基于數(shù)據(jù)非依賴性采集質(zhì)譜技術(shù)對注射用曲妥珠單抗及其類似藥結(jié)構(gòu)的表征及相似性研究*

李克，李恒，周琴

(1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所藥物制劑質(zhì)量研究與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075；2.江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033)

抗體藥物發(fā)展歷史僅有三十多年，近5年來開始進(jìn)入爆發(fā)階段。僅2020年，美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)抗體藥物12個；中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市抗體藥物25個，包括國產(chǎn)品種7個，進(jìn)口品種18個，獲批的國產(chǎn)抗體藥物以生物類似藥為主[1]。類似藥的開發(fā)可極大縮短企業(yè)研發(fā)產(chǎn)品的時間和降低費(fèi)用，降低相關(guān)藥品價格，使患者受益。與小分子藥物相比，抗體藥物的相對分子質(zhì)量(Mr)大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均一，開發(fā)難度和技術(shù)要求較高，因此，生物類似藥如何在結(jié)構(gòu)和功能上盡可能與原研藥相似，包括確認(rèn)蛋白質(zhì)藥物一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列、二硫鍵、翻譯后修飾(PTMs)以及不同批次間比較性研究的數(shù)據(jù)等[3-4]，對生物制藥行業(yè)是一個巨大的挑戰(zhàn)。

數(shù)據(jù)非依賴性采集(data-independent acquisition，DIA)技術(shù)是近幾年新出現(xiàn)的蛋白組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的需要選擇特定母離子進(jìn)行碎裂的數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent acquisition，DDA)技術(shù)，DIA可采集所有的碎片離子信息，從而具有全景式掃描、數(shù)據(jù)可回溯等優(yōu)勢[3]。得益于數(shù)據(jù)分析和質(zhì)譜采集速度、質(zhì)量精度和分辨率的顯著進(jìn)步，近幾年來DIA技術(shù)發(fā)展迅速。高質(zhì)量的DIA定量技術(shù)作為蛋白質(zhì)組定量新技術(shù)將會被逐漸推廣并應(yīng)用于抗體藥物結(jié)構(gòu)表征的研究中。筆者在本研究應(yīng)用DIA的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(DIA LC-MS/MS)[5]技術(shù)對注射用曲妥珠單抗(赫賽汀)生物類似藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并與原研藥進(jìn)行相似性比較，證明赫賽汀生物類似藥與原研藥相似，DIA質(zhì)譜技術(shù)可用于抗體藥物的結(jié)構(gòu)表征。

1 材料與方法

1.1儀器 ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Xevo G2 QTof MS串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，控制儀器和采集數(shù)據(jù)的MassLynx 4.1軟件，處理數(shù)據(jù)的UNIFI 1.8軟件(包含UNIFI Workstation Large Molecule Option及UNIFI Glycan Library)，均為美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2試藥 赫賽汀(上海羅氏制藥有限公司，批號：S20170008)，赫賽汀生物類似藥(武漢友芝友生物制藥有限公司提供)。鹽酸胍[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：V900385]、碘乙酰胺[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：16125-5g]、胰蛋白酶[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，批號：V511A]、二硫蘇糖醇[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，含量>99%，批號：161-0610]、碳酸氫銨(霍尼韋爾國際公司，含量>99%，批號：09830-5009)、甲酸(百靈威科技有限公司，含量98%，批號：942988)、乙腈[默克化工技術(shù)(上海)有限公司，含量>99.9%，批號：75-05-8]。 用于流動相及樣品制備的去離子水均通過默克密理博Milli-Q水系統(tǒng)制備而得。

1.3抗體完整蛋白的分析

1.3.1樣品處理 取抗體溶液(5 mg·mL-1)100 μL，加入超純水稀釋至1 mg·mL-1；進(jìn)行離心(4000 r·min-1，r=32 mm，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進(jìn)儀器檢測。

1.3.2色譜條件(UPLC) 色譜柱為MassPREP在線脫鹽小柱；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.2 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→30：5→70)；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件 正離子模式，脫溶劑氣體溫度400 ℃，源溫度100 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，數(shù)據(jù)采集范圍：500～5000 Da。

1.4抗體輕鏈與重鏈的分析 取抗體溶液(5 mg·mL-1)20 μL，加入水稀釋至100 μL，加二硫蘇糖醇(DTT)溶液8 μL，50 ℃金屬浴30 min，放冷至室溫。加入0.5 mL 10K超濾管中，離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。取下層液，進(jìn)行離心(4000 r·min-1，r=32 mm，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進(jìn)儀器檢測。

1.4.1色譜條件(UPLC) 色譜柱為MassPREP在線脫鹽小柱；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.2 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→5：5→95)；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 正離子模式，脫溶劑氣體溫度400 ℃，源溫度100 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，數(shù)據(jù)采集范圍：500～5000 Da。

