王乾昆，張小輝，2，龐有志，2，*，祁艷霞，2，雷 瑩，2，白俊艷，2，戶運(yùn)奇，趙毅威，苑志文，王 濤

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.洛陽(yáng)市動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

在鳥(niǎo)類(lèi)生產(chǎn)應(yīng)用和選育新品種中，羽色可作為重要的經(jīng)濟(jì)性狀發(fā)揮其作用。從某種程度上來(lái)說(shuō)，新品系純度與性狀遺傳穩(wěn)定性可以根據(jù)羽毛的顏色來(lái)判斷。在性別決定中，動(dòng)物的伴性遺傳比較常見(jiàn)，尤其是在鳥(niǎo)類(lèi)中，這種現(xiàn)象更加明顯，一般雄性羽色顏色更加鮮艷。鳥(niǎo)類(lèi)同一物種不同顏色會(huì)在選擇棲息地和避免被捕食風(fēng)險(xiǎn)中起到作用。傳統(tǒng)生產(chǎn)中對(duì)于禽類(lèi)性別鑒定一直采用翻肛技術(shù)，翻肛會(huì)引起雛雞應(yīng)激反應(yīng)，操作不當(dāng)會(huì)撕傷雛雞。Yang等采用基于紫外成像的雛雞羽毛自動(dòng)性別鑒定，雌雄雛雞性別分離的正確率分別為93%和94%，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、節(jié)約成本。雞快羽和慢羽屬于伴性遺傳，快羽公雞與慢羽母雞雜交后代中公雞全為慢羽，母雞全為快羽，這可以用于初生雛雞的性別鑒定，取代了生產(chǎn)中廣泛使用的翻肛技術(shù)，是目前國(guó)內(nèi)外養(yǎng)雞業(yè)普遍采用的技術(shù)措施。研究羽色遺傳對(duì)于物種保護(hù)、合理開(kāi)發(fā)畜禽遺傳資源與開(kāi)展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究等方面具有重要意義。

鳥(niǎo)類(lèi)的羽色類(lèi)型主要取決于黑色素的含量和分布，黑色素合成的關(guān)鍵是酪氨酸酶氧化酪氨酸。作為羽色形成的基本物質(zhì)，黑色素可分為真黑素和褐黑素，2種黑色素類(lèi)型之間的相互轉(zhuǎn)化影響羽色的形成。國(guó)內(nèi)關(guān)于鵪鶉羽色的研究大多集中在探索遺傳規(guī)律與生產(chǎn)應(yīng)用方面，對(duì)鵪鶉羽色自別雌雄分子機(jī)制的研究較少。北京白羽公鶉與栗羽母鶉的雜交后代(F)能夠根據(jù)羽色自別雌雄，即F中栗羽全部為公鶉，白羽全部為母鶉。因此，本研究對(duì)北京白羽鵪鶉(BF)和栗羽鵪鶉(LF)雜交后代(F)胚胎期的皮膚組織進(jìn)行RNA-seq分析，篩選與羽色相關(guān)的差異表達(dá)基因，分析候選基因與鵪鶉性別之間的關(guān)系，為后續(xù)鵪鶉羽色自別雌雄方面的分子研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇3只北京白羽公鵪鶉與3只朝鮮栗羽母鵪鶉配對(duì)后單籠飼養(yǎng)，收集每對(duì)鵪鶉的種蛋，標(biāo)記后分區(qū)孵化。在孵化的第10天取出胚胎，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行性別鑒定，每對(duì)鵪鶉的F代中選擇1個(gè)公鶉和1個(gè)母鶉，將胚胎取出放在干凈的錫箔紙上，用剪刀和鑷子采集鵪鶉翅膀下方的皮膚組織，標(biāo)記后放于液氮中，用于后續(xù)的RNA-seq分析。方法同上，采集不同胚胎期的皮膚組織，標(biāo)記后儲(chǔ)存于液氮中，用于后續(xù)qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將儲(chǔ)存在液氮中的皮膚組織迅速取出，利用Trizol(Takara公司)法提取6個(gè)樣品的總RNA，并用Nano Drop2000檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，此項(xiàng)工作由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。采用Trimmomatic軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，去除帶接頭序列、含N序列與低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量clean reads。利用hisat2將clean reads與鵪鶉參考基因組(GCA_001577835.2)進(jìn)行比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測(cè)序樣本特有的序列特征信息，用于后續(xù)分析。RNA-seq原始數(shù)據(jù)已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI登錄號(hào)：PRJNA756792)。

