大白菜生物鐘突變體 lcc-1 突變表型的遺傳分析

馬孝穎 王浩 任桂康 張?jiān)魄?李巖 趙姣姣 閆奕彤 李昊軒 杜佳寧 于新冊(cè) 崔維霞 甄藝博 盧銀 馮大領(lǐng)

摘要：對(duì)甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的生物鐘長(zhǎng)周期突變體lcc-1、野生型WT、雜交F2群體及回交B1和B2群體進(jìn)行田間表型性狀調(diào)查，并對(duì)下胚軸長(zhǎng)度、現(xiàn)蕾時(shí)間2個(gè)突變性狀進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，lcc-1下胚軸長(zhǎng)度、株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、中肋長(zhǎng)度均極顯著小于WT，現(xiàn)蕾時(shí)間極顯著長(zhǎng)于WT。F2代分離群體遺傳分析結(jié)果表明，下胚軸長(zhǎng)度及現(xiàn)蕾時(shí)間性狀均符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。結(jié)果可為調(diào)控生物鐘和現(xiàn)蕾時(shí)間關(guān)鍵基因的挖掘和基因功能深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：大白菜;生物鐘突變體;遺傳分析;下胚軸長(zhǎng)度

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0117-06

收稿日期：2021-06-27

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：BJ2019020）;大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2020201）。

作者簡(jiǎn)介：馬孝穎（1998—），女，河北張家口人，碩士研究生，主要從事園藝植物育種研究，E-mail：mxy1367234461@163.com;共同第一作者：王 浩（1991—），男，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事植物種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種應(yīng)用研究，E-mail：1731251173@qq.com。

通信作者：盧 銀，博士，講師，主要從事蔬菜分子染色體工程、蔬菜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用研究，E-mail：luagzoujidong@163.com;馮大領(lǐng)，博士，副教授，主要從事大白菜種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種應(yīng)用，E-mail：bjdalingfeng@163.com。

大白菜是我國(guó)重要的葉用蔬菜，也是我國(guó)栽培面積和種植區(qū)域最廣的蔬菜作物之一，深受人們的喜愛(ài)。隨著大白菜全基因組測(cè)序的完成，其功能基因組學(xué)的研究得到快速發(fā)展，尤其是甲基磺酸乙酯（EMS）突變體庫(kù)的構(gòu)建為大白菜農(nóng)藝性狀相關(guān)優(yōu)異基因的挖掘提供了很好的研究材料。Liu等從大白菜EMS誘變?nèi)后w中獲得了一株蠟質(zhì)缺失突變體cer1[1]。劉文杰等從EMS突變體庫(kù)中篩選獲得了雄性不育、葉面刺毛突變體[2]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員獲得了不同葉色、不同葉球、不同植株大小以及長(zhǎng)生物鐘周期等多種類(lèi)型的突變體[3-5]。

晝夜節(jié)律鐘（circadian clock）即生物鐘，是植物生命活動(dòng)的內(nèi)在節(jié)律，可參與調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)、應(yīng)對(duì)非生物脅迫、代謝活動(dòng)等生長(zhǎng)代謝過(guò)程，增強(qiáng)植物的環(huán)境適應(yīng)性[6]。Lei等闡述了生物鐘ASSOCIATED1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）是擬南芥生物鐘的核心組成部分，影響植物對(duì)生物脅迫的響應(yīng)[7]?，F(xiàn)階段對(duì)于生物鐘突變體的表型性狀已有大量試驗(yàn)分析，前人以模式植物擬南芥為試材，探討了生物鐘突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相的轉(zhuǎn)變、光合作用和根吸收速率的變化等[8-9]。大白菜與擬南芥相比，基因組經(jīng)歷了三倍化事件，其基因功能及調(diào)控機(jī)制較模式植物擬南芥復(fù)雜的多，而大白菜的研究報(bào)道還較少。筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選到一個(gè)大白菜長(zhǎng)生物鐘周期的突變體，其表型表現(xiàn)為胚軸伸長(zhǎng)，現(xiàn)蕾開(kāi)花時(shí)間延遲。哪些基因發(fā)生了突變引起表型的變化有待于進(jìn)一步研究。遺傳分析（genetic analysis）是突變體突變基因挖掘研究的重要途徑。通過(guò)調(diào)查突變體與野生型雜交、回交群體突變表型分離情況，分析突變基因的遺傳特性。Elston首次提出，主基因+多基因混合遺傳模型[10];蓋鈞鎰利用此遺傳模型建立了可同時(shí)鑒別1～3個(gè)主基因和多基因整體效應(yīng)的分析方法[11]。對(duì)表型性狀進(jìn)行遺傳分析可確定該性狀的遺傳規(guī)律。

