根腫菌侵染對(duì)大白菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合特性的影響

司佳 陶新意 張思萌 黃新彪 李光寧 王彥華 趙建軍 馮大領(lǐng) 軒淑欣

摘要：以大白菜抗根腫病自交系265和感根腫病自交系139為試材，采用室內(nèi)根腫菌人工接種技術(shù)，研究根腫菌侵染對(duì)不同抗性大白菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及光合特性的影響。結(jié)果表明，接菌3 d，139In和265In 根毛均有根腫菌侵染，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)侵染率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，265In早期根毛侵染率明顯低于139In，后期顯著高于139In;皮層侵染265In明顯滯后于139In，且侵染數(shù)均明顯低于139In。隨著根腫菌侵染率的變化，大白菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、非光化學(xué)淬滅（NPQ）和光化學(xué)淬滅（qp）呈現(xiàn)規(guī)律性變化，265In和139In在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)較其對(duì)照表現(xiàn)下降。受根腫菌侵染的影響，接菌后35、70 d，265In和139In光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均較對(duì)照降低，胞間二氧化碳濃度較對(duì)照上升;除氣孔導(dǎo)度外，其他參數(shù)變化在70 d時(shí)差異達(dá)到顯著水平。該結(jié)果為進(jìn)一步研究根腫菌致病機(jī)理和大白菜抗根腫病育種的早期診斷提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大白菜;根腫菌侵染;葉綠素?zé)晒?光合特性

中圖分類號(hào)： S436.341.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0123-05

收稿日期：2021-07-04

基金項(xiàng)目：〗河北省創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（編號(hào)：20592109D）;河北省引智人才項(xiàng)目（編號(hào)：2019YX023A）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFD0101802、2016YFD0100204-17）;河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：21326311D-2）;河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃基金（編號(hào)：2020198）。

作者簡(jiǎn)介：司 佳（2000—），女，河北涿州人，主要從事蔬菜學(xué)方面的研究。E-mail：1759824533@qq.com。

通信作者：軒淑欣，博士，副研究員，主要從事分子細(xì)胞遺傳及育種應(yīng)用研究，E-mail：yyxsx@hebau.edu.cn;馮大領(lǐng)，博士，副教授，主要從事植物種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種應(yīng)用研究，E-mail：bjdalingfeng@163.com。

根腫病（clubroot）是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）廣泛侵染油菜、大白菜、蘿卜、甘藍(lán)等十字花科作物根部引起的一種嚴(yán)重的土傳病害，由于其休眠孢子可在土壤中存活20 年以上[1]，給該病害的防治帶來了極大困難，導(dǎo)致全世界十字花科作物每年減產(chǎn)10%～15%[2]。我國(guó)浙江、廣東、遼寧、山東、湖南、北京、河北、遼寧、吉林、黑龍江等27個(gè)省（直轄市）均有根腫病發(fā)生[3]。近年來，大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis Makino）感染根腫病的面積逐年增加，且呈蔓延趨勢(shì)，嚴(yán)重影響到了我國(guó)大白菜的生產(chǎn)和市場(chǎng)的正常供應(yīng)，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)十字花科根腫病的發(fā)病規(guī)律[4]、防治方法[5]、根腫菌的生活史[6]、生理小種分化[7]、接種鑒定方法[8]研究很多，近年來大白菜根腫病的抗性分子標(biāo)記及分子標(biāo)記輔助育種研究[9-11]也日益受到重視。光合機(jī)構(gòu)是綠色植物吸收利用光能進(jìn)行光合生理反應(yīng)的場(chǎng)所，也是暗反應(yīng)的生化場(chǎng)所，被認(rèn)為是逆境脅迫的敏感部位。葉綠素?zé)晒鈪?shù)是一組用于描述植物光合作用機(jī)制和光合生理狀況的變量或常數(shù)值，反映了植物“內(nèi)在性”的特點(diǎn)，被視為是研究植物光合作用與環(huán)境關(guān)系的內(nèi)在探針。二者被作為生物或非生物逆境脅迫機(jī)理研究的重要內(nèi)容[12-14]。盧曉霞等研究發(fā)現(xiàn)，油菜感根腫病植株的光合速率顯著降低[15]。然而關(guān)于根腫菌侵染對(duì)大白菜光合生理方面影響的研究鮮有報(bào)道。

