王春林 向勇 艾健 田啟東 胡鸞 趙志勇 王勇 董有康 張興宗 趙有強(qiáng)

摘要：目的 觀察拔伸松動(dòng)手法對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）早中晚期模型兔膝關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)的影響，探究拔伸松動(dòng)法對(duì)KOA損傷軟骨的治療機(jī)制。方法 健康成年白兔90只，隨機(jī)分為3組，拔伸松動(dòng)法組、模型組、空白組。每組10 只。采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關(guān)節(jié)2、4、6 周，復(fù)制膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎早期、中期和晚期的模型。采用掃描電鏡、透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解、線粒體固縮、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂、細(xì)胞固縮等改變;掃描電鏡觀察，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)不同程度的軟骨表面不光滑、變性、破損，關(guān)節(jié)腔表面滲出物附著物等改變。經(jīng)過(guò)拔伸松動(dòng)法治療干預(yù)，早中晚期拔伸松動(dòng)手法組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞水腫程度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞情況、軟骨表面形態(tài)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)滲出物情況較同期模型組均有改善，且以中期、晚期改善情況明顯。結(jié)論 拔伸松動(dòng)手法可以延緩模型兔膝骨性關(guān)節(jié)炎所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷，對(duì)損傷的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有修復(fù)作用。

關(guān)鍵詞：拔伸松動(dòng)法;膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：R244.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2022）03-0067-05

Effect of Pulling-stretching-loosening Manipulation on the Ultrastructure of Articular Cartilage in Knee Osteoarthritis Model Rabbits in Early， Middle and Late Stages

WANG Chun-lin1， XIANG Yong1， AI Jian2， TIAN Qi-dong2， HU Luan2， ZHAO Zhi-yong2，WANG Yong2， DONG You-kang1， ZHANG Xing-zong2， ZHAO You-qiang1

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on the ultrastructure of knee articular cartilage in knee osteoarthritis （KOA） model rabbits of early， middle and late stages and to explore the curative mechanism of pulling-stretching-loosening manipulation on KOA-damaged cartilage. Methods： 90 healthy adult white rabbits were randomly divided into 3 groups， the pulling-stretching-loosening manipulation group， the model group and the blank group， 10 rabbits per group. The Videman T modeling method was used to immobilize the knee joint of the right hind limb of the rabbit for 2， 4 and 6 weeks with cast plaster to replicate the early， middle and late stage models of knee osteoarthritis. The scanning electron microscope and transmission electron microscope were used to observe the morphology of chondrocytes. Results： The cartilage cells of the knee joint of the rabbits in the model group showed changes such as cell edema， endoplasmic reticulum dissolution， mitochondrial pyknosis， cell structure rupture and cell pyknosis. The scanning electron microscopy showed that the knee joint cartilage of the model group presented different degrees of uneven cartilage surface， degeneration， damage and exudate attachments in the joint cavity surface. After the intervention of pulling-stretching-loosening manipulation， the degree of edema， cell structure damage， cartilage surface morphology and exudate in the joint cavity of the rabbit knee joint in the early， middle and late stages of the pulling-stretching-loosening manipulation group were improved compared with the model group at the same period. The improvement was obvious in the middle and late stages. Conclusion： The pulling-stretching-loosening manipulations can delay the articular cartilage damage caused by the model rabbit knee osteoarthritis， and has a repairing effect on the damaged articular cartilage cells.

【Key words】Pulling-Stretching -Loosening Manipulation; Knee Osteoarthritis; Ultrastructure of Chondrocytes

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，其臨床癥狀主要為膝關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。隨著全球人口老齡化的進(jìn)展，KOA的發(fā)病也呈上升趨勢(shì)。近年來(lái)筆者采用拔伸松動(dòng)法治療KOA取得較好的臨床療效。關(guān)節(jié)軟骨的退變，軟骨細(xì)胞凋零是其發(fā)生過(guò)程的基本病理改變和原因[1]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)性兔KOA早中晚期模型，觀察拔伸松動(dòng)法治療對(duì)關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)及軟骨細(xì)胞凋亡情況的影響，探討拔伸松動(dòng)法對(duì)KOA關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用和軟骨細(xì)胞修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年白兔90只，體重（1.8～2.5）kg，雌雄不限，重量分布均一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由云南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為3組，每組10只：拔伸松動(dòng)法組、模型組、空白組。穩(wěn)定飼養(yǎng)7 d后，采取Videman T的造模方法制作兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20℃～25℃（日溫差≤3℃）;濕度40%～70%;照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 Lx;噪音≤60 dB。本次實(shí)驗(yàn)分3個(gè)階段進(jìn)行，采用Videman T造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關(guān)節(jié)2、4、6周，復(fù)制KOA早期、中期和晚期的模型。