1.5抗體肽圖分析

1.5.1樣品處理 取抗體溶液100 μL，加入鹽酸胍溶液250 μL，加二硫蘇糖醇(DTT)溶液8 μL，37 ℃金屬浴1 h。取出樣品，加碘乙酰胺溶液17 μL，室溫避光放置30 min。加入0.5 mL 10K超濾管中，離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。離心后棄去下層濾液，向上層管加入酶切緩沖溶液(碳酸氫銨25 mM)0.4 mL，再次離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。重復(fù)上步操作，離心時間改為5 min。離心后，將上層管中的濃縮液轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中。加入活化后的胰蛋白酶溶液(Trypsin酶切位點(diǎn)：K賴氨酸、R精氨酸羧基端)100 μL，渦旋混勻，37℃金屬浴孵化過夜(16～18 h)。取出樣品，加入10%甲酸溶液10 μL。對酶解后的樣品進(jìn)行離心(4000 r·min-1，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進(jìn)儀器檢測。

1.5.2色譜條件(UPLC) 色譜柱為 ACQUITYUPIC BEH 130 C18(150 mm×2.1 mm，17 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.3 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→30：5→70)；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.3質(zhì)譜條件 與“1.3.3”項(xiàng)相同。

①DIA掃描參數(shù)及校正設(shè)置，通過質(zhì)譜碰撞池內(nèi)等頻率交替進(jìn)行低碰撞能量(6 V)和高碰撞能量(20～30 V)切換，分別獲得各個肽段母離子一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及其二級碎片數(shù)據(jù)；校正設(shè)置：用嵌入式輔助泵持續(xù)注射1 g·L-1亮氨酸腦啡肽溶液(溶于50%乙腈水溶液，添加0.1%甲酸)，流速0.2 mL·min-1，用于獲得Lock-mass參比質(zhì)量信號，對所測得的質(zhì)量數(shù)進(jìn)行實(shí)時校正。

②UNIFI軟件參數(shù)的設(shè)置，選擇胰蛋白酶(Trypsin)完全裂解作為確定抗體藥物一級序列的軟件參數(shù)，肽段漏切(Miss cleavages)設(shè)為1，不考慮非特異性酶切對序列覆蓋率的貢獻(xiàn)。賴氨酸末端缺失(M-128.09)、半胱氨酸脲甲基化(Mr+57.00)、N-去酰胺化(天冬氨酸和異天冬氨酸產(chǎn)物，Mr+0.98)，M-氧化(Mr+15.99)和已知的存在于抗體藥物中的寡糖選為可變修飾。母離子和碎片離子的質(zhì)量偏差均設(shè)為3/100 000。

2 結(jié)果

2.1抗體完整蛋白的分析 赫賽汀單抗包含2條輕鏈和2條重鏈，輕鏈和重鏈通過二硫鍵相連接[6]。應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，測定單抗完整蛋白，利用UNIFI軟件內(nèi)嵌入的MaxEnt 1算法對采集到的多價態(tài)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積化處理，得到赫賽汀單抗類似藥分子的平均Mr。單抗原研藥和類似藥去卷積化處理后的質(zhì)譜圖(圖1)顯示，類似藥和原研藥Mr一致，赫賽汀類似藥與原研藥相對分子質(zhì)量的偏差在1Da以內(nèi)。單抗的的質(zhì)譜圖呈現(xiàn)多個質(zhì)譜峰，這些質(zhì)量峰是由重鏈Fc區(qū)不同N-聚糖所致[7-8]。

圖1 去卷積化赫賽汀與類似藥的質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.1 Herceptin (red) and biosimilar (blue) mass deconvolution spectrum

2.2抗體亞基輕鏈、重鏈的分析結(jié)果 單抗還原后解離為2條輕鏈和2條重鏈。通過對輕鏈和重鏈進(jìn)行質(zhì)譜分析和去卷積化處理，可得到輕鏈和重鏈的準(zhǔn)確Mr[9]。赫賽汀單抗類似藥輕鏈和重鏈去卷積化處理后的質(zhì)譜圖顯示(圖2，3)，單抗類似藥輕鏈和重鏈的Mr都與原研藥一致。由于重鏈存在不同的糖基化修飾，圖3呈現(xiàn)多個質(zhì)量峰。

圖2 赫賽汀和類似藥輕鏈的去卷積化質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.2 Herceptin (red) and biosimilar (blue) light chain mass deconvolution spectrum

圖3 赫賽汀和類似藥重鏈的去卷積化質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.3 Herceptin (red) and biosimilar (blue) heavy chain mass deconvolution spectrum

2.3抗體肽圖分析結(jié)果 應(yīng)用DIA質(zhì)譜技術(shù)對單胰蛋白酶酶切后檢測到的106個肽段進(jìn)行肽圖分析，類似藥的氨基酸序列覆蓋率可達(dá)99%以上。根據(jù)碎片離子數(shù)據(jù)以及通過各個CDR區(qū)(complementarity determining region)與參考峰的相對保留時間來標(biāo)注單抗的CDR肽段(圖4)。并將原研藥與類似藥的CDR肽段，進(jìn)行比較分析，輕鏈上3個CDR區(qū)序列完全一致，類似藥重鏈上CDR序列雖然被切到2個肽段，但主體一致，且重鏈上另2個CDR區(qū)序列完全一致，表明類似藥與原研藥的氨基酸序列相同(CDR信息源自IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/2Dstructure-DB數(shù)據(jù)庫)。