筆者以大白菜抗根腫病自交系和高感根腫病自交系為試材，以根腫菌4號(hào)生理小種為病原菌，研究根腫菌人工接種侵染不同抗性大白菜的過程及對(duì)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及光合特性的影響，擬從光合生理角度為進(jìn)一步研究根腫菌致病機(jī)理和大白菜抗根腫病育種的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料為2份大白菜自交系：265和139，前期以根腫菌4號(hào)生理小種接種鑒定，265表現(xiàn)為抗病，139表現(xiàn)為感病。

根腫病菌菌源來自重慶市武隆區(qū)根腫病發(fā)病區(qū)的大白菜病根，以4號(hào)生理小種為主，經(jīng)多次室內(nèi)大白菜接菌繁殖，病根洗凈后保存在-20 ℃冰箱中。

試驗(yàn)于2020年10月至2021年3月在河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及人工氣候室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備

從-20 ℃取出適量保存的病根，置于25 ℃左右的黑暗條件下，腐爛4～5 d，促進(jìn)休眠孢子萌發(fā)。將病根放入榨汁機(jī)中，加入適量無菌水，打碎至勻漿，分別使用2、4、8層紗布過濾，收集菌液于1 000 mL錐形瓶中，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)目，并調(diào)整孢子濃度至1×108個(gè)/mL。置于4 ℃下24 h內(nèi)使用。

1.2.2 試驗(yàn)材料的接種與培養(yǎng)

提前將大白菜自交系265和139種子催芽，待種子露白后播種在50孔裝有基質(zhì)的穴盤中，每孔播種1粒。播種后第10天，利用注射器將24 h內(nèi)制備的菌液從幼苗根基部注入基質(zhì)中，每株接種菌液3 mL，以注射清水的為對(duì)照（CK）。整個(gè)苗期生長(zhǎng)溫度控制在白天25 ℃、晚上20 ℃，保持適宜的基質(zhì)濕度。接種40 d后，將幼苗從穴盤移栽到直徑10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，在相同環(huán)境中生長(zhǎng)30 d。

1.2.3 根腫菌侵染過程觀察

分別在接菌后3、5、7、10、13、15、22、30 d將大白菜的根輕輕地從基質(zhì)中取出，自來水洗凈后，蒸餾水沖洗，然后置于FAA固定液中固定24 h以上。取整條根，無菌水沖洗后，用苯胺藍(lán)染色液染色2～3 min，再用無菌水將表面染液沖掉，置于載玻片上蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察根腫菌侵染根毛和皮層情況。每個(gè)材料觀察100條根毛，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)根毛侵染率;記錄3個(gè)視野的平均皮層侵染數(shù)。

根毛侵染率=（侵染的根毛數(shù)/觀察的根毛總數(shù)）×100%。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

分別在接菌后 5、10、15、22、30、40 d以及移植到營(yíng)養(yǎng)缽生長(zhǎng)30 d（接菌后70 d），取幼苗葉片，置于黑暗環(huán)境適應(yīng)30 min后，利用Fluorcam7葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定大白菜功能葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，主要包括最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ），3 次重復(fù)。

1.2.5 光合參數(shù)測(cè)定

于接菌后35 d和70 d，每株選取頂部第3～4張完全展開的葉片，采用 LC Pro-SD 全自動(dòng)便攜式光合儀進(jìn)行光合參數(shù)測(cè)定，主要包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰系數(shù)（Tr）和胞間CO2 濃度（Ci），每份材料測(cè)3株，以未接菌的為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2020和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腫菌侵染大白菜根毛和皮層情況觀察