1.2 干預(yù)方法

1.2.1 拔伸松動(dòng)法組 （1）屈伸患膝關(guān)節(jié)15次。（2）拔伸法施以患膝10 s后放松，然后在拔伸下分別以小魚際固定于膝關(guān)節(jié)下緣之內(nèi)側(cè)和外側(cè)，向?qū)?cè)推按10次（外側(cè)向內(nèi)側(cè)，內(nèi)側(cè)向外側(cè)）。（3）五指提拿髕骨10次，順時(shí)針和逆時(shí)針活動(dòng)髕骨10次。（4）上下左右推動(dòng)髕骨各10次。（5）屈伸患膝關(guān)節(jié)15次。（6）拔伸患膝10 s，在拔伸過(guò)程中作膝關(guān)節(jié)小幅度內(nèi)旋和外旋運(yùn)動(dòng)。每次10 min，隔日治療1次，治療20次后取標(biāo)本。

1.2.2 模型組 造模后正常飼養(yǎng)，不采取干預(yù)措施，與拔伸松動(dòng)法組同時(shí)取標(biāo)本。

1.2.3 空白組 不予造模，正常飼養(yǎng)，不采取干預(yù)措施，與上2組同時(shí)取標(biāo)本。

1.3 取材檢測(cè) 所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d取材。耳緣靜脈注射空氣20 mL栓塞處死，切開右膝關(guān)節(jié)前中區(qū)滑膜組織，以矢狀位切取脛骨內(nèi)側(cè)軟骨，取出軟骨組織，空置于脫酶處理的EP管內(nèi)，液氮轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ?.1 mol二甲砷酸鈉緩沖液漂洗標(biāo)本，在1%四氧化鋨中固定2 h后，再次以0.1 mol二甲砷酸納緩沖液漂洗，乙醇逐級(jí)脫水后于醋酸異戊醋保存過(guò)夜，后以二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，將其定向黏附于載物臺(tái)上，真空噴金，后通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 透射電鏡 通過(guò)透射電鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化，可以看到空白組軟骨細(xì)胞未出現(xiàn)水腫、胞質(zhì)內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體，線粒體較少，細(xì)胞核完整，胞膜結(jié)構(gòu)完整（見圖1.1A）。早期模型組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分輕度擴(kuò)張，線粒體未見明顯異常，胞質(zhì)內(nèi)有豐富高爾基體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核未見異常（見圖1.1B）。中期模型組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分少量擴(kuò)張，線粒體輕度腫脹，胞質(zhì)內(nèi)有豐富高爾基體、微絲水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核未見異常（見圖1.1C）。晚期模型組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解，線粒體固縮，胞質(zhì)內(nèi)少見高爾基體、微絲水腫、有大量脂質(zhì)溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂，細(xì)胞固縮（見圖1.1D）。早期干預(yù)組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)少見高爾基體、微絲水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核未見明顯異常（見圖1.1E）。中期干預(yù)組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體較少，胞質(zhì)內(nèi)少見高爾基體、微絲水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核未見異常（見圖1.1F）。晚期干預(yù)組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)局部輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體未見明顯異常，胞質(zhì)內(nèi)有豐富高爾基體、微絲水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核輕度邊集（見圖1.1G）。

從以上電鏡觀察結(jié)果可以看出，不同時(shí)間點(diǎn)的模型組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比較空白組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)溶解、線粒體固縮、有細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂，細(xì)胞固縮的情況，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的干預(yù)后，早期干預(yù)組比較模型組關(guān)節(jié)軟骨無(wú)明顯改善，中期干預(yù)組比較模型組有關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的改善，晚期干預(yù)組較治療模型組關(guān)節(jié)軟骨有明顯改善。

