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      長(zhǎng)鏈非編碼RNA SOX21-AS1調(diào)控miR-31-5p/MMP-16軸對(duì)胰腺癌細(xì)胞活性與增殖的影響

      2022-04-07 02:30:38臧龍軍陳東杰高文哲黃琿朱紅偉余梟
      中國普通外科雜志 2022年3期
      關(guān)鍵詞:熒光素酶細(xì)胞系胰腺癌

      臧龍軍,陳東杰,高文哲,黃琿,朱紅偉,余梟

      (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院肝膽胰II外科,湖南長(zhǎng)沙410013)

      胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,是全球第12位常見惡性腫瘤[1],也是癌癥死亡的第七大原因;在我國,2003—2013年居民癌癥數(shù)據(jù)顯示,胰腺癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第10位;其中胰腺導(dǎo)管腺癌的病死率在所有惡性腫瘤中位列第5位,5年相對(duì)生存率在常見惡性腫瘤中最差,僅為7.2%,且呈逐年惡化的趨勢(shì)[2]。胰腺癌起病隱匿,早期診斷困難,發(fā)現(xiàn)后即處于局部進(jìn)展期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移期,可手術(shù)切除率低,超過80%患者會(huì)在手術(shù)切除后復(fù)發(fā)[3],預(yù)后極差。而現(xiàn)階段仍缺乏針對(duì)中晚期侵襲性胰腺癌的治療手段,因此深入了解胰腺癌的分子病理學(xué)機(jī)制才能有助于開發(fā)高特異度、高效的靶向治療藥物[4]。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是不進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA,其中包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)。lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,是腫瘤進(jìn)展中重要的調(diào)節(jié)因子,參與了包括增殖、遷移、分化、凋亡等眾多細(xì)胞事件。此外,它還參與各種細(xì)胞過程,并通過與miRNA、mRNA相互作用等多種機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[5-8]。有研究報(bào)道lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9],lncRNA LINC00261的上調(diào)能明顯抑制胰腺癌在體內(nèi)及體外的細(xì)胞增殖和遷移[10],lncRNA TP73-AS1通過miRNA-128-3p/GOLM1軸促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。除此,對(duì)胰腺癌有影響的lncRNA還有BCAR4[12]、RP11-567G11.1[13]、CASC2[14]。

      SOX21-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種位于人類13號(hào)染色體上長(zhǎng)3 230 bp的lncRNA,為SOX21的反義基因,它與眾多惡性腫瘤關(guān)系密切,研究表明SOX21-AS1影響肺腺癌侵襲和遷移[15]及宮頸癌病程的進(jìn)展[16]。但目前SOX21-AS1在胰腺癌中的作用暫不明確。本研究旨在探索SOX21-AS1在胰腺癌病程發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用及機(jī)制,以期對(duì)提高臨床的診治及改善預(yù)后發(fā)揮作用。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

      5種胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990)和人胰管上皮細(xì)胞系HPDE由美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。所有細(xì)胞都在RPMI1640培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS,Thermo Fisher Scientific),在37℃、5%CO2加濕環(huán)境中培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明,使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。靶向SOX21-AS1的兩種siRNA購自ABC(Abcam,Cambridge,MA,USA);miR-31-5p模擬物和miR-31-5p抑制劑購自Genechem(中國上海)。

      1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析

      通過TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)從組織或細(xì)胞中提取總RNA。用PARIS試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)來源的RNA。使用SYBR PCR試劑盒(德泰生物,中國南京)對(duì)SOX21-AS1和MMP-16 mRNA進(jìn)行定量。使用NCode miRNA qRT-PCR分析評(píng)估m(xù)iR-31-5p的表達(dá)水平。以GAPDH的表達(dá)水平為對(duì)照對(duì)SOX21-AS1的表達(dá)水平做標(biāo)準(zhǔn)化。將miR-31-5p的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照U6。本研究所使用的引物序列見表1。

      表1 引物序列Table 1 Primer sequences

      1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

      miR-31-5p模擬物,miR-31-5p抑制物及其陰性對(duì)照購自RiboBio(中國廣州)。為了抑制SOX21-AS1的表達(dá),在U6/GFP/Neo質(zhì)粒(GenePharma,中國上海)中構(gòu)建了針對(duì)SOX21-AS1的siRNA序列(si-SOX21-AS1#1和si-SOX21-AS1#2),以攜帶非靶向序列的質(zhì)粒被用作對(duì)照。使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h,使用含有0.5 mg/mL G418的培養(yǎng)基(美國密蘇里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本研究中使用的所有引物均來自Genechem(中國上海)。轉(zhuǎn)染所使用的miRNA及siRNA序列見表2。

