā)揮重要作用；在大鼠軟骨分化誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，過表達(dá)-615-3后相關(guān)基因的mRNA表達(dá)顯著降低，促進(jìn)軟骨形成的轉(zhuǎn)錄因子9表達(dá)也顯著降低，從而抑制大鼠的軟骨分化，而敲除-615-3p則得到相反的結(jié)果，這表明-615-3抑制軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，并可能抑制軟骨細(xì)胞分化；陳雯等研究表明，牛-423-5基因在骨骼肌細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)量最高，推測(cè)其促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的分化。盡管越來(lái)越多的研究表明miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化等生物學(xué)過程中起重要的作用，也有研究表明-144在肝癌、胃癌等癌癥中對(duì)細(xì)胞增殖遷移具有調(diào)控作用，前期數(shù)據(jù)中篩選到-144可能參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收或能量利用等過程，但-144具體作用于何種組織并發(fā)揮作用，尚未明確。本研究對(duì)-144在各物種間的保守性進(jìn)行分析，通過在線軟件預(yù)測(cè)靶基因，并通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)牛不同組織中-144的表達(dá)，初步了解-144可能參與的生物學(xué)調(diào)控途徑與潛在功能，結(jié)果將為后續(xù)開展-144在牛主要組織中的調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miR-144在?；蚪M中的位置與序列信息

通過miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)查詢牛-144成熟體與前體序列，通過在線軟件TargetScan查詢-144可能的靶基因，所用數(shù)據(jù)庫(kù)見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)名稱與網(wǎng)址Table 1 Name of database and website

1.2 miR-144保守性分析

利用NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索牛()、馬()、豬()、狗()、雞()、小鼠()、溝鼠()、人()、黑猩猩()和斑馬魚()10個(gè)物種的-144成熟體序列，分析其在進(jìn)化過程中的保守性。

1.3 miR-144靶基因預(yù)測(cè)與功能富集分析

為了降低-144靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性，采用TargetScan、miRWalk和miRDB在線軟件預(yù)測(cè)-144的靶基因，用軟件Veney繪制韋恩圖，得到3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，然后集合miRTarbase數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的牛-144靶基因，共同組成下一步分析的靶基因集合。利用DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)-144預(yù)測(cè)所得靶基因集合進(jìn)行基于生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個(gè)層面的GO注釋分類和KEGG信號(hào)通路富集分析，以<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO條目與信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1.4 miR-144組織表達(dá)分析

1.4.1 試驗(yàn)材料

從寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)采集出生24 h之內(nèi)的秦川小犢牛的心、肝、肺、瘤胃、背最長(zhǎng)肌、腿肌與皮下脂肪，同時(shí)采集成年秦川牛(36月齡左右)的心、背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪，PBS緩沖液沖洗干凈后帶回實(shí)驗(yàn)室，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol提取各組織RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，檢測(cè)合格后保存?zhèn)溆?。Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)，以及熒光定量試劑盒(2 × SYBR Green Reesis Kitaltime PCR Master Mix)均購(gòu)自TaKaRa公司。采用BIO-RAD型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

1.4.2 總RNA提取和cDNA合成

用Trizol提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行-144的cDNA反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體系20 μL：第一部反應(yīng)為5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 2 μL，RNase Free ddHO 5 μL，42 ℃水浴2 min；第二步反應(yīng)為上一步混合物10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，-144莖環(huán)引物1 μL，5×PrimeScript Buffer2 4 μL，RNase Free ddHO 4 μL，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反應(yīng)結(jié)束后，所得cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 引物設(shè)計(jì)與合成

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取-144成熟體序列，設(shè)計(jì)上、下游與莖環(huán)引物，以18S RNA為內(nèi)參基因；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳細(xì)信息見表2。

表2 miR-144定量引物信息Table 2 Information of quantitative primer of miR-144

1.4.4 qRT-PCR反應(yīng)

采用qRT-PCR法檢測(cè)-144在出生24 h之內(nèi)犢牛的心、肝、肺、瘤胃、背最長(zhǎng)肌、腿肌、皮下脂肪，以及36月齡左右成年牛心、背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪中的表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free ddHO 6.4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，55.7 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)用SAS8.2軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-144在?；蚪M中的位置與序列信息

根據(jù)NCBI和miRbase網(wǎng)站公布的牛-144信息可知，-144位于?；蚪M19號(hào)染色體的20 233 836～20 274 484 bp處，成熟序列為UACAGUAUAGAUGAUGUACUAG(長(zhǎng)度為22 bp)，前體序列(pre-miR-144)為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTA(長(zhǎng)度為50 bp)(圖1)。

圖1 miR-144在牛基因組中的位置與序列信息Fig.1 Location and sequence information of miR-144 in bovine genome

