高效液相色譜法測(cè)定靈芝中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉含量

馮凱 宋純艷 付彤

建立高效液相色譜法測(cè)定靈芝中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉含量的測(cè)定方法。采用高效液相色譜法，色譜柱為C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速為1.0mL/min，波長(zhǎng)為230nm，流動(dòng)相為0.02moL/L乙酸銨：甲醇（95：5），樣品經(jīng)粉碎后，沉淀蛋白質(zhì)，加水超聲并提取，離心后經(jīng)濾膜過(guò)濾注入液相色譜儀。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的分離度較大，加標(biāo)回收率范圍在92.4%-101.2%之間;相關(guān)系數(shù)（r）大于0.9999，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系;檢出限是0.168mg/kg-0.555mg/kg，定量限是0.560mg/kg-1.850mg/kg。由此可以得出結(jié)論，該方法處理快速，分離效果好，適用于真菌類(lèi)食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的檢測(cè)。

靈芝是多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥子實(shí)體。靈芝的化學(xué)成分豐富，主要包括多糖成分，核苷酸，生物堿類(lèi)、三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、甾體、多肽化合物，脂肪酸、氨基酸、微量元素等。靈芝作為傳統(tǒng)食用菌，具有較多藥理作用，近代臨床應(yīng)用普遍，可以保護(hù)肝臟、抗氧化及提高免疫力、抗癌癥、改善機(jī)體代謝。野生靈芝對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較高，造成產(chǎn)量較低，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)靈芝的需求。這就需要人工栽培來(lái)增加靈芝的產(chǎn)量。但在人工栽培過(guò)程中，由于栽培方式及氣候環(huán)境不同，會(huì)引起靈芝的質(zhì)量參差不齊，這就需要使用添加劑來(lái)改善產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)在，在國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)批準(zhǔn)使用的食品添加劑中，防腐劑有苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等，甜味劑有安賽蜜、糖精鈉等。苯甲酸是以石油甲苯為原料，經(jīng)催化氧化、精制提純得到的;山梨酸是用丁烯醛、乙酸反應(yīng)制得的;糖精鈉是以苯二甲酸酐為原料化學(xué)合成的。苯甲酸、山梨酸是防腐劑，能夠抑制微生物生長(zhǎng)，可用來(lái)殺菌保鮮，延長(zhǎng)保存時(shí)間;糖精鈉是甜味劑，甜度是蔗糖的300-500倍，可用來(lái)改善口感。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是食品生產(chǎn)中常用的防腐劑和甜味劑。但是過(guò)量使用會(huì)產(chǎn)生毒副作用，引發(fā)癌癥，對(duì)人體造成危害，影響食品安全。靈芝是對(duì)人體有益的真菌，既可以用于臨床治療，也可用于預(yù)防疾病，檢測(cè)靈芝中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量具有重要意義。

目前，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的主要檢測(cè)方法有離子色譜法、液相色譜法、氣相色譜法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法是利用流動(dòng)相與固定相對(duì)待測(cè)組分親和力的差異，分離出待測(cè)組分，以保留時(shí)間定性，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)成分的分析。具有適用范圍廣、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本研究參考GB 5009.28-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》，采用高效液相色譜法對(duì)靈芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉進(jìn)行含量測(cè)定，蛋白質(zhì)沉淀劑亞鐵氰化鉀、乙酸鋅快速沉淀蛋白質(zhì)，優(yōu)化了樣品前處理方法及色譜條件，為真菌類(lèi)食品靈芝的防腐劑、甜味劑檢測(cè)提供依據(jù)。

1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

UItimate3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）;C18色譜柱（Thermo Fisher Scientific，Hypersil GOLD AQ）;SB-1500DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;XSE104型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（中國(guó)）有限公司）;TGL-16M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;EUG60-DUV實(shí)驗(yàn)室超純水器（山東尤根環(huán)?？萍加邢薰荆?。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及材料

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）;乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，fisher chemical）;實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水;微孔濾膜（0.22μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 樣品