      表2 miRNA與siRNA序列Table 2 ThemiRNAand siRNAsequences

      1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

      使用pmirGLO熒光素酶表達(dá)載體(Promega,美國)構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒。通過從SOX21-AS1插入包含預(yù)測(cè)的miR-31-5p結(jié)合位點(diǎn)的片段,克隆了野生型SOX21-AS1(SOX21-AS1-WT)質(zhì)粒。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變,可以創(chuàng)建一個(gè)SOX21-AS1基因突變質(zhì)粒(SOX21-AS1-MT)。將HEK293T細(xì)胞鋪在6孔板中,并用含有SOX21-AS1-WT或SOX21-AS1-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對(duì)照的熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染。通過從miR-31-5p插入包含預(yù)測(cè)的MMP-16結(jié)合位點(diǎn)的片段,克隆了野生型MMP-16質(zhì)粒(MMP-16-WT)。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變,可以創(chuàng)建一個(gè)MMP-16基因突變質(zhì)粒(MMP-16-MT)。將HEK293T細(xì)胞鋪在6孔板中,并用含有MMP-16-WT或MMP-16-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對(duì)照的熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染。48 h后測(cè)定熒光素酶活性。

      1.5 細(xì)胞活力測(cè)定

      使用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。將轉(zhuǎn)染的PANC-1或SW1990細(xì)胞接種在96孔板中,并在不同時(shí)間點(diǎn)(接種后1、2、3、4、5 d)測(cè)量細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)而言之,將MTT溶液(20μL,Sigma-Aldrich)添加到細(xì)胞中4 h,除去培養(yǎng)基,然后添加二甲基亞砜。使用Quant Universal Microplate分光光度計(jì)(BioTek,Winooski,VT,美國)測(cè)定490 nm處的吸光度。

      1.6 集落形成試驗(yàn)

      轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞添加到6孔板(500個(gè)細(xì)胞/孔)中。2周后,將細(xì)胞固定,染色,然后成像并使用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。

      1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,并使用Student'st檢驗(yàn)和單向方差分析進(jìn)行評(píng)估。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 SOX21-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響

      在使用qRT-PCR對(duì)20例胰腺癌患者的胰腺癌組織和匹配的鄰近癌旁組織中的SOX21-AS1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后,結(jié)果顯示,SOX21-AS1在胰腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)(圖1A)。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,與癌旁組織HPDE相比,胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990中SOX21-AS1表達(dá)均升高(均P<0.05),其中SOX21-AS1在BXPC3、SW1990細(xì)胞中的表達(dá)高于其他細(xì)胞株,因此選用胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)敲低實(shí)驗(yàn)(圖1B)。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),SOX21-AS1高表達(dá)患者較其低表達(dá)患者預(yù)后差(P<0.05)(圖1C),表明SOX21-AS1可能與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度密切相關(guān)。

      圖1 胰腺癌中SOX21-AS1的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響A:qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)胰腺癌標(biāo)本和鄰近正常組織中SOX21-AS1的表達(dá)量;B:qRT-PCR檢測(cè)不同胰腺癌細(xì)胞系與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中SOX21-AS1表達(dá)量;C:TCGA生物學(xué)數(shù)據(jù)庫分析SOX21-AS1表達(dá)對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的影響Figure 1 Expression of SOX21-AS1 in pancreatic cancer and its association with the prognosis A:Relative expression of SOX21-AS1 detected by qRT-PCR in 20 cancer tissues and matched normal tissues;B:qRT-PCR analysis of the relative expression of SOX21-AS1 in pancreatic cell lines and normal pancreatic duct epithelial cell line;C:Influence of SOX21-AS1 on prognosisof pancreatic cancer patientsby TCGAanalysis

      2.2 沉默SOX21-AS1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力及增殖的影響

      由于SOX21-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度呈正相關(guān),進(jìn)一步使用功能喪失實(shí)驗(yàn)來確定其是否影響胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力及增殖水平。在使用靶向SOX21-AS1的兩種特定的siRNA轉(zhuǎn)染BXPC3、SW1990細(xì)胞后,qRT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組(si-NC)比較,BXPC3和SW1990細(xì)胞中,si-SOX21-AS1#1組與si-SOX21-AS1#2組中SOX21-AS1表達(dá)均降低(均P<0.05)(圖2A),表明轉(zhuǎn)染后SOX21-AS1表達(dá)沉默,提示轉(zhuǎn)染成功(且si-SOX21-AS1#1組中的沉默效果更明顯,故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該組siRNA進(jìn)行沉默)。隨后,通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),BXPC3和SW1990細(xì)胞中si-SOX21-AS1#1組的細(xì)胞活力均較各自si-NC組明顯降低(均P<0.05)(圖2B)。此外,克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在BXPC3和SW1990細(xì)胞中,si-SOX21-AS1#1組細(xì)胞增殖水平相較于si-NC組明顯下降(均P<0.05)(圖2C)。這些數(shù)據(jù)表明,沉默SOX21-AS1的表達(dá)降低了胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖水平。