1.3 差異表達(dá)基因的篩選

利用DESeq2軟件對(duì)各個(gè)樣本基因的counts數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，最終根據(jù)差異倍數(shù)與差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)篩選差異基因(<0.05且|logFC|>1)。

利用ClusterProfiler軟件，將差異基因與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得差異基因GO功能注釋信息；以<0.05作為顯著性富集的閾值，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行比對(duì)，得到差異基因顯著性富集的pathway注釋信息。

1.4 候選基因的qRT-PCR驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，得到了7個(gè)與羽色表型相關(guān)的基因，分別是1、174、、、452、1和。以4為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR方法檢測(cè)羽色相關(guān)差異表達(dá)基因在白羽和栗羽鵪鶉F代胚胎不同發(fā)育時(shí)間的表達(dá)情況。參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中日本鵪鶉同源序列信息，用Primer5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Table 1 Primer information of real-time fluorescent quantitative PCR

參考Takara SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)，qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol·L)各0.75 μL，SYBRPremix ExTMII(2×)10 μL，ddHO 7.5 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(根據(jù)各引物退火溫度設(shè)定)，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；延伸階段收集信號(hào)；熔解曲線從65 ℃到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

基因的相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算，運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行檢驗(yàn)分析，用Graphpad prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

原始Reads數(shù)量為291.07 M，過(guò)濾后得到的clean reads數(shù)量為279.72 M，過(guò)濾后得到的總堿基數(shù)量為38.94 G，6個(gè)樣品測(cè)序所得數(shù)據(jù)庫(kù)的Q30均在90%以上，GC含量平均值為49.7%。比對(duì)結(jié)果顯示：6個(gè)所測(cè)樣品至少89%的reads比對(duì)到參考基因組上，其中，比對(duì)在參考基因組上有單一位點(diǎn)的reads在87%左右，比對(duì)在參考基因組上有多個(gè)位點(diǎn)的reads均低于3%，reads比對(duì)率低可能與參考基因組組裝質(zhì)量有關(guān)(表2)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理結(jié)果與基因組比對(duì)率Table 2 Reference of sequencing data quality pretreatment and statistical results of genome comparison rate

2.2 基因表達(dá)水平

通過(guò)箱線圖可以展示不同樣本基因表達(dá)水平的分布情況，由圖1可知，各個(gè)平行樣品之間的重復(fù)性比較好。

圖1 基因表達(dá)水平箱線圖Fig.1 Box plot of gene expression level

2.3 差異表達(dá)基因分析

共篩選出來(lái)91個(gè)差異表達(dá)基因，相較于北京白羽鵪鶉，栗羽鵪鶉皮膚中上調(diào)基因有69個(gè)，下調(diào)基因有22個(gè)(圖2)。得到了7個(gè)與羽色表型相關(guān)的基因，分別是1、174、、、452、1和。

灰色為非顯著差異表達(dá)的基因，紅色表示顯著上調(diào)基因，綠色表示顯著下調(diào)基因。Gray represented genes with no significant difference，red indicated up-regulation genes，and green indicated down-regulated genes.圖2 基因表達(dá)火山圖Fig.2 Volcanic maps of gene expression

2.4 差異基因GO和KEGG富集分析

GO分析結(jié)果表明，有13 841個(gè)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中包含78個(gè)差異表達(dá)基因。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular Function)注釋?zhuān)灿?4個(gè)分類(lèi)條目顯著富集，生物學(xué)過(guò)程注釋到23個(gè)條目，細(xì)胞組分注釋到20個(gè)條目，分子功能注釋到21個(gè)條目(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因GO水平分布圖Fig.3 Map of GO levels of differentially expressed genes

KEGG富集結(jié)果顯示，有22個(gè)差異基因富集到38條通路中。為了進(jìn)一步探討得到的候選基因的功能及其所參與的代謝過(guò)程，對(duì)測(cè)序得到的全部差異基因在KEGG Level2水平進(jìn)行重新富集分析發(fā)現(xiàn)，25個(gè)上調(diào)基因分布在16條通路中，9個(gè)下調(diào)基因在6條通路聚集(圖4)。KEGG富集分析得到了3條與羽色合成相關(guān)的通路，分別為黑色素通路(melanogenesis)、酪氨酸代謝通路(tyrosine metabolism)和MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)(表3)。這3條通路中有1、和KIT 3個(gè)差異表達(dá)基因。其他候選基因的富集通路差異不顯著。

