一株高地芽孢桿菌的鑒定與促生能力研究

張文韜 楊皓 毛國豪 莊家堯 陳新峰

摘要：從野生大豆根瘤內(nèi)分離出菌株Y1并對其進行分子生物學(xué)鑒定，觀察其特性以及對大豆的促生作用。16S rDNA鑒定表明，菌株Y1為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）;采用Salkowski法驗證該菌株產(chǎn)生長素（IAA）的能力，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)IAA的量為38.49 mg/L。同時該內(nèi)生菌具有解有機磷和無機磷的能力，溶磷量分別為71.48、152.36 mg/L。將菌劑接種到大豆幼苗后觀察其促生能力，結(jié)果顯示，接種該菌株可顯著增加大豆的株高和根長，同時，大豆葉片光合參數(shù)也有所提升。該結(jié)果可為研發(fā)新型微生物肥料提供優(yōu)質(zhì)菌種，為進一步研究芽孢桿菌屬促生潛力提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高地芽孢桿菌;16S rDNA;鑒定;促生潛力

中圖分類號： S182文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0225-04

收稿日期：2021-09-29

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFC0505500）;江蘇省教育廳資助項目（編號：2019JSJG247）;江蘇省高等學(xué)校林學(xué)優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目（編號：164010641）。

作者簡介：張文韜（1998—），女，山東濟南人，碩士研究生，研究方向為水土保持與荒漠化防治。E-mail：szdl123456@sina.cn。

通信作者：莊家堯，博士，副教授，研究方向為水土保持與荒漠化防治。 E-mail： nlzjiayao@njfu.edu.cn。

近代以來人口急劇增加，隨之而來的糧食短缺這一問題日益嚴(yán)峻，而糧食作物生長過程中農(nóng)藥化肥的使用不可避免。同時，農(nóng)藥化肥過度使用也帶來了環(huán)境污染、土壤板結(jié)鹽漬化等許多問題。近年來，微生物菌肥因其高效、綠色的特點走入了大眾視線。微生物菌肥是以微生物的生命活動導(dǎo)致作物得到特定肥料效應(yīng)的一種制品[1]，通過微生物自身分解作用，可以起到增加土壤肥力、供給植物養(yǎng)分等作用。相較于傳統(tǒng)化肥，微生物菌肥有以下明顯優(yōu)勢：（1）促進植物生長，提高產(chǎn)量品質(zhì)?？梢酝ㄟ^促進營養(yǎng)獲取或改變植物激素水平來直接促進生長，也可以通過減少各種病原體對植物生長的抑制作用來間接促進生長發(fā)育，根瘤菌、巨大芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌等是非常常見的植物生長促進細(xì)菌，有助于大幅提高作物產(chǎn)量和整個植物的生長[2]。（2）減少連作障礙，防范病蟲害。微生物菌肥能夠?qū)ν寥乐械牟≡置谖镞M行分解和抑制，來幫助土壤中有益微生物進行繁殖[3]，起到生物防治的效果。（3）改良土壤，增加土壤肥力。施用微生物菌肥可以增加土壤中的有益菌數(shù)量，提高土壤的保水保溫能力。同時部分菌肥可以起到固氮作用，一些微生物可以活化土壤里磷鉀礦物，幫助植物溶解磷鉀元素，從而增加土壤肥力[4]。

在我國已經(jīng)登記在冊的有7 608種微生物菌肥商品，應(yīng)用最廣泛的為鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus） 和乳酸桿菌屬（Lacto bacillus） 的菌種，其中又以芽孢桿菌屬應(yīng)用率最高。李銘東等研究了多黏類芽孢桿菌菌劑對于玉米生長的影響，發(fā)現(xiàn)在施用多黏類芽孢桿菌菌劑和正?；瘜W(xué)肥料混合的處理比單獨施用正?；瘜W(xué)肥料的處理，玉米的出苗率和苗高更高，同時發(fā)現(xiàn)使用菌劑的處理比沒有添加菌劑的處理根腐病發(fā)病率更低，玉米的產(chǎn)量更高[5]。高加明等從土壤中分離篩選1種高效解鉀菌菌株NGW1并應(yīng)用于煙草栽培，發(fā)現(xiàn)添加菌種的植株其有效葉數(shù)、株高、最大葉寬、莖圍指標(biāo)均高于對照組[6]。鐘松等通過在土壤施加膠質(zhì)芽孢桿菌菌肥，發(fā)現(xiàn)該菌肥可有效提升高寒草原土速效養(yǎng)分，促進高寒草原牧草的根系生長[7]。