      圖2 SOX21-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力、增殖的影響A:qRT-PCR檢測(cè)SOX21-AS1沉默后胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞中SOX21-AS1表達(dá)量;B:MTT檢測(cè)BXPC3與SW1990細(xì)胞的活力;C:細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BXPC3和SW1990細(xì)胞的增殖能力Figure 2 Effect of SOX21-AS1 on viability and proliferation of pancreatic cancer cells A:The relative expression of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 silencing detected by qRT-PCR;B:Cell viabilities of HPDE and BXPC3 cells determined by MTTassay;C:Thecolony formations BXPC3 and SW1990 cells measured by colony-forming assay

      2.3 SOX21-AS1的靶miRNA預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

      研究[17]表明,細(xì)胞質(zhì)lncRNA最常見的機(jī)制是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)來結(jié)合各種miRNA以抑制其對(duì)目標(biāo)mRNA的調(diào)節(jié)作用。為了確定SOX21-AS1是否可以作為miRNA的ceRNA,首先用qRT-PCR檢測(cè)了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中SOX21-AS1的表達(dá),結(jié)果顯示,SOX21-AS1轉(zhuǎn)錄本大多存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖3A)。此外,通過DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到SOX21-AS1與miR-31-5p存在靶向結(jié)合序列(圖3B)。在BXPC3、SW1990細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后,miR-31-5p表達(dá)相比陰性對(duì)照組(miR-NC)明顯升高(均P<0.01)(圖3C)。為了進(jìn)一步證實(shí)SOX21-AS1與miR-31-5p存在相互作用,將野生型(SOX21-AS1-WT)和突變型(SOX21-AS1-MT)結(jié)合miR-31-5p模擬物檢測(cè)熒光素酶活性,雙螢光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,在共轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后,SOX21-AS1-WT在BXPC3細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低,而SOX21-AS1-MT的活性沒有明顯改變,同樣的,SOX21-AS1-WT在SW1990細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性也明顯減弱,而SOX21-AS1-MT的熒光素酶活性沒有明顯改變(P<0.01)(圖3D),這不僅表明miR-31-5p是SOX21-AS1的直接靶標(biāo),也能證明miR-31-5p與SOX21-AS1結(jié)合位點(diǎn)存在于突變載體附近。qRT-PCR結(jié)果表明,在BXPC3和SW1990細(xì)胞中,沉默SOX21-AS1會(huì)導(dǎo)致miR-31-5p表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.005)(圖3E);與正常人胰腺組織相比,人胰腺癌組織中miR-31-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.01)(圖3F)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-31-5p與SOX21-AS1的關(guān)系,將SOX21-AS1與miR-31-5p行相關(guān)性分析,結(jié)果也發(fā)現(xiàn),SOX21-AS1的表達(dá)與miR-31-5p呈負(fù)相關(guān)(r2=0.257 1,P<0.05)(圖3G)。

      圖3 SOX21-AS1與miR-31-5p的關(guān)系分析A:核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BXPC3與SW1990中SOX21-AS1的分布情況;B:DIANA預(yù)測(cè)SOX21-AS1與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列;C:qRT-PCR分析在BXPC3、SW1990細(xì)胞中過表達(dá)miR-31-5p后miR-31-5p的表達(dá)量;D:過表達(dá)miR-31-5p后,轉(zhuǎn)染SOX21-AS1-WT及SOX21-AS1-MT的BXPC3與SW1990細(xì)胞的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告;E:qRT-PCR檢測(cè)干擾SOX21-AS1后BXPC3、SW1990中miR-31-5p的表達(dá);F:qRT-PCR檢測(cè)20例胰腺癌及鄰近正常組織中miR-31-5p的表達(dá);G:SOX21-AS1與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 3 Analysis of the relationship between SOX21-AS1 and miR-31-5p A:The distributions of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells examined by nuclear cytoplasmic fractionation assay;B:The targeted binding sequence of SOX21-AS1 with miR-31-5Ppredicted by DIANA;C:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells after miR-31-5p overexpression;D:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells with miR-31-5p overexpression after transfection with SOX21-AS1-WT and SOX21-AS1-MT;E:Relative expression of miR-106a-3p in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 interference determined by qRT-PCR;F:Relative expression levels of miR-31-5p in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;G:Correlation analysis between SOX21-AS1 and miR-31-5p expression