本研究以生物鐘長(zhǎng)周期突變體lcc-1（Long-period circadian clock-1）及野生型WT為材料，通過(guò)構(gòu)建突變體與野生型的F2代及回交群體，并對(duì)親本、F1代及群體的突變表型性狀及分離情況進(jìn)行調(diào)查，利用主基因+多基因混合遺傳模型進(jìn)行遺傳分析，該研究為探索各突變表型的遺傳規(guī)律及突變基因的深入挖掘奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究以野生型WT、EMS誘變獲得的長(zhǎng)生物鐘突變體lcc-1、野生型與突變體雜交F1代、F2代、回交群體B1和B2為試驗(yàn)材料（圖1-a）。突變體lcc-1與野生型WT相比具有下胚軸長(zhǎng)（圖1-b）、延遲現(xiàn)蕾和開(kāi)花（圖1-c）、生物鐘周期延長(zhǎng)1.43 h的突變表型。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大白菜田間表型性狀調(diào)查方法

本試驗(yàn)材料以穴盤(pán)育苗、成苗后定植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)基地，分2個(gè)時(shí)間播種調(diào)查。2018年1月16日播種，3月7日定植于露地，調(diào)查生殖生長(zhǎng)階段表型;2018年8月5日播種，9月1日定植于露地，調(diào)查營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表型。調(diào)查性狀及方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19557.5—2004《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 大白菜》并略作調(diào)整（表1）。生殖生長(zhǎng)時(shí)期調(diào)查的表型包括現(xiàn)蕾時(shí)間、薹長(zhǎng)、開(kāi)花時(shí)間;營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期調(diào)查的表型包括下胚軸長(zhǎng)度、株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、外葉寬、外葉葉柄長(zhǎng)。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

使用Microsoft Excel軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)lcc-1的9個(gè)表型進(jìn)行分析，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值，并進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)。

依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法整理春季4世代P1、P2、F1、F2和秋季6世代P1、P2、F1、F2、B1、B2各群體表型數(shù)據(jù)，參照蓋鈞鎰鑒別1～3個(gè)主基因和多基因整體效應(yīng)的分析方法[11-12]，使用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物數(shù)量性狀分離分析軟件包SEA，對(duì)本試驗(yàn)擬分析的3個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行主基因-多基因模型的多世代聯(lián)合分析，得到這3個(gè)數(shù)量性狀的遺傳模型以及與之相對(duì)應(yīng)的AIC值，對(duì)備選模型進(jìn)行一組（U21、U22、U23、nW2、Dn）適合性檢驗(yàn)，選擇統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)較少的模型作為最優(yōu)模型，計(jì)算出遺傳率。調(diào)查F2分離群體中現(xiàn)蕾時(shí)間突變型與野生型的植株數(shù)，再根據(jù)卡方檢測(cè)方法，測(cè)定其結(jié)果，確定分離比例，進(jìn)而推導(dǎo)出相應(yīng)基因的遺傳規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型WT與突變體lcc-1的表型特征差異

由圖2可知，WT下胚軸平均長(zhǎng)度為2.22 cm，lcc-1下胚軸平均長(zhǎng)度為3.91 cm，lcc-1下胚軸極顯著長(zhǎng)于WT（P<0.01）。

由圖3可知，WT平均株高49.08 cm，lcc-1平均株高30.46 cm，WT平均開(kāi)展度78.59 cm，lcc-1平均開(kāi)展度53.10 cm，WT平均外葉長(zhǎng)37.04 cm，lcc-1平均外葉長(zhǎng)24.50 cm，WT平均中肋長(zhǎng)度22.90 cm，lcc-1平均中肋長(zhǎng)度15.10 cm，以上表型lcc-1均較WT明顯減小，差異達(dá)極顯著水平;WT平均現(xiàn)蕾時(shí)間75.0 d，lcc-1平均現(xiàn)蕾時(shí)間77.1 d，WT平均開(kāi)花時(shí)間93.4 d，lcc-1平均開(kāi)花時(shí)間98.15 d，以上表型lcc-1均較WT明顯增加，差異達(dá)極顯著水平;WT薹長(zhǎng)48.6 cm，lcc-1薹長(zhǎng)23.22 cm，WT葉片寬 23.88 cm，lcc-1葉片寬16.33 cm，以上表型lcc-1均較WT明顯減少，差異達(dá)顯著水平。從株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、外葉寬、中肋長(zhǎng)度和薹長(zhǎng)的數(shù)據(jù)看，lcc-1植株顯著或極顯著小于WT。從自然春化條件下的現(xiàn)蕾時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間看，lcc-1現(xiàn)蕾和開(kāi)花時(shí)間極顯著長(zhǎng)于WT。