試驗菌株Y1是筆者所在課題組前期從野生大豆（Glycine soja）瘤內(nèi)分離純化得到的。首先對其進行16S rDNA測序鑒定其菌種，分析該菌種的生物學(xué)地位。隨后分別對其產(chǎn)生長素能力、溶磷能力指標(biāo)進行測定，最后將其接種到大豆植株上觀察其促生效應(yīng)，以期發(fā)掘優(yōu)良的植物促生菌種資源，為芽孢桿菌菌肥的開發(fā)和廣泛利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)材料

酵母甘露醇瓊脂（YMA）培養(yǎng)基：甘露醇10 g、七水硫酸鎂 0.2 g、氯化鈉0.1 g、酵母粉3 g、磷酸氫二鉀0.25 g、磷酸二氫鉀 0.25 g、碳酸鈣3 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0（液體培養(yǎng)基內(nèi)不放瓊脂）。

Salkowski比色液：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶解于49 mL 35%濃H2SO4。

無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉0.3 g、氯化鉀0.3 g、硫酸鎂0.3 g、硫酸亞鐵0.03 g、硫酸錳0.03 g;磷酸鈣5 g、瓊脂 15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0。

有機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉0.3 g、氯化鉀0.3 g、硫酸鎂0.3 g、硫酸亞鐵0.03 g、硫酸錳0.03 g、卵磷脂0.2 g、碳酸鈣1 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 菌種16S rDNA序列鑒定

提取Y1的DNA后，進行16S DNA的擴增，將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀。利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0純化試劑盒對產(chǎn)物進行純化。將純化后產(chǎn)物送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行比對，獲知與該細(xì)菌的16S DNA序列同源性最高的已知序列。細(xì)菌測序所用的引物為通用引物515F/907R，引物序列515F ：5′-GTGCCAGCMGCCGCCG-3′; 907R ：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。

1.3 供試菌株分泌生長素（IAA）測定

在滅菌的YMA液體培養(yǎng)液中加入200 mg/L的L-色氨酸，接種Y1菌株后置于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，7 d后，取50 μL菌懸液滴于白色塑料比色板上，同時加50 μL Salkowski比色液。將白色陶瓷板放在室溫下避光30 min，若顏色變紅表示Y1具有分泌生長素的能力[8]。菌株Y1產(chǎn)生IAA的濃度參考劉玉珍等的計算方法[9]。本試驗進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 供試菌株溶磷能力測定

1.4.1 定性測定 將制備的單一菌株活化后，用牙簽點至無機磷和有機磷培養(yǎng)基平板中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中7 d，在平板中菌落周圍出現(xiàn)透明圈的即為解磷菌。

1.4.2 定量測定 將菌株Y1接種于新鮮牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d制成菌液，取1 mL加入無機磷液體培養(yǎng)基中，用鉬銻抗比色法來測定上清液中有效磷含量。具體步驟參照文獻[10]。

1.5 大豆促生試驗

試驗于2021年4月在南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院簡易大棚內(nèi)進行。大豆促生試驗參照舒健虹等的方法[11]，并作修改：將花土 ∶蛭石按體積比 3 ∶1 混合滅菌后放入花盆中，每個花盆放6 L混合土。把發(fā)芽程度相似的大豆種子播于盆中，放置在氣候箱內(nèi)，在長出第1張真葉時，每株植物根部各接種 1 mL 菌懸液，以接種1 mL滅菌培養(yǎng)液為對照。每 3 d 噴灑1次營養(yǎng)液保持濕潤。45 d后，測其地上部分與地下部分生長情況。并使用LI-6400便攜式光合儀（Li-Cor Inc.USA）測定大豆葉片的光合數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和計算，利用SPSS 26.0進行顯著性差異分析，使用Origin 2018軟件制圖。利用生物信息平臺提供軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y1的分子鑒定

Y1的16S區(qū)序列在GenBank對比后發(fā)現(xiàn)該菌株為Bacillus altitudinis（高地芽孢桿菌），將菌株Y1的16S rDNA測序結(jié)果進行同源性比較后利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus pumilus（AY456263）的同源性最近（圖1）。