對(duì)接菌后的抗病自交系265（265In）和感病自交系139（139In）根腫菌侵染根毛和皮層情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)（圖1、表1）。結(jié)果表明，接菌3 d，139In 根毛就有了根腫菌侵染，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，侵染率逐漸增多，接菌10～13 d達(dá)到最多，侵染率為47.0%～51.0%，15 d之后，侵染率逐漸下降，有的根毛中可見殘余的孢子殘?bào)w;接菌5 d，皮層中可見有孢子團(tuán)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，皮層侵染的孢子團(tuán)數(shù)逐漸增多，到30 d，每個(gè)視野皮層中的孢子團(tuán)數(shù)平均可達(dá)17.3個(gè)（表1，圖1-A至圖1-C）。相對(duì)于139In，265In中的根毛侵染率和皮層侵染數(shù)各時(shí)期均較低。接菌 3 d，265In根毛也偶爾可見有根腫菌侵染，但侵染率僅為0.05%;侵染率達(dá)到最高是在接菌后13～15 d，隨后逐漸下降。相對(duì)于根毛侵染，同一時(shí)期265In侵染皮層的孢子團(tuán)數(shù)遠(yuǎn)低于139In，30 d時(shí)265In每個(gè)視野皮層中的孢子團(tuán)數(shù)平均為6.3個(gè)/視野（表1、圖1-D）。

2.2 根腫菌侵染對(duì)大白菜葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>

2.2.1 根腫菌侵染對(duì)大白菜葉片F(xiàn)v/Fm的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm是光抑制程度的一個(gè)重要指標(biāo)，反映的是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光能轉(zhuǎn)換效率。由圖2可知，抗病自交系265，接菌材料和對(duì)照表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，除在接菌后5、10、40 d接菌材料的Fv/Fm值略小于對(duì)照外，其他時(shí)期Fv/Fm值大小基本相同。感病自交系139與對(duì)照材料139CK不同時(shí)期Fv/Fm值基本一致，恒定在0.83左右;而接菌材料139In Fv/Fm值在接種后10、22、40 d 均明顯低于139CK（圖2）。以上結(jié)果表明，2份材料在接種后的不同時(shí)期發(fā)生了不同程度的光抑制，其中，139In受抑制程度明顯大于265In受光抑制程度。

2.2.2 根腫菌侵染對(duì)大白菜葉片 NPQ 的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù) NPQ 值的升高可以保護(hù)光合系統(tǒng)免受損害，以盡可能維持植物的光合性能。由圖3可知，在生長(zhǎng)過程中，265CK葉片的 NPQ表現(xiàn)為持續(xù)降低的趨勢(shì)，139CK葉片的 NPQ表現(xiàn)為先下降后上升又下降的變化趨勢(shì)。與對(duì)照不同，盡管接菌后的 5～40 d，139In和265In葉片的 NPQ均表現(xiàn)為低于對(duì)照的現(xiàn)象，139In在接菌后的5～10 d、265In在接菌后的5～15 d均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且265In上升幅度大于139In，這可能與根腫菌侵染、大白菜被迫啟用光合機(jī)構(gòu)自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)。15～70 d，265In表現(xiàn)為與265CK一致的持續(xù)降低的變化趨勢(shì)且NPQ數(shù)值相近，而139In在10～15 d表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，此后15～40 d處于NPQ數(shù)值相對(duì)恒定且低于139CK水平，40～70 d又出現(xiàn)了升高的趨勢(shì)。

2.2.3 根腫菌侵染對(duì)大白菜葉片qP的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP反映植物光合活性的高低，其升高或降低幅度反映光合效率在不同條件下增強(qiáng)或受抑程度。由圖4可知，265CK和139CK對(duì)應(yīng)接種后5～10 d，葉片qP變化趨勢(shì)相反，前者表現(xiàn)下降，后者表現(xiàn)輕微上升， 此后二者qP值均表現(xiàn)為10～15 d基本保持不變、15～30 d上升、30～40 d下降、40～70 d 又上升的相同趨勢(shì)。265In與265CK表現(xiàn)為相同的變化趨勢(shì)，但在5～15 d及30～70 d265In qP值均高于265CK。139In與139CK相比，5～10 d和 40～70 d葉片qP值表現(xiàn)為相反的變化趨勢(shì)，且在 5 d 和70 d達(dá)到最小值;10～40 d表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，且139In qP值高于或接近139CK。139In葉片qP值5、10、70 d顯著低于265In，其他時(shí)間接近265In。表明根腫菌侵染導(dǎo)致感病大白菜葉片光合效率降低程度大于抗病大白菜葉片。