2.2 miR-144保守性分析

用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出人、牛、馬、小鼠、斑馬魚等10個(gè)物種的-144成熟序列，并與牛-144序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)-144的成熟體序列“UACAGUAUAGAUGAUGUACUAG”在各物種之間保守性較高(表3)。

表3 多個(gè)物種miR-144成熟體序列Table 3 Mature sequence of miR-144 from multiple species

2.3 miR-144靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

利用TargetScan、miRWalk和miRDB軟件預(yù)測(cè)牛-144的靶基因，分別預(yù)測(cè)到977、1 422、1 493個(gè)靶基因，取三者交集共得到78個(gè)靶基因(圖2)，合并miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的265個(gè)-144靶基因，去除1個(gè)重復(fù)靶基因，共獲得342個(gè)靶基因作為后續(xù)GO注釋條目和KEGG富集分析的靶基因集合。

藍(lán)色表示采用miRWalk軟件預(yù)測(cè)的miR-144靶基因，黃色表示采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)的miR-144靶基因，綠色表示采用miRDB軟件預(yù)測(cè)的miR-144靶基因。Blue indicated miR-144 target genes predicted by miRWalk software，yellow indicated miR-144 target genes predicted by TargetScan software，and green indicated miR-144 target gene predicted by miRDB software.圖2 miR-144靶基因交集預(yù)測(cè)Fig.2 Intersection prediction of miR-144 target genes

2.4 GO注釋分類與富集分析

針對(duì)342個(gè)靶基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有22個(gè)GO條目。其中，12個(gè)GO條目屬于BP，靶基因富集程度最高的GO條目有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、胚胎發(fā)育等；6個(gè)GO條目分布在CC，其中，在細(xì)胞膜和細(xì)胞核富集的基因最多；4個(gè)GO條目為MF，靶基因顯著(<0.05)富集在受體激活劑的活性、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、DNA結(jié)合等條目中(圖3)。

圖3 miR-144潛在靶基因的GO注釋Fig.3 GO annotations of miR-144 predicted target genes

2.5 KEGG富集分析

為了全面探索預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究在GO注釋分類的基礎(chǔ)上，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)所得靶基因集合中的342個(gè)基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示(圖4)，-144的靶基因顯著(<0.05)富集于血管平滑肌收縮、cGMP-PKG、cAMP信號(hào)通路中，以上通路在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪沉積、能量代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用；其他富集通路盡管未達(dá)到顯著水平，但也多與肌肉發(fā)育、能量代謝等過程密切關(guān)聯(lián)，如MAPK信號(hào)通路由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38-MAPK)3個(gè)家族成員組成，參與MAPK信號(hào)通路的基因主要包括35、23和22。研究表明，敲除35基因后，HO誘導(dǎo)的JNK活性受到抑制，進(jìn)而抑制JNK和p38-MAPK激酶，觸發(fā)凋亡激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞分化、胃排空和食物利用效率顯著下降，即脂肪代謝效率下降，脂肪在機(jī)體內(nèi)儲(chǔ)存，最終導(dǎo)致人和家畜的肥胖；而肌肉中脂肪含量與肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性存在密切聯(lián)系，因此，推測(cè)MAPK信號(hào)通路可能在牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 miR-144靶基因集合KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment results of miR-144 target genes

2.6 qRT-PCR分析結(jié)果

采用qRT-PCR方法檢測(cè)出生24 h之內(nèi)犢牛不同組織中-144的表達(dá)量，結(jié)果見圖5-A。-144在肝中的表達(dá)量最高，其次是心、腿肌，在瘤胃、皮下脂肪中的表達(dá)量最低；-144在腿肌和心中的表達(dá)量差異不顯著(>0.05)，但在肝中的表達(dá)顯著高于腿肌和心(<0.05)；-144在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)顯著高于瘤胃和皮下脂肪，而瘤胃和皮下脂肪中表達(dá)量差異不顯著(>0.05)。如圖5-B所示，在成年牛和初生犢牛中，-144在心中的表達(dá)量最高，且在心和背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)均顯著(<0.05)高于皮下脂肪，而在成年牛和出生24 h內(nèi)犢牛同一組織中的表達(dá)量差異不顯著(>0.05)。上述結(jié)果提示，牛-144可能通過機(jī)體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過程發(fā)揮重要生物學(xué)功能，但詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行佐證。

A，miR-144在牛主要部位的表達(dá)；B，miR-144在牛不同發(fā)育時(shí)期主要部位的表達(dá)。柱上無(wú)相同字母表示差異顯著(P<0.05)A，Expression of miR-144 in main tissues of cattle;B，Expression of miR-144 in main tissues of cattle at different developmental stages.Data marked without the same lowercase letters indicated significant differences at P<0.05.圖5 miR-144在牛主要部位的表達(dá)量Fig.5 Expression of miR-144 in bovine parts