      為了進(jìn)一步驗(yàn)證SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p的表達(dá),進(jìn)行了部分挽救實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在抑制miR-31-5p表達(dá)后,與對(duì)照組(si-NC)比較,挽救組(si-SOX21-AS1+miR-31-5p inhibitor)組胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)均明顯降低(均P<0.01)(圖4A),提示該miR-31-5p抑制物有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沉默SOX21-AS1后,miR-31-5p的表達(dá)明顯上調(diào),而在加入miR-31-5p抑制劑后,miR-31-5p的表達(dá)降低但仍明顯于高于si-NC組(P<0.05)(圖4B);同樣地,在沉默SOX21-AS1后,SOX21-AS1的表達(dá)明顯下調(diào),而在給予miR-31-5p抑制劑后,SOX21-AS1的表達(dá)明顯上調(diào),但仍低于si-NC組(P<0.01)(圖4C)。此外,在對(duì)BXPC3和SW1990進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與si-NC比較,si-SOX21-AS1#1組中細(xì)胞活力明顯下降,在加入miR-31-5p抑制劑后出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)(均P<0.05)(圖4D)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在BXPC3、SW1990細(xì)胞中,與si-NC組比較,si-SOX21-AS1#1組中細(xì)胞增殖能力明顯減弱,在加入miR-31-5p抑制劑后,其增殖能力明顯恢復(fù)(均P<0.01)(圖4E)。綜上提示,SOX21-AS1作為miR-31-5p的ceRNA在胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

      圖4 SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p表達(dá)的驗(yàn)證A:qRT-PCR檢測(cè)使用miR-31-5p抑制劑后BXPC3、SW1990細(xì)胞中miR-31-5p的表達(dá)量;B:qRT-PCR檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞中,在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后miR-31-5p的表達(dá)量;C:qRT-PCR檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞系中,在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后SOX21-AS1的表達(dá)量;D:MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑的BXPC3與SW1990細(xì)胞的細(xì)胞活力;E:細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞中,加入si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和在此基礎(chǔ)上加入miR-31-5p抑制劑的細(xì)胞增殖能力Figure 4 Verification of targeted regulation of miR-31-5p expression by SOX21-AS1 A:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;B:Relative expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;C:Relative expression levels of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addition of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;D:Cell viabilities of BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by MTT assay;E:Proliferation abilities of BXPC3 and SW1990 cells after si-SOX21-AS1#1 transfection and miR-31-5p inhibitor addition detected by colony-forming assay

      2.4 miR-31-5p的靶mRNA分析及驗(yàn)證

      為了進(jìn)一步確定SOX21-AS1影響胰腺癌病程的機(jī)制,在DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了miR-31-5p靶位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和MMP-16 mRNA包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。為了證實(shí)miR-31-5p與MMP-16之間存在相互作用,將MMP-16-WT與MMP-16-MT(與miR-31-5p模擬物的結(jié)合位點(diǎn)突變序列)克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31-5p模擬物明顯降低了BXPC3和SW1990中MMP-16-WT的細(xì)胞的螢光素酶活性(均P<0.05),但在MMP-16-MT熒光素酶活性未見明顯變化(均P>0.05)(圖5B)。此外,在胰腺癌腫瘤組織中MMP-16的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常胰腺上皮細(xì)胞的表達(dá)(P<0.01)(圖5C),同時(shí),在進(jìn)行miR-31-5p與MMP-16相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)miR-31-5p的表達(dá)與MMP-16呈負(fù)相關(guān)(r2=0.311 3,P=0.010 6)(圖5D)。以上結(jié)果表明,miR-31-5p可能通過調(diào)節(jié)MMP-16參與胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展。

      圖5 miR-31-5p靶向調(diào)節(jié)MMP-16 A:DIANA預(yù)測(cè)MMP-16與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列;B:加入miR-31-5p模擬物后,轉(zhuǎn)染MMP-16-WT與MMP-16-MT的BXPC3細(xì)胞與SW1990細(xì)胞的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn);C:qRT-PCR檢測(cè)20例胰腺癌及鄰近正常組織中MMP-16的表達(dá)量;D:MMP-16與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 5 Target regulation of MMP-16 expression by miR-31-5p A:The targeted binding sequence in miR-31-5Pwith MMP-16 predicted by DIANA;B:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells transfected with MMP-16-WT or MMP-16-MT after addition of miR-31-5p mimics;C:Relative expression levels of MMP-16 in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;D:Correlation analysis between MMP-16 and miR-31-5p expressions