2.2 掃描電鏡 通過(guò)掃描電鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化，可以看到，空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)果完整，關(guān)節(jié)腔表面未見滲出物附著（見圖1.2A）。早期模組關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，軟骨出現(xiàn)變性，關(guān)節(jié)腔表面有少量量滲出物附著（見圖1.2B）。早期干預(yù)組關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，軟骨出現(xiàn)變性，關(guān)節(jié)腔表面有少量滲出物附著（見圖1.2C）。中期模型組軟骨表面不光滑，軟骨出現(xiàn)變性，關(guān)節(jié)腔表面有大量滲出物附著（見圖1.2D）。中期干預(yù)組軟骨表面部分結(jié)構(gòu)光滑，軟骨未出現(xiàn)變性，關(guān)節(jié)腔表面有少量滲出物附著（見圖1.2E）。晚期模型組關(guān)節(jié)軟骨表面有結(jié)晶物質(zhì)附著，表面結(jié)構(gòu)異常、變形、破損，不光滑，關(guān)節(jié)腔表面有大量滲出物附著，紅細(xì)胞出現(xiàn)，出現(xiàn)出血的情況（見圖1.2F）。晚期干預(yù)組關(guān)節(jié)軟骨表面結(jié)構(gòu)光滑，關(guān)節(jié)腔表面有少量滲出物附著，未見紅細(xì)胞出現(xiàn)以及出血的情況（見圖1.2G）。從以上掃描電鏡觀察結(jié)果可以看出不同模型組關(guān)節(jié)軟骨比較正常組軟骨出現(xiàn)壞死、變性、有大量大量滲出物附著的情況，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的干預(yù)后看出，早期干預(yù)組比較模型組關(guān)節(jié)軟骨無(wú)改善，中期干預(yù)組較模型組關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的改善，晚期干預(yù)組較模型組比較關(guān)節(jié)軟骨有顯著的改善。

3 討論

現(xiàn)代研究證實(shí)，推拿手法有助于改善關(guān)節(jié)周圍的血液循環(huán)和骨內(nèi)微循環(huán)，降低異常的血液黏度，降低骨內(nèi)壓，可促進(jìn)滑液向關(guān)節(jié)軟骨的浸透和擴(kuò)散，改善關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)和關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑，并能減輕軟骨的退變，還可增加股四頭肌之肌力，改善關(guān)節(jié)的活動(dòng)度[2-3]。Salter[4]經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究證實(shí)：早期持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)軟骨的再生和修復(fù)，認(rèn)為關(guān)節(jié)的反復(fù)屈伸運(yùn)動(dòng)可刺激軟骨組織中未分化的間質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加快軟骨組織的修復(fù)。

拔伸松動(dòng)法是以中醫(yī)推拿筋骨并重的理論為基礎(chǔ)，在臨床工作中總結(jié)創(chuàng)新形成的系列手法，包括對(duì)膝關(guān)節(jié)相關(guān)附屬肌肉的松解，以及股脛關(guān)節(jié)、髕股關(guān)節(jié)的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，體現(xiàn)了筋骨同治、動(dòng)靜結(jié)合的治療原則。前期的臨床研究證實(shí)，采用膝關(guān)節(jié)拔伸松動(dòng)法治療早中期 KOA 患者療效確切，可有效減輕疼痛，明顯改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度[5]。前期開展的基礎(chǔ)研究證實(shí)拔伸松動(dòng)法可降低 KOA 兔膝關(guān)節(jié)液中白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平[6-7]。

關(guān)節(jié)軟骨退變是OA病理改變的主要特征，軟骨細(xì)胞破壞凋亡是OA發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[8]。本實(shí)驗(yàn)中模型組透射電鏡觀察見，兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解、線粒體固縮、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂、細(xì)胞固縮等病理改變，掃描電鏡觀察見，兔膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)不同程度的軟骨表面不光滑、變性、破損，關(guān)節(jié)腔表面滲出物附著物等改變，且上述改變呈現(xiàn)早期<中期<晚期，與預(yù)期表現(xiàn)相一致。經(jīng)拔伸松動(dòng)法干預(yù)后，晚期干預(yù)組透射電鏡及掃描電鏡觀察顯示關(guān)節(jié)軟骨有明顯改善，中期干預(yù)組透射電鏡及掃描電鏡觀察顯示關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的改善，說(shuō)明拔伸松動(dòng)手法具有延緩膝中期、晚期KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨損傷，對(duì)損傷的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有修復(fù)的作用。早期模型兔軟骨掃描電鏡及投透射電鏡觀察顯示損傷程度輕，但早期治療組超微結(jié)構(gòu)改變不明顯，這一結(jié)果與預(yù)期不符，是干預(yù)方式的局限性還是造模方法存在問(wèn)題，尚待進(jìn)一步的研究證據(jù)。

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（收稿日期：2021-11-09）