唐曉山，侯小琴，孫力軍，*，房志家，鄧 旗

(1.嶺南師范學院 分析測試中心，廣東 湛江 524048；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088)

近年來，病死畜禽的無害化處理工作引起了社會各界的高度重視，各地陸續(xù)建立起病死畜禽無害化處理機構(gòu)。病死畜禽經(jīng)高溫化制后會產(chǎn)生大量的肉骨粉，但由于患病動物在治療過程中使用了大量的抗生素，這些肉骨粉中的抗生素殘留嚴重超標，限制了其在飼料中的應用，大多只能被直接丟棄，既造成資源的浪費，又污染了環(huán)境。目前，患病動物無害化處理后的下腳料(肉骨粉)產(chǎn)量很大，且具有較高的營養(yǎng)價值，因此產(chǎn)業(yè)和市場都迫切需要開發(fā)高效、安全、低成本的患病動物肉骨粉減害化、高值化加工技術(shù)。

有研究表明，抗菌脂肽在植物病蟲害防治方面有重要作用?？咕某丝梢灾苯右种撇≡⑸锏纳L之外，還可以增強植物的免疫力，增強植物抗性潛力。Touré等將一株可產(chǎn)生抗菌脂肽(伊枯草菌素、豐原素和表面活性素)的枯草芽孢桿菌應用于蘋果采后的真菌防治中，發(fā)現(xiàn)無論是該菌體還是其發(fā)酵液均能有效降低疾病的發(fā)生。曹婷婷等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的捷安肽素可以有效防治采后柑橘青綠霉菌病。作者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌NT-6能有效降解患病動物肉骨粉中的抗生素，并且可以產(chǎn)生大量的能夠有效防治植物霉菌病的脂肽類化合物。因此，利用納豆芽孢桿菌NT-6發(fā)酵患病動物肉骨粉，不僅可以降解肉骨粉中的抗生素，還可以生產(chǎn)微生物肥料，對生態(tài)環(huán)境保護、工農(nóng)業(yè)發(fā)展均具有積極意義。

本研究擬利用患病畜禽肉骨粉作為主要發(fā)酵基質(zhì)，以納豆芽孢桿菌NT-6作為發(fā)酵菌和功能菌，制作具有抑制立枯絲核菌(Kühn)功效的新型微生物肥料。首先，利用單因素試驗和響應面設計優(yōu)化發(fā)酵條件，確定最佳生產(chǎn)工藝條件；然后，利用盆栽試驗探索成品微生物肥料對立枯絲核菌的抗性，以期開辟患病動物肉骨粉綜合利用的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌NT-6、立枯絲核菌SK215，均來源于廣東海洋大學食品科技學院CAMT團隊；供試肉骨粉來源于湖北省某病死畜禽無害化處理公司；豐順番茄，購于湛江市大地蔬菜種子有限公司；麩皮，購于湛江市赤坎華強面粉廠；稻殼，購于湛江市霞山區(qū)盛玉米廠；供試土壤，采自廣東海洋大學農(nóng)學院海博樓；營養(yǎng)瓊脂，購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

主要儀器包括：SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Gerhardt牌全自動凱式定氮儀，德國Gerhardt。

1.2 NT-6與SK215的拮抗培養(yǎng)試驗

將斜面保藏的NT-6和SK215各挑1環(huán)分別進行三區(qū)劃線，于37 ℃培養(yǎng)24 h，完成菌株活化。挑取活化后的單菌落加到LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min振蕩培養(yǎng)24 h，得測試菌液。

將PDA培養(yǎng)基與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以1∶1的比例混合，制作成既適合SK215生長、又適合NT-6生長的混合培養(yǎng)基。先在平皿底部倒制一層薄薄的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待其冷卻后，在上面再倒上制好的混合培養(yǎng)基，冷卻后，在平皿的中央位置采用點植法接種SK215，于28 ℃培養(yǎng)2 d。之后，在SK215菌落附近(相隔0.5 cm)在上下左右4個位置各用接種環(huán)點接NT-6菌種，于28 ℃培養(yǎng)2～4 d，觀察平板上SK215菌落的生長狀況。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的計數(shù)

挑取一環(huán)斜面上的NT-6于LB肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r·min振蕩培養(yǎng)24 h，得到NT-6種子液。