橫軸是注釋到各 Level2 通路的上調(diào)(下調(diào))差異表達(dá)基因和所有注釋到KEGG通路的上調(diào)(下調(diào))差異表達(dá)基因總數(shù)的比值(%)，縱軸表示 Level2 Pathway 的名稱，柱子右邊數(shù)字代表注釋到該 Level2 Pathway 的上調(diào)(下調(diào))差異表達(dá)基因數(shù)量。紅色表示顯著上調(diào)基因，綠色表示顯著下調(diào)基因。Horizontal axis was the ratio (%)of the total number of up-regulated (down-regulated)differentially expressed genes annotated to each Level2 pathway and all up-regulated (down-regulated)genes annotated to the KEGG pathway，vertical axis represented the name of Level2 pathway，and the number on the right side of the column represented the number of up-regulated (down-regulated)differentially expressed genes annotated to the Level2 pathway.Red indicated up-regulation genes and green indicated down-regulated genes.圖4 差異表達(dá)基因KEGG Level2 水平分布圖Fig.4 KEGG Level2 distribution map ofdifferentially expressed gene

表3 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Table 3 KEGG pathway for differentially expressed genes

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證

選取7個(gè)與羽色表型相關(guān)的差異表達(dá)基因，分別是1、174、、、452、1和進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，研究其在栗羽鵪鶉和北京白羽鵪鶉相同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。1、174、、、452、1和基因在栗羽鵪鶉各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均顯著高于北京白羽鵪鶉，說(shuō)明候選基因在鵪鶉羽色形成與黑色素合成過(guò)程中起到重要作用，由此推斷所選候選基因可能與鵪鶉羽色自別雌雄有關(guān)。qRT-PCR和RNA-seq篩選出來(lái)的基因表達(dá)結(jié)果一致，驗(yàn)證了RNA-seq的準(zhǔn)確性。

*和**分別表示在P<0.05 和P<0.01 水平差異顯著。* and ** meant significant differences at the levels of P<0.05 and P<0.01，respectively.圖5 白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉不同發(fā)育階段胚胎中候選基因相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of candidate genes in embryos of white feather and maroon feather Korean quails at different developmental stages

3 討論

黑色素主要在黑色素細(xì)胞的黑色素小體中合成，需要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)，其中，酪氨酸、酪氨酸酶、氧元素是黑色素形成過(guò)程中最關(guān)鍵的3種物質(zhì)。本研究中，KEGG富集分析得到多條與羽色合成相關(guān)信號(hào)通路，如黑色素通路、酪氨酸代謝通路和MAPK信號(hào)通路。黑色素通路中發(fā)現(xiàn)3個(gè)與羽色相關(guān)的差異基因，1、和，且都是上調(diào)基因。酪氨酸代謝通路中，酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)是合成黑色素的關(guān)鍵因素，在黑色素生成通路的下游起關(guān)鍵作用。在黑色素小體成熟階段，TYR、TRP-1、TRP-2選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)至黑色素小體，調(diào)控黑色素的合成。黃海艷等研究表明，MAPK信號(hào)通路在黑色素的合成中起重要作用。當(dāng)脂聯(lián)素和AICAR激活MAPK信號(hào)通路時(shí)，激活的MAPK信號(hào)通路可選擇性地調(diào)控下游基因，導(dǎo)致CAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化，引起上調(diào)。基因是黑色素合成關(guān)鍵酶(酪氨酸酶)的直接上游基因，主要調(diào)控TYR、TRP-1和TRP-2的活性，進(jìn)而影響黑色素的合成。3條KEGG通路中都有黑色素合成相關(guān)差異表達(dá)基因富集，說(shuō)明信號(hào)通路中某些基因的表達(dá)可能促進(jìn)了鵪鶉羽色的形成。