市售靈芝。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水制成含有苯甲酸、山梨酸、糖精鈉濃度為0、1、5、10、20、50μg/mL的不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 樣品的制備

取樣品適量，粉碎，精密稱(chēng)定2g，加入2mL亞鐵氰化鉀溶液及2mL乙酸鋅溶液，加水至40mL，搖勻，超聲提取20分鐘。隨后移入離心管中，4000r/min離心10分鐘，取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，作為上機(jī)液。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：95%乙酸銨溶液（0.02mol/L）-5%甲醇（0.002%甲酸）為流動(dòng)相，等度洗脫;流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量：10μL。

1.4.4 樣品的測(cè)定

精密量取10μL標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液，注入液相色譜儀，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到樣品溶液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計(jì)）的質(zhì)量濃度。

2. 結(jié)果與分析

2.1 回收率實(shí)驗(yàn)

在樣品11中加入高、中、低3種濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度制備3份樣品溶液測(cè)定，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉回收率范圍分別為92.4%-101.2%、95.7%-100.7%、94.0%-99.5%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份樣品11，按1.4.2樣品的制備項(xiàng)下方法處理樣品，精密量取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的RSD均不大于5%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.4 線(xiàn)性和范圍

精密量取10μL不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入液相色譜儀中，得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉相應(yīng)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)表2。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在0-50μg/mL的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)不低于0.9999，從結(jié)果可以看出，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 檢出限和定量限實(shí)驗(yàn)

方法檢出限（MDL）和定量限（MQL）分別以3倍和10倍的信噪比得結(jié)果計(jì)算，苯甲酸的檢出限為：0.216mg/kg，定量限為：0.719mg/kg;山梨酸的檢出限為：0.168mg/kg，定量限為：0.560mg/kg;糖精鈉的檢出限為：0.555mg/kg，定量限為：1.850mg/kg。方法的檢出限和定量限較低，表明檢測(cè)靈敏度較高，可以達(dá)到分析條件。

2.6 樣品分析結(jié)果

精密量取10μL平行樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)成分的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)成分的濃度，計(jì)算出含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)論

根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，真菌類(lèi)食品中不得使用。不同廠(chǎng)家靈芝中的苯甲酸全部檢出;山梨酸有2個(gè)廠(chǎng)家未檢出，其余廠(chǎng)家檢出;糖精鈉全部未檢出。由測(cè)定結(jié)果可以看出，在靈芝中添加防腐劑苯甲酸、山梨酸是廠(chǎng)家較常用的工藝，有必要對(duì)真菌類(lèi)食品中的苯甲酸、山梨酸的添加情況進(jìn)行監(jiān)管，改進(jìn)生產(chǎn)工藝。

運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定靈芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，前處理操作簡(jiǎn)單，分離度大，精密度高，重復(fù)性好，分析時(shí)長(zhǎng)較短，使用儀器設(shè)備易得，所需樣品、試劑較少。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了液相色譜條件，在流動(dòng)相中加入少量甲酸，可以更好地分離待測(cè)組分與雜質(zhì)，避免了干擾峰對(duì)待測(cè)組分含量引起偏低、偏高或者假陽(yáng)性結(jié)果的情況，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。通過(guò)對(duì)方法學(xué)的精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)、線(xiàn)性及范圍、方法檢出限和定量限的驗(yàn)證，結(jié)果表明，高效液相色譜法測(cè)定靈芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是一種較為有效的方法。本文所建立的靈芝中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的測(cè)定方法，可以了解真菌類(lèi)食品中防腐劑、甜味劑的使用情況，為真菌類(lèi)食品中防腐劑苯甲酸、山梨酸及甜味劑糖精鈉的含量測(cè)定提供技術(shù)支持。

作者簡(jiǎn)介：

馮凱（1984.08-），男，漢族，山東省濟(jì)寧市人，大學(xué)本科，工程師;研究方向：食品檢驗(yàn)檢測(cè)。