易清清，梁鵬晨，孫苗苗，楊榮，梁冬雨，沙爽，常慶△

骨是一種礦化的結(jié)締組織，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)在骨重塑和維持骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［1］。骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低與骨微結(jié)構(gòu)退化為特點(diǎn)的疾病，骨折是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥［2］。破骨細(xì)胞來(lái)源于造血干細(xì)胞，是由單核細(xì)胞融合分化而成，是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞。破骨細(xì)胞通過(guò)分泌組織蛋白酶K（CK）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）降解骨基質(zhì)［3］。破骨細(xì)胞與骨組織接觸的細(xì)胞膜區(qū)域具有特殊的黏附結(jié)構(gòu)，形成封閉區(qū)，其中的細(xì)胞膜具有微絨毛結(jié)構(gòu)樣褶皺緣，兩者形成相對(duì)獨(dú)立的骨吸收間隙，從而完成細(xì)胞極化［4］。整合素（Integrin）能調(diào)節(jié)黏附、遷移及封閉區(qū)的形成，對(duì)破骨細(xì)胞分化和激活具有重要意義［5-6］。非受體酪氨酸激酶（c-Src）及其磷酸化產(chǎn)物p-Src 調(diào)節(jié)細(xì)胞極化、遷移及褶皺緣的形成，敲除c-Src的小鼠因體內(nèi)破骨細(xì)胞無(wú)法形成正常偽足，導(dǎo)致產(chǎn)生骨硬化癥［7-8］。紅景天苷（Salidroside，SAL）為4-羥基-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是紅景天屬植物中廣泛存在的酚苷類(lèi)化合物，可從植物根、莖提?。?］。SAL具有保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、促成骨等藥理作用［10］。近年來(lái)研究表明，SAL 可促進(jìn)骨折后的骨再生和血管生成［11］。有關(guān)SAL促成骨的研究多集中于促進(jìn)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞活性方面，關(guān)于SAL 和破骨細(xì)胞分化及極化關(guān)系的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SAL對(duì)可溶性核因子κB受體活化因子配體（sRANKL）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和極化的影響，以期為SAL的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SAL購(gòu)自成都瑞芬思生物科技公司，小鼠單核細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株購(gòu)自蘇州賽爾飛生物科技公司，高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，重組小鼠sRANKL購(gòu)自上海賽戈生物科技公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DAPI和茜素紅染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，兔源MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3一抗及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）引物購(gòu)自上海捷瑞生物公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 細(xì)胞系用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞密度80%以上時(shí)于6 孔板中鋪板培養(yǎng)。隨后細(xì)胞用含10%FBS，100μg∕L sRANKL 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d。對(duì)照組不含SAL 的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含15、30 和60 mg∕L SAL 的培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)5 d。本文中SAL 的質(zhì)量濃度15、30、60 mg∕L 均為加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度。

1.2.2 TRAP 染色 細(xì)胞培養(yǎng)5 d 后，棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗2 次，按TRAP 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察，對(duì)TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 纖維形肌動(dòng)蛋白（F-Actin）環(huán)染色 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞系以1×105個(gè)∕孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后分別更換含100μg∕L sRANKL 及0、15、30 和60 mg∕L SAL的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，加入5 mg∕L 鬼筆環(huán)肽染色液，37 ℃避光孵育30 min，棄染色液，PBS洗2次，加入DAPI染色液染色5 min，PBS洗2次。顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)F-Actin環(huán)形成數(shù)。

1.2.4 茜素紅染色 細(xì)胞以1×105個(gè)∕孔接種于6 孔板中，貼壁后分別換含100μg∕L sRANKL、成骨誘導(dǎo)液及0、15、30 和60 mg∕L SAL 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 后，吸除培養(yǎng)基，并用PBS 沖洗細(xì)胞，4%多聚甲醛中固定30 min，用茜素紅染色30 min，顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞鈣化情況。顯微鏡拍攝后，用10%十六烷基氯化吡啶溶解，562 nm處測(cè)定光密度（OD）值。