2.2 突變體lcc-1下胚軸長(zhǎng)度的遺傳分析

lcc-1下胚軸平均長(zhǎng)度為3.91 cm，WT下胚軸平均長(zhǎng)度為2.22 cm，WT平均下胚軸長(zhǎng)度僅為lcc-1的56.78%，t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)親本的下胚軸長(zhǎng)度存在極顯著差異，F(xiàn)1平均下胚軸長(zhǎng)度為 2.68 cm，偏向于短下胚軸WT。F2、B1、B2的下胚軸長(zhǎng)度均呈現(xiàn)偏正態(tài)分布（圖4-a、圖4-b、圖4-c）。

用植物數(shù)量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法對(duì)6個(gè)世代群體下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行聯(lián)合分析，分別計(jì)算6個(gè)世代群體在24種遺傳模型下的極大似然函數(shù)值（MLV）和AIC值。根據(jù)AIC準(zhǔn)則，在備選遺傳模型中，AIC最小者為最優(yōu)模型。由表2可知，AIC值較低的是2MG-ADI（2對(duì)加性-顯性-上位性主基因模型）、PG-ADI（加性-顯性-上位性多基因模型）、MX1-AD-ADI （1對(duì)加性-顯性主基因+加性-顯性多基因模型）、MX2-ADI-ADI（2對(duì)加性-顯性-上位性主基因和加性-顯性-上位性多基因模型）、MX2-ADI-AD（2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型），共5個(gè)模型，其AIC值分別為432.277 2、405.791 6、408.246 5、419.434 3、420225 0。

適合性檢驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，5個(gè)模型均符合，但MX2-ADI-AD模型適合性檢驗(yàn)效果最佳，且AIC值較小。因此，可確定 MX2-ADI-AD（2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型）為大白菜下胚軸長(zhǎng)度的最佳遺傳模型。

由表4可知，MX2-ADI-AD模型中2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值均為-0.063 4，顯性效應(yīng)分別為-0.093 6和-0.282 8，顯性效應(yīng)值大于加性效應(yīng)值，說(shuō)明2對(duì)主基因遺傳以顯性效應(yīng)為主。在B1、B2、F2群體中，主基因的遺傳率各不相同。在F2群體中，主基因遺傳率最高，為73.073 9%。在B1群體中主基因遺傳率為42.565 6%，低于50%。在B2群體中主基因遺傳率為59.640 1%。B1、B2、F2多基因的遺傳率分別為39.191 2%、13.793 0%、11.643 8%，主基因遺傳率均大于多基因遺傳率：環(huán)境因素引起的遺傳變異較小。

2.3 突變體lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間的遺傳分析

lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為77.1 d，WT現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為75.0 d，lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間比WT晚2.1 d。對(duì)2個(gè)親本的現(xiàn)蕾時(shí)間平均值進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)后可知，2個(gè)親本間的現(xiàn)蕾時(shí)間差異達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明親本間存在顯著的遺傳差異。F1代現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為75.75 d，偏向于WT。由F2現(xiàn)蕾時(shí)間的次數(shù)分布（圖5）可知，F(xiàn)2世代現(xiàn)蕾時(shí)間的分布偏正態(tài)分布。

用植物數(shù)量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法對(duì)4個(gè)世代群體開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行聯(lián)合分析，分別計(jì)算4個(gè)世代群體在24種遺傳模型下的MLV和AIC值。根據(jù)AIC準(zhǔn)則，在備選遺傳模型中，AIC最小者為最優(yōu)模型。由表5可知，AIC值較低的是MX2-ADI-AD、MX2-ADI-ADI 這2個(gè)模型，其AIC值分別為768.832 5、774.832 5。故初步確定這2個(gè)模型為4世代群體現(xiàn)蕾時(shí)間遺傳的候選模型。

適合性檢驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，5個(gè)模型均通過(guò)適合性測(cè)驗(yàn)，但MX2-ADI-AD適合性檢驗(yàn)效果最佳，且AIC值和MLV均較小。因此，綜合以上分析，確定MX2-ADI-AD（2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型）為調(diào)控大白菜突變體現(xiàn)蕾時(shí)間的最佳遺傳模型。

由表7可知，MX2-ADI-AD模型下的遺傳參數(shù)，現(xiàn)蕾時(shí)間是由2對(duì)主基因+多基因控制的，且第1個(gè)主基因具有負(fù)向的加性效應(yīng)，在F2群體中主基因遺傳率是96.109 1%，多基因遺傳率未檢測(cè)出，說(shuō)明F2群體中現(xiàn)蕾時(shí)間以主基因遺傳為主。