圖4 赫賽汀肽圖(上原研藥、下類似藥)Fig.4 Herceptin (red) and biosimilar (blue) peptide map

對表面甲硫氨酸容易氧化的肽段進(jìn)行位點(diǎn)鑒定(非變性條件下氧化)[10-11]，發(fā)現(xiàn)該抗體表面存在容易氧化的肽段6個。其中重鏈上分布5個，輕鏈上分布1個，且HC-CDR3上1個甲硫氨酸易被氧化；經(jīng)UNIFI軟件處理，通過高能量碎裂得到的“b，y”離子的準(zhǔn)確質(zhì)量，確認(rèn)了這些肽段的信息[12](圖5)。

圖5 易氧化肽段的二級碎片(b，y)離子信息Fig.5 Secondary fragment (b, y) ion information of easily oxidized peptides

基于二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的肽圖分析顯示，該單抗的N-聚糖修飾發(fā)生在重鏈的第25個酶切肽段。將利妥原研藥和類似藥的H：T25肽段質(zhì)譜圖進(jìn)行比較顯示，二者的糖基化修飾一致(圖6、圖7)。

圖6 赫賽汀 H：T25肽段質(zhì)譜圖Fig.6 H：T25 peptide mass spectrum of herceptin

圖7 類似藥H：T25肽段質(zhì)譜圖Fig.7 H：T25 peptide mass spectrum of biosimilar

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)依托DIA質(zhì)譜技術(shù)建立了一套抗體類藥物的結(jié)構(gòu)鑒定方法。分別從完整蛋白的層面、抗體輕重鏈的層面以及肽圖的層面，多維度對抗體藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析；并將赫賽汀類似藥與原研藥進(jìn)行比較，根據(jù)以上3個不同層面分析結(jié)果的相互驗(yàn)證補(bǔ)充，可以對抗體類藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。

完整蛋白的質(zhì)譜分析有助于確定生物分子是否得到正確表達(dá)以及翻譯后修飾(PTM)是否正確，可總體呈現(xiàn)該蛋白的非均一性特征。輕、重鏈的質(zhì)譜分析可以從亞基水平上確定蛋白的Mr，考察蛋白的非均一性特征。在此項(xiàng)研究中，應(yīng)用LC/MS獲得了抗體類藥物的完整蛋白及輕鏈和重鏈的Mr，同時確認(rèn)了糖基化修飾發(fā)生在該抗體分子的重鏈。相對于完整蛋白分析，將類似藥亞基的Mr與原研藥進(jìn)行比較，可根據(jù)Mr的差別初步判定二者的一級氨基酸序列是否一致；若Mr存在差異，也可判定出差異是位于輕鏈或者重鏈。同時鑒于還原后的單抗單條重鏈僅含1個N-聚糖，糖基化修飾相對簡單，可排除由多個不同糖鏈引起的Mr的差別，從而更直接的反應(yīng)蛋白本身序列的差異。

肽圖分析是分析抗體藥物表征工作中非常重要的內(nèi)容，能獲得最全面的理化和結(jié)構(gòu)信息。DIA質(zhì)譜技術(shù)將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個可變窗口，根據(jù)m/z分布密度計(jì)算合理的窗口寬度和數(shù)量，高速、循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測，該技術(shù)無需指定目標(biāo)肽段，掃描點(diǎn)數(shù)均勻，可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數(shù)據(jù)利用度大大提高，缺失值更少。在此項(xiàng)研究中，一次液質(zhì)分析可同時獲得高精確的母離子及碎片離子信息，由“低碰撞能”與“高碰撞能”兩種掃描交替構(gòu)成，分別記錄母離子及碎片信息，并通過母離子與其碎片離子具有相同色譜行為的特性進(jìn)行母子離子的關(guān)聯(lián)歸屬[13-15]。基于質(zhì)譜檢測的肽圖分析可以非常方便地對蛋白質(zhì)PTM 進(jìn)行詳盡且全面的表征。DIA質(zhì)譜技術(shù)獲得的碎片離子信息(二級質(zhì)譜數(shù)據(jù))可用于序列分析和PTM 的確定。在此項(xiàng)研究中，基于DIA質(zhì)譜技術(shù)的肽圖分析顯示，類似藥的氨基酸序列覆蓋率可達(dá)99%以上，同時還獲得了PTM 的鑒定結(jié)果。根據(jù)不同層面分析結(jié)果的相互驗(yàn)證補(bǔ)充，可證明赫賽汀單抗類似藥與原研藥的糖基化修飾十分相似。

DIA質(zhì)譜技術(shù)可用于赫賽汀及其類似藥的結(jié)構(gòu)表征和相似性比較研究，為今后其他抗體藥物結(jié)構(gòu)表征平臺的建立提供了依據(jù)。