      3 討論

      本研究發(fā)現(xiàn),在胰腺癌組織和細(xì)胞系中SOX21-AS1水平升高,SOX21-AS1的下調(diào)抑制了胰腺癌細(xì)胞的活力和增殖。此外,還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和miR-31-5p表達(dá)之間存在相互抑制,這說明SOX21-AS1在胰腺癌細(xì)胞中存在通過miR-31-5p介導(dǎo)的促癌作用。本研究還證明了SOX21-AS1可通過抑制miR-31-5p來正向調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中MMP-16的表達(dá)。

      越來越多的證據(jù)表明,SOX21-AS1在多種類型的腫瘤中均起著腫瘤啟動(dòng)子的作用。例如,在結(jié)直腸癌患者中觀察到SOX21-AS1的顯著高表達(dá),而過表達(dá)的SOX21-AS1通過影響miR-145/MY06促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展[18]。SOX21-AS1在肝細(xì)胞癌[19],胃癌[20],三陰性乳腺癌[21]和骨肉瘤[22]中也上調(diào)。與這些報(bào)道一致,本研究觀察到胰腺癌組織和細(xì)胞系中的SOX21-AS1水平分別高于正常組織和HPDE6細(xì)胞,這表明SOX21-AS1可能是胰腺癌中的促癌基因。

      lncRNA可作為ceRNA發(fā)揮作用,從而消除了miRNA對(duì)它們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)源性抑制作用。通過核質(zhì)分離試驗(yàn)及qRT-PCR檢測(cè),筆者猜測(cè)SOX21-AS1可能在胰腺癌中通過ceRNA方式起作用。為了解SOX21-AS1在胰腺癌中影響的潛在機(jī)制,生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,SOX21-AS1中存在miR-31-5p的靶向序列,并已觀察到miR-31-5p在致癌作用中起抑癌基因的作用。先前的研究[23]表明,miR-31-5p通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1),從而作為腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制因子。在膀胱癌[24],鼻咽癌[25],胃癌[26]和肝細(xì)胞癌中[27],miR-31-5p表達(dá)也降低。同樣,本研究也確定在胰腺癌組織和細(xì)胞系中miR-31-5p減少。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1的下調(diào)顯著提高了miR-31-5p的水平,而在用miR-31-5p模擬物轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞中,SOX21-AS1的水平卻降低了;SOX21-AS1和miR-31-5p之間的互補(bǔ)對(duì)結(jié)合,并且進(jìn)一步證明SOX21-AS1與胰腺癌組織中的miR-31-5p呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明,SOX21-AS1和miR-31-5p可能會(huì)形成相互抑制的反饋回路。

      本研究探討了miR-31-5p是否會(huì)影響SOX21-AS1在胰腺癌細(xì)胞中的作用,結(jié)果揭示miR-31-5p抑制劑可以挽救SOX21-AS1的下調(diào)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生存能力和侵襲的抑制作用。SOX21-AS1的下調(diào)通過調(diào)節(jié)miR-31-5p抑制了胰腺癌細(xì)胞的活力和侵襲力。但是,當(dāng)前的研究不能排除SOX21-AS1也可能影響胰腺癌中其他miRNA或相關(guān)基因的可能性,這需要進(jìn)一步的研究。同時(shí),在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析中,預(yù)測(cè)SOX21-AS1和MMP-16包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點(diǎn)。Zhang等[28]報(bào)道,miR-155通過靶向SOCS1和MMP-16促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。因此推測(cè)SOX21-AS1可能起抑制miR-31-5p的作用,從而正向調(diào)節(jié)MMP-16的表達(dá)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,MMP-16能誘導(dǎo)肝癌[29]、胃癌[30]等多種惡性腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移,而目前鮮有報(bào)道其在胰腺癌中的相關(guān)作用。本研究初步證明了SOX21-AS1能夠通過抑制miR-31-5p正向調(diào)節(jié)MMP-16表達(dá),繼而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖活力,這給未來MMP-16在胰腺癌中的研究提供了新的思路。

      總之,胰腺癌組織和細(xì)胞系中的SOX21-AS1水平顯著降低,SOX21-AS1表達(dá)的下調(diào)通過miR-31-5p水平的上調(diào)降低了細(xì)胞活力和侵襲。這些結(jié)果表明,SOX21-AS1是預(yù)測(cè)預(yù)后的關(guān)鍵分子標(biāo)志物,并且有望成為胰腺癌治療中的重要靶標(biāo)。

      利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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