3 討論

本研究通過對(duì)-144靶基因預(yù)測(cè)與qRT-PCR驗(yàn)證，初步篩選出1基因是-144的靶基因。大量研究證明，1基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，它可以與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子作用從而調(diào)控其過程。經(jīng)NCBI查詢，牛1基因定位于24號(hào)染色體，由33個(gè)外顯子組成。1屬于RhoA相關(guān)激酶，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N末端的激酶結(jié)構(gòu)域、在中間與Rho結(jié)合的卷曲結(jié)構(gòu)域和位于C末端的血小板-白細(xì)胞激酶同源結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，1在癌癥方面對(duì)細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用；該基因也能夠阻礙成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期，從而抑制分化；Zhou等通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證1與-217的靶向關(guān)系時(shí)，將-217模擬物和-217抑制劑轉(zhuǎn)染到血管平滑肌細(xì)胞中，通過qRT-PCR和WesternBlot檢測(cè)-217和1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，-217模擬物顯著降低1基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而-217抑制劑顯著增強(qiáng)1表達(dá)，由此得出轉(zhuǎn)染-217模擬物可顯著誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞周期阻滯、增殖抑制、遷移減少和凋亡增強(qiáng)。本文所得結(jié)果中1是-144的靶基因之一，但牛-144是否通過1基因調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育目前仍不明確，1也將是我們后續(xù)開展試驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)鍵候選靶基因之一。

對(duì)-144靶基因集合進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因顯著富集于血管平滑肌收縮、cGMP-PKG、cAMP等與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路。cGMP-PKG信號(hào)通路即一氧化氮激活的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶和利鈉肽激活的微粒，均可使GTP轉(zhuǎn)化成cGMP，而cGMP可激活Ⅰ基因，導(dǎo)致Ⅰ調(diào)節(jié)的大量目的蛋白磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮廣泛的下游效應(yīng)，例如通過作用于肌聯(lián)蛋白N2B，減弱心肌細(xì)胞僵硬度；作用于肌鈣蛋白Ⅰ，減弱肌絲敏感性。大量研究表明，cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與肌肉收縮機(jī)制，cAMP信號(hào)傳導(dǎo)影響骨骼肌肥大、代謝和再生。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是一種抗增殖分子，也是多種細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子之一，研究表明，2對(duì)軟骨細(xì)胞DNA合成和硫酸鹽摻入產(chǎn)生顯著影響，提示2在軟骨代謝中起重要作用；如Miwa等在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中加入外源性PGE2，觀察到DNA斷裂增加，而DNA斷裂的增加是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志；使用二丁酰cAMP時(shí)發(fā)現(xiàn)cAMP水平增加：因此，提示PGE2通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，進(jìn)而激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)第二信使系統(tǒng)，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。胚胎細(xì)胞中cAMP水平的調(diào)節(jié)與脂質(zhì)沉積的減少有關(guān)，利鈉肽C(natriuretic peptide C，NPPC)是細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的潛在調(diào)節(jié)劑，由哺乳動(dòng)物的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生并與卵丘細(xì)胞中的肽鈉尿受體2(peptide natriuretic receptor 2，NPR2)結(jié)合，NPR2激活誘導(dǎo)cGMP的合成。研究發(fā)現(xiàn)，在牛胚胎體外培養(yǎng)過程中添加NPPC，可提高牛囊胚的孵化率，降低膽固醇衍生物和三酰甘油酯亞類的含量，說(shuō)明NPPC在牛胚胎體外培養(yǎng)過程中對(duì)cGMP胞內(nèi)脂類濃度具有調(diào)節(jié)作用，可通過cAMP通路刺激脂肪分解和減少脂質(zhì)沉積。4屬于一個(gè)由4個(gè)4基因組成的基因家族，它能夠編碼磷酸二酯酶，進(jìn)而水解第二信使cAMP結(jié)合。據(jù)報(bào)道cAMP依賴性蛋白激酶PKA可促進(jìn)4基因的磷酸化和活性。如Silva等發(fā)現(xiàn)，在牛脂肪細(xì)胞中，4基因下調(diào)可以增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，進(jìn)而通過cAMP信號(hào)通路影響早期脂肪細(xì)胞分化。

4 結(jié)論

本研究分析了-144成熟體序列在不同動(dòng)物間的保守性，鑒定了-144在牛主要組織中的表達(dá)特征。牛-144可能靶向調(diào)控1、1、等基因，其預(yù)測(cè)靶基因主要參與血管平滑肌的收縮、cGMP-PKG與cAMP等信號(hào)通路。