依托咪酯對(duì)脊髓損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究*

楊光，姚富，陳永旺，劉玉林

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州646000；2.四川省骨科醫(yī)院，四川成都610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

Abstarct: Objective To investigate the cerebral protective effect of etomidate in rats with spinal cord injury(SCI), and to analyze the underlying mechanism. Methods Fifty of the 62 SPF male SD rats were used to establish the SCI models, and the successfully-established rat models (n = 48) were randomly divided into model group (n =12),low-dose etomidate group(n=12),medium-dose etomidate group(n=12)and high-dose etomidate group(n=12). The rest 12 rats were set as sham-operation group where only the T9 to T11 vertebral plates were removed without injuring the spinal cord. The low-, medium- and high-dose etomidate groups were injected 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg,and 2.7 mg/kg of etomidate fat emulsion injection,respectively through the tail veins once a day for 4 weeks.The rats in sham-operation group and model group were injected with the same amount of normal saline via tail veins at the same time.The neurobehavioral scores were evaluated after 4 weeks,and the levels of interleukin-1(IL-1β) and IL-18 in the cerebral spinal fluid (CSF) were measured via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the histopathological changes of the spinal cord in each group. The mRNA levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues of rats were detected by quantitative realtime polymerase chain reaction(qRT-PCR).The protein levels of NLRP3 and Caspase-1 were measured by Western blotting. Results Compared with the sham-operation group,the BBB scores were decreased,the levels of IL-1β and IL-18 in CSF were higher, and the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were increased in the model group, and low-, medium- and high-dose etomidate groups (P ＜0.05). However, the BBB scores were higher,and the levels of IL-1β and IL-18 in CSF as well as the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were lower in the low-, medium- and high-dose etomidate groups than those in the model group(P ＜0.05). Conclusions Etomidate plays a cerebral protective role in SCI,potentially by inhibiting the activation of NLRP3/Caspase-1 pathway and attenuating the inflammatory response.

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是各種原因?qū)е伦倒軆?nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)及其功能損害而引起的脊髓功能障礙，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。隨著我國交通和建筑業(yè)的發(fā)展，SCI 發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其病理生理機(jī)制復(fù)雜，臨床治療效果非常有限。有研究表明，炎癥反應(yīng)與SCI 進(jìn)展關(guān)系密切[2]。依托咪酯是一種短效非巴比妥類靜脈全身麻醉藥物，具有起效快、鎮(zhèn)靜作用完全、對(duì)呼吸循環(huán)影響小的特點(diǎn)[3]。周小建等[4]研究顯示，依托咪酯能夠抑制SCI 后炎性介質(zhì)水平，進(jìn)而抑制脊髓繼發(fā)性損傷。目前依托咪酯對(duì)SCI 后腦損傷的保護(hù)作用研究少見報(bào)道，因此本研究探究依托咪酯對(duì)SCI 大鼠的腦保護(hù)作用，以期為SCI 后神經(jīng)功能的恢復(fù)治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

62只12周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重180～220 g，平均（200±20）g，購自北京日新科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2021-0260。

1.2 主要試劑及儀器

依托咪酯脂肪乳注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020511），白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素18（Interleukin-18， IL-18）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司），兔抗鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3， NLRP3）、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗（艾美捷科技有限公司）。SorvallWX 型超速離心機(jī)（北京松信宏澤科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型的復(fù)制及分組給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，參考改良Allen's 法復(fù)制SCI 模型大鼠[5]。腹腔注射10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，背部備皮消毒，沿背部中線逐層剝開皮膚去除T9～T11錐板，以質(zhì)量為10 g 的打擊錘，由5.0 cm 高處自由落下錐擊T10脊髓后迅速移開。觀察錐擊瞬間鼠尾出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，雙后肢及軀體出現(xiàn)回縮撲動(dòng)后雙后肢出現(xiàn)癱瘓即為模型復(fù)制成功。

共復(fù)制SCI 大鼠50 只，死亡2 只，成功48 只，隨機(jī)分為模型組及依托咪酯低、中、高劑量組，每組12 只。另取12 只大鼠作為假手術(shù)組，只去除T9～T11錐板，不進(jìn)行打擊錘錐擊，其余操作同模型組。

依托咪酯低、中、高劑量組大鼠分別尾靜脈注射0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg 依托咪酯脂肪乳注射液[6]，1 次/d，連續(xù)4 周；假手術(shù)組和模型組大鼠同時(shí)間尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3.2 評(píng)估各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)各組大鼠治療4 周后，觀察大鼠行走，髖、膝、踝關(guān)節(jié)的協(xié)調(diào)情況，觀察時(shí)間4 min[7]，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)，分值為0～21 分，0 分表示大鼠神經(jīng)行為功能完全喪失，21 分表示神經(jīng)行為功能完全正常。