2.2 Y1分泌植物生長素能力鑒定

由圖2可知，室溫避光30 min后，白色瓷板上的液體明顯變成粉紅色，說明菌株Y1具有產(chǎn)生長素能力。用3-吲哚乙酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.046 978x（r2=0.99），經(jīng)計算，菌株Y1產(chǎn)IAA量為38.49 mg/L。

2.3 Y1解磷能力

2.3.1 定性測定 由圖3可知，Y1在無機磷和有機磷培養(yǎng)基上均有明顯透明溶磷圈出現(xiàn)。

2.3.2 定量測定 由圖4可知，菌株Y1在無機磷和有機磷液體培養(yǎng)基中的溶磷量隨時間變化呈增加趨勢，且溶解無機磷的能力高于溶解有機磷。7 d時，菌株Y1無機磷和有機磷中的溶磷量分別為152.36、71.48 mg/L。

2.4 接種菌株Y1對大豆葉片光合作用的影響

由表1可見，加菌組凈光合速率與對照相比顯著增加136.73%，氣孔導(dǎo)度與對照組相比顯著增加120.69%，胞間CO2濃度比對照組顯著提升28.95%，蒸騰速率與對照組相比顯著增加168.57%，達0.94 mmol/（m2·s），水分利用效率相比對照增加不顯著。

2.5 接種菌株Y1對大豆植株生長指標(biāo)的影響

由表2可見，接種Y1菌株45 d后，株高顯著增加23.82%，根長顯著增加26.98%，地上部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、莖粗均有所增加但并不顯著。這可能是由于植株之間這類指標(biāo)的差異本身就小，所以無顯著變化。

3 討論與結(jié)論

吲哚乙酸（IAA）是植物存活過程中不可缺少的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物根部對IAA非常敏感，多數(shù)植物內(nèi)生菌都有產(chǎn)IAA的能力[12]。陳迪等從檳榔根際土壤和檳榔葉柄中分離細(xì)菌，測量它們對檳榔盆栽苗的促生能力，得到了有明顯促生作用的菌株 DC-7，測得吲哚乙酸（IAA）含量為35.78 mg/L，說明菌株DC-7的促生長作用可能來源于它的產(chǎn)IAA能力[13]。姜云等從人參中分離出菌株蘇云金芽孢桿菌JJ5-2的產(chǎn)IAA能力為10.2 mg/L[14]。本試驗中，菌株Y1的產(chǎn)IAA量為38.49 mg/L，說明該菌株有較高的產(chǎn)IAA能力。

土壤庫中存在著大量磷素，但能夠直接被植物吸收利用的可溶性磷的含量很低，為實現(xiàn)環(huán)境友好型的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略目標(biāo)，應(yīng)在增加作物產(chǎn)量的基礎(chǔ)上減少化學(xué)肥料的使用。溶磷菌可以促進土壤中有效磷的釋放，提供植物生長發(fā)育所必需的磷元素，促進植物的生長發(fā)育[15]。芽孢桿菌屬是目前報道的溶磷能力較強的菌種之一[16]。Hameeda等將篩選得到的5株解磷菌進行了盆栽和大田試驗，結(jié)果均表明接菌后能夠促進玉米的生長[17]。宋娟等從楓香根際土壤中篩選出4株解磷菌，并將其接種于楓香幼苗，發(fā)現(xiàn)該菌能夠顯著提高楓香的株高和地徑[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)菌株Y1在無機磷和有機磷培養(yǎng)基板可以產(chǎn)生透明溶磷圈，具有解磷能力。同時，該菌株在無機磷和有機磷培養(yǎng)基中的溶磷量分別為152.36、71.48 mg/L。韋宜慧等從杉木林中篩選出溶磷能力最強的3株菌株，其溶解無機磷量分別為195.61、109.20、78.86 mg/L[19]。Irawan等從油棕（Elaeis quineensis）根際土壤篩選出的溶磷菌溶解無機磷量為58.6 mg/L[20]。說明Y1菌株的溶磷能力在溶解無機磷能力中屬于偏上水平，且兼具溶解有機磷的能力，是一株可以用作微生物肥料的菌株。