將一定量的肉骨粉、麩皮和稻殼混勻，裝入250 mL錐形瓶內(nèi)，加入一定量的水，制成發(fā)酵基質(zhì)，將發(fā)酵基質(zhì)的pH值調(diào)至7.0左右，121 ℃滅菌15～20 min，取出冷卻至室溫后，按照50 mL·kg的接種比例NT-6種子液，30 ℃發(fā)酵，每6 h攪拌一次。

發(fā)酵完成后，利用梯度稀釋法將發(fā)酵產(chǎn)物制成1×10、1×10、1×10的稀釋液，采用稀釋涂布平板法涂布LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，取出后計數(shù)。菌量多時，采取四分法計數(shù)。每組試驗設置3個平行。

1.4 基于單因素試驗設計的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 水分含量

將發(fā)酵基質(zhì)中肉骨粉與麩皮的質(zhì)量分別設定為8 g與2 g，再添加稻殼0.8 g，將發(fā)酵基質(zhì)中的水分含量分別設為總發(fā)酵物質(zhì)量的0、31.6%、48.1%、58.1%、64.9%(即分別加水0、5、10、15、20 mL，下同)，30 ℃發(fā)酵24 h，測定NT-6菌量。

1.4.2 肉骨粉與麩皮的配比

將發(fā)酵基質(zhì)中的肉骨粉與麩皮按照10∶0、9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8∶2、7.5∶2.5的質(zhì)量比混合(總質(zhì)量為10 g)，再添加稻殼0.8 g，加水15 mL，將初始pH值調(diào)至7.0，30 ℃發(fā)酵24 h，測定NT-6菌量。

1.4.3 稻殼添加量

將發(fā)酵基質(zhì)中肉骨粉與麩皮的質(zhì)量分別設定為8 g與2 g，再分別添加稻殼0、0.4、0.8、1.2、1.6 g，加水15 mL，將初始pH值調(diào)至7.0，30 ℃發(fā)酵24 h，測定NT-6菌量。

1.4.4 發(fā)酵時間

將發(fā)酵基質(zhì)中肉骨粉與麩皮的質(zhì)量分別設定為8 g與2 g，再分別添加稻殼0.8 g，加水15 mL，將初始pH值調(diào)至7.0，30 ℃分別發(fā)酵24、48、72、96、120 h，測定NT-6菌量。

1.5 基于響應面法的發(fā)酵條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵基質(zhì)中的水分含量()、肉骨粉與麩皮的配比()、稻殼添加量()、發(fā)酵時間()作為考查因素，以菌量為考查指標，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計，共29組試驗，每組試驗均設置3個平行。其中，、、、的3個編碼水平(-1、0、1)分別對應于50%、60%、70%，9∶1、8∶2、7∶3，0.4、0.8、1.2 g，72、96、120 h。通過響應面試驗，優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.6 基于蛋白質(zhì)降解率的發(fā)酵終點確定

除發(fā)酵時間外，按照1.5節(jié)得到的最佳發(fā)酵條件重新發(fā)酵一批肉骨粉，每2 d檢測一次發(fā)酵基質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解率。當?shù)鞍踪|(zhì)的降解率基本穩(wěn)定時，判斷為發(fā)酵終點，然后于55 ℃恒溫鼓風干燥，包裝。

蛋白質(zhì)降解率的測算方法簡述如下：采用微量凱氏定氮法測定總氮含量；采用水合茚三酮比色法測定氨基酸態(tài)氮含量；用15%(體積分數(shù))TCA(三氯乙酸)沉淀去除蛋白后，再用微量凱氏定氮法測氮，折算非蛋白氮含量。從總氮中減去氨基酸態(tài)氮和非蛋白氮，即得蛋白質(zhì)態(tài)氮含量。通過發(fā)酵前、后樣品中蛋白質(zhì)態(tài)氮含量的變化，折算蛋白質(zhì)降解率(%)。

1.7 成品微生物肥料的應用效果試驗

按照1.5節(jié)得到的最佳發(fā)酵條件發(fā)酵12 d，將發(fā)酵產(chǎn)物于55 ℃干燥，制成成品微生物肥料，并在其有效期內(nèi)開展應用效果試驗。

在事先制好的SK215菌株斜面上加入少量無菌水(水量以剛好浸沒菌絲為宜)，制成菌絲液，在旋渦混合器上震蕩，使菌絲分散均勻，按菌絲液100 mL、園土1 kg的比例將菌絲液加入原土中，混合翻拌，制成染菌園土。