1.2.5 qPCR 檢測(cè)MMP-9、c-Src、CK和Integrin β3的mRNA表達(dá) 0、15、30和60 mg∕L SAL干預(yù)細(xì)胞5 d，使用Trizol法冰上抽提總RNA，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃15 min，85 ℃5 s。擴(kuò)增條件：95 ℃10 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，72 ℃34 s，循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by qPCR表1 qPCR擴(kuò)增基因引物序列

1.2.6 Western blot 檢測(cè)MMP-9、c-Src 蛋白表達(dá) 0、15、30和60 mg∕L SAL 干預(yù)細(xì)胞5 d，在6 孔板中加入高效組織裂解液RIPA，冰上反復(fù)吹打，12 000 r∕min 離心10 min 后取上清液。上清液中加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE 分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原1 h，按說(shuō)明書(shū)稀釋一抗MMP-9（1∶1 000）、c-Src（1∶1 000），內(nèi)參GAPDH（1∶1 000），14 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，稀釋二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影曝光。根據(jù)灰度值數(shù)據(jù)分析各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAL抑制RAW 264.7分化成TRAP 陽(yáng)性破骨細(xì)胞 在sRANKL誘導(dǎo)下，各組RAW264.7細(xì)胞均分化成破骨細(xì)胞，TRAP染色陽(yáng)性證實(shí)sRANKL誘導(dǎo)分化成功。與對(duì)照組相比，SAL 15、30 和60 mg∕L SAL 組TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，見(jiàn)圖1。

Fig.1 The effect of different concentrations of salidroside on the count of osteoclasts(TRAP staining,×100)圖1 不同質(zhì)量濃度SAL對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響（TRAP染色，×100）

2.2 SAL 抑制RAW 264.7 分化破骨細(xì)胞F-Actin 環(huán)形成 對(duì)照組破骨細(xì)胞F-Actin環(huán)完整，SAL處理后，破骨細(xì)胞的F-Actin變細(xì)，甚至消失。隨著SAL質(zhì)量濃度增高，破骨細(xì)胞的F-Actin 環(huán)破壞更加嚴(yán)重，F(xiàn)Actin環(huán)數(shù)量減少，破骨細(xì)胞的數(shù)目亦越少，見(jiàn)圖2。

2.3 SAL促進(jìn)破骨細(xì)胞鈣化形成 隨著SAL質(zhì)量濃度增高，破骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色加深，SAL具有促進(jìn)破骨細(xì)胞鈣化的作用，見(jiàn)圖3。

Fig.2 Effects of SAL on the formation of F-actin ring in osteoclasts圖2 不同質(zhì)量濃度SAL對(duì)破骨細(xì)胞F-Actin環(huán)形成的影響

2.4 SAL 抑制MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組相比較，30 和60 mg∕L SAL 組的MMP-9、CKmRNA，15、30 和60 mg∕L SAL 組的c-SrcmRNA，15、30 mg∕L SAL 組的Integrin β3mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of MMP-9,c-Src,CK and Integrin β3 between the four groups of osteoclasts表2 各組破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3 mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of MMP-9,c-Src,CK and Integrin β3 between the four groups of osteoclasts表2 各組破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3 mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與對(duì)照組比較，b 與15 mg∕L SAL 組比較，c 與30 mg∕L SAL組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組15 mg∕L SAL組30 mg∕L SAL組60 mg∕L SAL組F MMP-9 1.00±0.00 0.89±0.23 0.73±0.15ab 0.59±0.07abc 15.448＊c-Src 1.00±0.00 0.78±0.18a 0.72±0.10a 0.64±0.12ab 22.874＊CK 1.00±0.00 0.96±0.20 0.75±0.13ab 0.57±0.06abc 25.336＊Integrin β3 1.00±0.00 0.87±0.28a 0.81±0.16a 0.91±0.18 9.612＊

2.5 SAL 抑制破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src 蛋白表達(dá)水平 與 對(duì) 照 組 比 較，15、30 和60 mg∕L SAL 組 的MMP-9、c-Src蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表3。

Fig.3 Effects of SAL on alizarin red staining of osteoclast calcium nodules圖3 SAL對(duì)破骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色的影響