2.3 根腫菌侵染對(duì)大白菜葉片光合參數(shù)的影響

利用LC Pro-SD 全自動(dòng)便攜式光合儀對(duì)大白菜抗、感自交系接菌后35 d和70 d的光合作用參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

由圖5可知，接菌后35 d，抗、感自交系265In和139In的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均分別較其對(duì)照265CK和139CK有所下降，胞間二氧化碳濃度有所上升，但除氣孔導(dǎo)度二者下降顯著外，其他差異均未達(dá)到顯著水平。接菌后70 d，265In與對(duì)照265CK相比，光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度和蒸騰速率均明顯下降，但光合速率和胞間二氧化碳濃度未達(dá)到顯著差異;139In與對(duì)照139CK相比，光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均顯著下降，胞間二氧化碳濃度顯著上升。說明根腫菌侵染嚴(yán)重影響了大白菜感病材料的光合作用能力。

3 討論與結(jié)論

前人研究發(fā)現(xiàn)，供試白菜在接菌后4 d可觀察到根毛侵染[16-17]，本試驗(yàn)對(duì)接菌后3 d的大白菜抗病材料和感病材料根毛進(jìn)行觀察，均觀察到根毛中的根腫菌原生質(zhì)團(tuán)，說明根腫菌侵染時(shí)間可能發(fā)生的更早。接菌后早期（13 d前）265In的根毛侵染率低于139In，后期（15 d后）265In的根毛侵染率顯著高于139In，265In根腫菌侵染皮層的天數(shù)明顯滯后于139In，且侵染數(shù)目也顯著少于139In，表明大白菜265對(duì)根腫菌的抗性反應(yīng)不是發(fā)生在病原菌與寄主的識(shí)別階段，而應(yīng)該是病原菌與寄主反應(yīng)誘發(fā)了某些抗病基因表達(dá)，抑制了其進(jìn)一步侵染皮層所致。

根腫菌侵染大白菜抗病材料和感病材料，對(duì)其葉片葉綠素?zé)晒馓匦訹18-19]均造成了明顯影響。隨著接菌天數(shù)的延長(zhǎng)，256In和139In的Fv/Fm和NPQ均隨其對(duì)照表現(xiàn)出了相似的變化趨勢(shì)，又隨菌侵染根毛和皮層的歷程又較其對(duì)照明顯降低，但139In出現(xiàn)明顯降低的時(shí)間要早于265In，降幅也大于265In。與Fv/Fm和NPQ不同，265In的qP與對(duì)照變化趨勢(shì)相似，但15 d前和30 d后均高于對(duì)照;139In的qP與對(duì)照相比，5～15 d和40～70 d變化趨勢(shì)相反，且逐漸低于對(duì)照;15～40 d這2份材料接菌前后變化趨勢(shì)相同且較接近。表明在早期均侵染根毛拓展到皮層及后期發(fā)病過程中，抗病自交系265相對(duì)于感病自交系139保持了較高的光合活性。

植物凈光合速率的大小直接體現(xiàn)了植物光合作用能力的強(qiáng)弱[20]，蒸騰速率的大小反映了植物調(diào)節(jié)水分的能力[21]。接菌后2份大白菜Pn、Gs和Tr均明顯下降，Ci除265接種后70 d有所下降外均較對(duì)照上升，表面根腫菌侵染嚴(yán)重影響了大白菜感病材料的光合作用能力。139In與139CK相比，隨著根腫菌侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)指標(biāo)的變化均達(dá)到顯著水平，說明感病大白菜適應(yīng)逆境的能力變?nèi)酢?/p>

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