參照文獻[9-10]的方法開展試驗。設置4個處理：T1，園土(未染菌，以下不做特殊說明的，園土即指未染菌的園土)+微生物肥；T2，園土；T3，染菌園土+微生物肥；T4，染菌園土。每個處理設置2個平行。每個平行試驗對應于1個直徑25 cm的塑料花盆，盆內(nèi)含有1 kg園土或染菌園土。對于處理T1和T3，向1 kg園土或染菌園土中加入20 g制成的成品微生物肥料。各處理下，每盆均播種10粒番茄種子，放在陽光充足的陽臺，每隔2 d澆適量水，定期觀察各盆種子的發(fā)芽情況和幼苗死苗情況，生長30 d時用游標卡尺測量植株地上部高度(株高)，并用天平稱量地上部鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 NT-6與SK215拮抗培養(yǎng)試驗結(jié)果

NT-6與SK215的拮抗培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，NT-6菌株周圍有明顯的抑菌圈(圖1)，說明NT-6可以抑制立枯絲核菌SK215的生長。

圖1 NT-6(四點)抑制SK215生長出現(xiàn)抑菌區(qū) Fig.1 NT-6(four dots)inhibits growth of SK215

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 水分含量對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響

水分是微生物賴以生存的必要條件，水分含量過低或過高都會影響微生物的生長代謝。發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量隨著發(fā)酵基質(zhì)中水分含量的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖2)，當水分含量為60%時，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量最多，達1.03×10CFU·g。

圖2 水分含量對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響Fig.2 Effect of moisture content on NT-6 quantity in fermentation product

2.2.2 肉骨粉與麩皮的配比對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響

發(fā)酵基質(zhì)的營養(yǎng)成分會影響細菌的生長繁殖。肉骨粉富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，但其基本呈粉末狀，且黏度較大，而麩皮呈干燥顆粒狀態(tài)。隨著麩皮添加量的增多，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量先增加后略降(圖3)，當肉骨粉與麩皮的配比為8∶2時，NT-6菌量最大，為2.86×10CFU·g。

圖3 肉骨粉與麩皮的配比對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響Fig.3 Effect of ratio of meat bone to bran on NT-6 quantity in fermentation products

2.2.3 稻殼添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響

NT-6菌株在生長繁殖過程中需要氧氣，向發(fā)酵基質(zhì)中添加適當量的稻殼可增加發(fā)酵基質(zhì)的通氣量。隨著稻殼添加量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖4)，當?shù)練ぬ砑恿繛?.8 g時，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量最大，為6.74×10CFU·g。

圖4 稻殼添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響Fig.4 Effect of addition amount of rice husks on NT-6 quantity in fermentation product

2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響

在96 h內(nèi)，發(fā)酵時間越長，發(fā)酵產(chǎn)物中的菌量越多，之后微生物代謝趨于穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)物中的菌量基本不變(圖5)。當發(fā)酵時間為96 h時，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量最大，為2.9×10CFU·g。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on NT-6 quantity in fermentation products

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化的響應面試驗結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設計水平編碼表，以發(fā)酵產(chǎn)物中的菌量為考查指標，設計試驗，將試驗設計與其結(jié)果整理于表1。

表1 響應面試驗設計與結(jié)果Table 1 Response surface design and results

對響應面試驗結(jié)果進行多元回歸分析，得到發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的預測值()對自變量(水分含量)、(肉骨粉與麩皮的配比)、(稻殼添加量)、(發(fā)酵時間)編碼水平的二次多元回歸方程，剔除掉非顯著項后，擬合的回歸方程為=29.05-0.30+012+016+210-137-043+118+029-180-1.37-2.07-7.69。

對擬合的回歸方程進行多因素方差分析：回歸方程的<0.000 1，而失擬項的=0.179 2>0.05，說明其他因素對試驗結(jié)果的干擾很??；回歸方程的決定系數(shù)()為0.999 8，校正的決定系數(shù)為0.999 6，說明菌量的實測值與預測值之間擬合度良好，能較好地反映發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量與4個因素之間的關系。由值判斷，4個因素對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量影響的顯著性從高到低依次為發(fā)酵時間>水分含量>稻殼添加量>肉骨粉與麩皮的配比。

響應面越陡峭，平面等高線圖越接近橢圓，說明兩因素的交互作用越明顯，反之亦然。由圖6可知，水分含量和肉骨粉與麩皮的配比、發(fā)酵時間和水分含量、發(fā)酵時間和肉骨粉與麩皮的配比、發(fā)酵時間和稻殼添加量交互作用明顯，而稻殼添加量和水分含量、稻殼添加量和肉骨粉與麩皮的配比的交互作用不明顯。