Fig.4 Effects of SAL on MMP-9 and c-Src protein expression圖4 SAL對(duì)破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨是一種具有礦化能力的結(jié)締組織，在骨重塑和骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間存在信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象［11］。破骨細(xì)胞可以通過(guò)空泡腺苷三磷酸（ATP）酶、補(bǔ)體C3a、微小RNA 等影響成骨細(xì)胞骨形成；同時(shí)，成骨細(xì)胞也可以通過(guò)骨保護(hù)素∕核因子受體活化因子∕核因子受體活化因子配體（OPG∕RANK∕RANKL）、死亡受體∕死亡配體（Fas∕FasL）等通路影響破骨細(xì)胞的分化與凋亡［12］。破骨細(xì)胞完成骨吸收主要是依靠其特有的超微結(jié)構(gòu)，通過(guò)細(xì)胞骨架重組形成極化構(gòu)象，將細(xì)胞表面膜分成封閉區(qū)、褶皺緣、基底外側(cè)區(qū)和功能分泌區(qū)［13］。極化后的破骨細(xì)胞通過(guò)足質(zhì)體貼附于骨表面，同時(shí)F-Actin環(huán)圍繞褶皺緣形成獨(dú)立的微環(huán)境，CK 和MMP-9 等水解酶的釋放可以實(shí)現(xiàn)骨吸收［14］。

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MMP-9 and c-Src protein between the four groups表3 各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MMP-9 and c-Src protein between the four groups表3 各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與15 mg∕L SAL 組比較，c與30 mg∕L SAL組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組15 mg∕L SAL組30 mg∕L SAL組60 mg∕L SAL組F MMP-9 1.00±0.00 0.71±0.03a 0.53±0.10ab 0.28±0.02abc 35.368＊＊c-Src 1.00±0.00 0.64±0.08a 0.42±0.05ab 0.14±0.04abc 52.159＊＊

中藥紅景天具有補(bǔ)腎、扶正固本、理氣養(yǎng)血和滋補(bǔ)強(qiáng)身等功效?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，紅景天含有40多種化合物，主要成分為SAL、酪醇等，具有抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒等作用［15-16］。研究還發(fā)現(xiàn)，其主要活性成分SAL具有上調(diào)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的作用，能促進(jìn)成骨性的骨生成［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAL 能夠抑制sRANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和極化、F-Actin環(huán)形成，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成，抑制破骨細(xì)胞骨吸收關(guān)鍵蛋白酶MMP-9、c-Src 的活性，顯示出確切的抗骨質(zhì)疏松作用。

基于SAL 確切的抑制骨吸收作用，本研究觀察了其對(duì)破骨細(xì)胞分化、極化和骨吸收的影響。破骨細(xì)胞由sRANKL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化而成。在破骨細(xì)胞分化和極化過(guò)程中，破骨細(xì)胞特異性表達(dá)骨吸收標(biāo)志蛋白MMP-9、c-Src 等［18］。MMP-9 為破骨細(xì)胞分泌的蛋白水解酶，參與細(xì)胞外膠原基質(zhì)的降解，維持破骨細(xì)胞的骨吸收功能。MMP-9 在哺乳動(dòng)物胚胎期軟骨內(nèi)成骨及骨重建時(shí)起到膠原酶的作用，是破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入礦化組織所必須的生物因子，破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MMP-9 表達(dá)上調(diào)，加速骨吸收［19］。因此，SAL可能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)來(lái)增加鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色程度。c-Src 及其磷酸化產(chǎn)物p-Src 參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞極化及褶皺緣的形成。F-Actin 環(huán)是破骨細(xì)胞特有的進(jìn)行骨吸收的細(xì)胞骨架蛋白，反映了破骨細(xì)胞的骨吸收功能［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAL 能顯著減少由sRANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)目，抑制破骨細(xì)胞的分化與極化，減少F-Actin 環(huán)形成，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)增多，降低破骨細(xì)胞的MMP-9 及c-Src 的表達(dá)，表明SAL 能夠抑制破骨細(xì)胞骨吸收，減少骨丟失。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，SAL能夠抑制破骨細(xì)胞的分化、極化和骨吸收作用，為SAL的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。本研究的不足之處是僅觀察了基因與蛋白水平的變化，尚未進(jìn)行相關(guān)信號(hào)通路的深入研究。另外，本研究?jī)H探究SAL 抑制體外破骨細(xì)胞的分化和極化，未通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討。