光合作用是植物生長發(fā)育最基本的生理活動之一，能夠為自身提供所需要的物質(zhì)和能量[21]。其中凈光合速率是指植物通過葉綠素吸收固定光能輻射，在光合作用過程中積累有機物質(zhì)，通常用于表征植物的光合效率。蒸騰速率能夠反映植物體內(nèi)礦物質(zhì)和水分運輸?shù)膹娙跻约叭~片在強光下降溫的效果。氣孔導(dǎo)度通常表現(xiàn)為植物葉片細(xì)胞的開合程度，在很大程度上決定了植物對二氧化碳的吸收作用、植被的光合效率以及呼吸速率。水分利用效率能夠反映植物在生長過程中的能量轉(zhuǎn)化效率[22]。本試驗中大豆接種菌株Y1后光合參數(shù)提升，能夠提升大豆對光的利用效率，從而促進光合作用。

參考文獻：

[1]武興友.微生物菌肥對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響及研究趨勢分析[J]. 中國果菜，2018，38（4）：9-11，15.

[2]Mahanty T，Bhattacharjee S，Goswami M，et al. Biofertilizers：a potential approach for sustainable agriculture development[J]. Environmental Science and Pollution Research，2017，24（4）：3315-3335.

[3]劉 曉. 微生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)，2021（17）：14-15.

[4]鄭茗月，李海梅，趙金山，等. 微生物肥料的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，30（11）：52-56.

[5]李銘東，吳成生，沈 彤，等. 多黏類芽孢桿菌菌劑在玉米上的應(yīng)用效果[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（3）：141-143.

[6]高加明，張健行，佘夢林，等. 土壤高效解鉀菌的篩選鑒定及煙草栽培應(yīng)用效果評價[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，60（7）：34-39，46.

[7]鐘 松，高俊程，董世魁，等. 黃河源區(qū)高寒草原土壤對不同PGPR菌肥的響應(yīng)[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2021，57（3）：294-301.

[8]Glickmann E，Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[9]劉玉珍，鄧振山，高 飛，等. 一株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及其促生特性初步分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，45（3）：88-93，173.

[10]伍善東，劉冬華，郭照輝，等. 1株高效解無機磷細(xì)菌JP-7的分離、鑒定及溶磷能力分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：374-376.

[11]舒健虹，王子苑，劉曉霞，等. 牧草促生菌分離鑒定及對大豆促生性能的研究[J]. 中國土壤與肥料，2020（4）：215-222.

[12]馬驄毓，張 英，馬文彬，等. 黃芪根際促生菌（PGPR）篩選與特性研究[J]. 草業(yè)學(xué)報，2017，26（1）：149-159.

[13]陳 迪，芮 凱，曾 濤，等. 一株具有產(chǎn)IAA能力的解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及功能評價[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2021（3）：50-58.

[14]姜 云，田 磊，陳長卿，等. 一株人參內(nèi)生產(chǎn)吲哚乙酸細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 中國中藥雜志，2015，40（2）：213-217.

[15]楊海霞，劉希旻，潘奕臣，等. 耐鹽堿溶磷菌Y2R2的分離鑒定及溶磷特性[J]. 生物技術(shù)通報，2020，36（10）：127-134.

[16]Liu F P，Liu H Q，Zhou H L，et al. Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from betel nut （Areca catechu） and their effects on plant growth and phosphorus mobilization in tropical soils[J]. Biology and Fertility of Soils，2014，50（6）：927-937.

[17]Hameeda B，Harini G，Rupela O P，et al. Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from composts and macrofauna[J]. Microbiological Research，2008，163（2）：234-242.

[18]宋 娟，徐國芳，趙 邢，等. 楓香根際解有機磷細(xì)菌篩選及其促生效應(yīng)[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，44（3）：95-104.

[19]韋宜慧，陳嘉琪，趙光宇，等. 杉木林土壤和苗木內(nèi)生溶磷細(xì)菌的篩選及其溶磷特性[J]. 林業(yè)科學(xué)，2020，56（12）：1-9.

[20]Irawan A F，Baskara G，Wandri R，et al. Isolation and solubilisation of inorganic phosphate by Burkholderia spp. from the rhizosphere of oil palm[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2020，23（5）：667-673.

[21]康偉健. 強光照光時間影響玉米光合作用適應(yīng)的機制[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[22]馮玉龍，曹坤芳，馮志立. 生長光強對4種熱帶雨林樹苗光合機構(gòu)的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2002，28（2）：153-160.