3 結(jié)論與討論

篩選獲得，該方法以獲得SNP單堿基突變?yōu)橹鳎瑹o(wú)大片段DNA變異，而調(diào)查結(jié)果表明，lcc-1突變體卻同時(shí)具有生物鐘周期變長(zhǎng)、下胚軸變長(zhǎng)、晚花等多個(gè)不同突變表型，且相關(guān)性狀均存在顯著差異。因此，可能存在一因多效和多基因突變2種情況。在已有研究中，生物鐘變化導(dǎo)致植物下胚軸長(zhǎng)度、開(kāi)花時(shí)間和植株大小的改變均有報(bào)道。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥隱花色素CRY2蛋白大量積累可獲得早花突變體，在低強(qiáng)度藍(lán)光下下胚軸明顯伸長(zhǎng)[13];TCP2藍(lán)光依賴性地抑制擬南芥下胚軸的伸長(zhǎng)，其功能缺失突變體具有晚花的表型[14];GmPHYB1過(guò)表達(dá)使擬南芥株型矮化緊湊，在短日條件下提前開(kāi)花并強(qiáng)烈抑制下胚軸的伸長(zhǎng)[15];GI和CO基因受生物鐘調(diào)控，在長(zhǎng)日照條件下，GI和CO基因會(huì)促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[16]。擬南芥ZEITLUPE（ZTL） 家族成員的突變會(huì)影響晝夜節(jié)律和開(kāi)花時(shí)間[17]。本研究中對(duì)下胚軸長(zhǎng)度和現(xiàn)蕾時(shí)間2個(gè)突變性狀的遺傳分析結(jié)果均符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因的遺傳模型，可推測(cè)這些性狀可能由調(diào)控生物鐘相關(guān)基因的突變引起，但須要進(jìn)一步借助Mutmap、重測(cè)序、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段深入挖掘研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu C H，Song G X，Wang N，et al. A single SNP in Brcer1 results in wax deficiency in Chinese cabbage （Brassica campestris L. ssp. pekinensis）[J]. Scientia Horticulturae，2021，282：110019.

[2]劉文杰，黃勝楠，劉志勇，等. 大白菜雌不育突變體fsm花蕾激素代謝的轉(zhuǎn)錄組分析[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，50（2）：138-145.

[3]Lu Y，Dai S Y，Gu A X，et al. Microspore induced doubled haploids production from ethyl methanesulfonate （EMS） soaked flower buds is an efficient strategy for mutagenesis in Chinese cabbage[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1780.

[4]王 浩，盧 銀，顧愛(ài)俠，等. 大白菜lcc-1突變體生物鐘核心基因在不同光周期下的表達(dá)分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，42（4）：21-28.

[5]Li J R，Zhang X M，Lu Y，et al. Characterization of non-heading mutation in heading Chinese cabbage （Brassica rapa L.ssp.pekinensis）[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：112.

[6]Steed G，Ramirez D C，Hannah M A，et al. Chronoculture，harnessing the circadian clock to improve crop yield and sustainability[J]. Science，2021，372（6541）：9141.

[7]Lei J X，Zhu-Salzman K.LATE ELONGATED HYPOCOTYL potentiates resistance conferred by CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 to aphid by co-regulating the expression of indole glucosinolate biosynthetic genes[J]. Plant Signaling & Behavior，2021，16（6）：1908708.

[8]傅 鈺，王 苓，龍 鴻.擬南芥生物鐘雙突變體lhycca1營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（6）：1089-1094.

[9]Xu G，Jiang Z M，Wang H Y，et al. The central circadian clock proteins CCA1 and LHY regulate iron homeostasis in Arabidopsis[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（2）：168-181.

[10]Elston R C. The genetic analysis of quantitative trait differences between two homozygous lines[J]. Genetics，1984，108（3）：733.

[11]蓋鈞鎰. 植物數(shù)量性狀遺傳體系的分離分析方法研究[J]. 遺傳，2005，27（1）：130-136.

[12]Faure S，Turner A S，Gruszka D，et al. Mutation at the circadian clock gene EARLY MATURITY 8 adapts domesticated barley （Hordeum vulgare） to short growing seasons[J]. PNAS，2012，109（21）：8328-8333.

[13]郭亞蓉，王艷艷，劉 軍，等. 擬南芥隱花色素CRY2調(diào)控因子PRP8基因的功能分析[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2019，9（2）：169-177.

[14]何志敏. 擬南芥轉(zhuǎn)錄因子TCP2與CRY1相互作用的遺傳學(xué)與生化分析[D]. 長(zhǎng)沙：湖南大學(xué)，2016.

[15]吳發(fā)強(qiáng). 大豆光敏色素基因的克隆和功能研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[16]帥敏敏，黃有軍. 光周期途徑成花關(guān)鍵基因GIGANTEA和CONSTANS的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種，2018，16（17）：5601-5607.

[17]柯海燕. 大豆生物鐘基因——ZEITLUPE同源基因的克隆及其功能分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2006.