基于上述試驗結(jié)果，由軟件計算得到的最佳發(fā)酵條件如下：肉骨粉與麩皮的配比為7.8∶2.2，發(fā)酵時間為99.80 h，水分含量為58.19%，稻殼添加量為0.82 g，在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量的預測值為2.93×10CFU·g。為了操作方便，將發(fā)酵時間改為100 h，其他條件保持不變，經(jīng)實測，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量為2.92×10CFU·g，與預測值無顯著差異，說明優(yōu)化的發(fā)酵條件可靠。

A，水分含量；B，肉骨粉與麩皮的配比；C，稻殼添加量；D，發(fā)酵時間。A，Moisture content;B，Ratio of meat bone to bran;C，Addition amount of rice husks;D，F(xiàn)ermentation time.圖6 兩因素交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物中NT-6菌量影響的響應面圖Fig.6 Interaction of two factors on response surface of NT-6 quantity in fermentation products

2.4 發(fā)酵終點確定

發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵基質(zhì)中的總氮含量基本不變，而氨基酸態(tài)氮含量和非蛋白氮含量逐漸增加。計算蛋白質(zhì)降解率，并做變化趨勢圖(圖7)，可以看出，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)降解率先增加后趨穩(wěn)。第12天時，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量為2.85×10CFU·g，與響應面試驗發(fā)酵產(chǎn)物中的最大菌量相當，且蛋白質(zhì)降解率已基本穩(wěn)定，因此將第12天確定為發(fā)酵終點。

圖7 蛋白質(zhì)降解率隨發(fā)酵時間的動態(tài)變化Fig.7 Dynamics of protein degradation rate

2.5 微生物肥料的應用效果

農(nóng)作物種子的出芽率其實與微生物肥的聯(lián)系不大，絕大部分是由種植時的空氣、水分、溫度和種子的質(zhì)量等決定的。將4個處理下番茄的發(fā)芽和生長狀況整理于表2。染菌園土(T4)處理的出芽數(shù)最低，死苗數(shù)最高，明顯受到立枯絲核菌的影響。與之相比，其他處理的出芽數(shù)明顯提高，而死苗數(shù)降低。與未染菌園土(T2)相比，染菌園土+微生物肥(T1)或未染菌園土+微生物肥(T3)條件下，番茄的出芽數(shù)、死苗數(shù)無明顯區(qū)別，但株高、鮮重均得到提高，且幼苗長勢旺盛，根系較粗較多，而不用微生物肥(T2、T4)的幼苗長勢較差，根系較細較少。

表2 不同處理下番茄種子的發(fā)芽與生長狀況Table 2 Seeds germination and seedling growth of tomato under different treatments

3 討論

本研究利用患病動物肉骨粉作為主要基質(zhì)，將NT-6作為發(fā)酵菌和功能菌，制備微生物肥料。經(jīng)單因素試驗和響應面法優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵工藝條件如下：肉骨粉與麩皮的配比為7.8∶2.2，水分含量58.19%，稻殼添加量0.82 g，發(fā)酵時間100 h。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中的NT-6菌量達2.92×10CFU·g。在前述試驗條件下，發(fā)酵12 d，制備微生物肥料，所得的成品肥料中NT-6菌量達到10CFU·g以上。

農(nóng)作物的莖基腐病是由立枯絲核菌引起的。本試驗發(fā)現(xiàn)，該微生物肥料不但可促進番茄生長，還能減少莖基腐病的發(fā)生，降低病死苗的數(shù)量。在園土上直接應用該微生物肥料并不能提高種子的發(fā)芽率，這可能是由于種子出芽率受土壤營養(yǎng)的影響較小，主要與其自身質(zhì)量有關。

本研究既實現(xiàn)了肉骨粉的高值化利用，提高了資源利用率，又有效減少了環(huán)境污染，實現(xiàn)了廢棄下腳料的高效利用，而且工藝簡單。

但要說明的是，本研究仍處于實驗室研究階段，若要開展工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)，相關工藝仍需進一步優(yōu)化。一般來說，微生物肥的應用效果不僅受到原料本身的影響，還與應用時的環(huán)境條件相關。當前，作為本試驗原材料的肉骨粉品質(zhì)尚難以控制，因此其大規(guī)模生產(chǎn)后的真正使用效果恐與預期效果有差距。這些都還有待進一步的考查與改進。