鵪鶉羽色變異豐富，是研究基因型和表型關(guān)系不可多得的遺傳材料。鵪鶉的羽色遺傳很復(fù)雜，通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)等方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多個(gè)與鵪鶉羽色有關(guān)的基因座，不同羽色的鵪鶉突變體都是由野生型羽色鵪鶉不斷突變累積形成的。本研究得到7個(gè)與羽色有關(guān)的候選基因，分別為、、452、1、1、174和?；蚴抢野彼崦讣易宓闹匾蓡T之一，在皮膚、羽毛和視網(wǎng)膜顏色的表達(dá)中起重要作用。本研究表明，基因在栗羽鵪鶉中表達(dá)水平較高，這與朱鹮繁殖時(shí)期皮膚中基因上調(diào)的研究結(jié)果一致。Sultana等研究也表明，基因位點(diǎn)的改變與鴨的羽毛著色有很大關(guān)聯(lián)?；蛟诒本┌子瘗g鶉中幾乎不表達(dá)，使黑色素細(xì)胞無(wú)法合成真黑色素，導(dǎo)致出現(xiàn)白色羽毛表型?；蛲ㄟ^(guò)維持GPR143的穩(wěn)定性參與黑色素的生成。Xi等發(fā)現(xiàn)，基因mRNA表達(dá)發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致鴨羽毛產(chǎn)生差異。Yao等研究表明，基因在淺色綿羊體內(nèi)表達(dá)量偏低，這與基因在北京白羽鵪鶉中表達(dá)量低相一致?？赡苁潜本┌子瘗g鶉皮膚中mRNA的翻譯過(guò)程受到抑制，無(wú)法正常合成相應(yīng)蛋白。452基因主要是色素細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其多態(tài)性與色素沉著變化有關(guān)。在本研究中，452基因在北京白羽鵪鶉中表達(dá)下調(diào)，這與浣熊犬毛色研究結(jié)果一致。452基因在鵪鶉皮膚中如何調(diào)控，有哪些基因與非編碼RNA參與了這一過(guò)程還有待進(jìn)一步研究。1基因是參與黑色素生物合成的酶之一，它與酪氨酸酶具有高度的序列同源性。Li等通過(guò)基因定位和基因捕獲發(fā)現(xiàn)，1的突變與雞的巧克力色有關(guān)，1突變導(dǎo)致5，6-二羥基吲哚無(wú)法轉(zhuǎn)化為真黑素。Weng等研究發(fā)現(xiàn)，1基因在五花黃雞中表達(dá)量低，這與1基因在北京白羽鵪鶉中低表達(dá)相一致。1的表達(dá)與黑色素細(xì)胞中黑色素的含量呈正相關(guān)。本研究表明，1基因在栗羽鵪鶉各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均顯著高于北京白羽鵪鶉；Xu等發(fā)現(xiàn)，1通過(guò)影響黑色素細(xì)胞中黑色素的含量，導(dǎo)致五指山豬(黑背白腹)同一個(gè)體的毛色發(fā)生變化，由此推斷1基因在毛色形成過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。174基因在毛色方面的研究鮮有報(bào)道，有研究發(fā)現(xiàn)，174與羅德島雞的耳垂顏色有關(guān)，RNA-seq和qRT-PCR結(jié)果均表明，174基因在栗羽鵪鶉不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均上調(diào)，且差異極顯著，這為后續(xù)研究其在毛色方面的作用機(jī)制提供了參考。是調(diào)節(jié)黑色素生成、控制黑色素細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵基因，的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的毛發(fā)和皮膚顏色改變，羊駝中經(jīng)典的灰色表型是外顯子3(c.376G>A)突變的結(jié)果；在本研究中，基因在白羽鵪鶉中低表達(dá)?；虿槐磉_(dá)或較少表達(dá)會(huì)使酪氨酸激酶受體減少，間接影響黑色素的生成過(guò)程，導(dǎo)致鵪鶉白色羽毛表型的形成。

綜上所述，7個(gè)候選基因均參與了黑色素的合成或運(yùn)輸，且在鵪鶉羽色形成過(guò)程中起到重要作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉的皮膚組織進(jìn)行了RNA-seq分析，篩選得到與羽色性狀形成相關(guān)的7個(gè)差異表達(dá)基因，獲得了候選基因的功能、分類(lèi)與代謝途徑，進(jìn)一步驗(yàn)證了黑色素合成通路與酪氨酸代謝通路在鵪鶉羽色形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可為今后開(kāi)展鵪鶉羽色性狀相關(guān)基因、自別雌雄的研究與分子調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。