1.3.3 樣本采集第4 周神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估結(jié)束后，采集各組大鼠腦脊液[8]。采用10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定在腦立體定位儀上，剪開頭頸部皮膚找到寰枕。通過PE 連接管將150 μL 微量進(jìn)樣器與植入式套管連接在一起，套管穿刺枕大池，抽取150 μL 腦脊液用于ELISA 檢測(cè)。

將各組大鼠斷頸處死，取損傷區(qū)脊髓組織分成3 部分，其中一部分置于甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），用于HE染色；另兩部分保存于液氮中，分別用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blotting 檢測(cè)。

1.3.4 ELISA 檢測(cè)各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18用人工腦脊液對(duì)樣本進(jìn)行等量稀釋，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平[9]。

1.3.5 HE 染色觀察各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化取1.3.3 中各組大鼠部分脊髓組織切片，脫蠟水化進(jìn)行HE 染色，以中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 檢測(cè)各組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1 mRNA 的表達(dá)提取1.3.3 中各組大鼠部分脊髓組織總RNA 并測(cè)濃度，以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)[10]?？偡磻?yīng)體系20 μL：ULtraSYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向游引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s、60℃變性60 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線：60℃至95℃，每15 秒升溫0.3℃。qRT-PCR 引物由上海韻泰信息科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參， 采用2-ΔΔCt法計(jì)算NLRP3、Caspase-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 測(cè)定各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表達(dá)從液氮中取出剩余部分脊髓組織，制備組織勻漿，加入裂解液并依據(jù)蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗NLRP3、Caspase-1 及內(nèi)參β-actin，1∶500 稀釋，4℃過夜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。顯色、成像，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評(píng)分分別為（25.06±3.76）分、（9.87±1.47）分、（13.43±2.05）分、（16.95±2.55）分和（19.87±2.95）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.460，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評(píng)分降低（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評(píng)分高于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。

2.2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型組，具有劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較（n=12，pg/mL，±s）

表2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較（n=12，pg/mL，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

IL-18 265.78±38.96 965.82±145.87①813.25±121.98①②605.68±90.08①②③423.69±63.56①②③④96.635 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值IL-1β 172.36±25.83 1 506.25±150.23①1 211.77±181.75①②825.69±123.85①②③512.75±75.89①②③④220.049 0.000

2.3 各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞形態(tài)正常且分布均勻；模型組大鼠脊髓組織內(nèi)有大量空腔，脊髓結(jié)構(gòu)紊亂且有大量炎癥細(xì)胞浸潤，脊髓神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫壞死；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)紊亂稍減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，且水腫壞死脊髓神經(jīng)細(xì)胞減少，此種變化程度隨濃度增加而更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化 （HE染色×400）

2.4 各組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。見表3。

表3 各組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

表3 各組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

Caspase-1 mRNA 1.01±0.16 2.11±0.32①1.95±0.29①②1.63±0.25①②③1.28±0.18①②③④40.745 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值NLRP3 mRNA 1.00±0.15 2.35±0.36①2.06±0.31①②1.67±0.26①②③1.33±0.19①②③④50.225 0.000

2.5 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1 通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。見表4和圖2。

圖2 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

Caspase-1蛋白0.31±0.05 1.17±0.17①0.92±0.14①②0.73±0.11①②③0.45±0.07①②③④106.606 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值NLRP3蛋白0.25±0.04 1.28±0.18①1.05±0.16①②0.72±0.11①②③0.51±0.08①②③④130.348 0.000

3 討論

SCI 是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有較高發(fā)生率、致殘率，低病死率及年輕化的特點(diǎn)，目前臨床仍無有效治療手段，患者近期及遠(yuǎn)期療效均不理想[12]。有研究表明，SCI 病理生理機(jī)制復(fù)雜，且SCI 往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下的神經(jīng)行為功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[13]。因此探尋有效治療藥物及新型治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者預(yù)后具有較大意義。依托咪酯是一種非巴比妥類催眠性靜脈全身麻醉藥物，是咪唑類衍生物，安全性大，是常用的麻醉誘導(dǎo)藥物之一[14]。有研究結(jié)果顯示，依托咪酯能夠改善頸髓損傷患者脊髓部分功能，提高患者生活質(zhì)量[15]。

BBB 評(píng)分主要是針對(duì)截癱平面以下的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，用于SCI 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)過程評(píng)價(jià)，反映SCI 病情嚴(yán)重程度[16]。本研究復(fù)制SCI 大鼠模型后，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評(píng)分降低，但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評(píng)分高于模型組，具有劑量依賴性，說明依托咪酯可能對(duì)SCI 大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，即發(fā)揮腦保護(hù)作用，進(jìn)而有助于脊髓神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的再生及恢復(fù)。有研究表明，早期微循環(huán)障礙所致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能在繼發(fā)性SCI 中發(fā)揮關(guān)鍵作用；IL-1β、IL-18均是具有多種生物學(xué)功能的炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重SCI 繼發(fā)性損傷[17]。鎖志剛等[18]研究顯示，IL-18 在SCI 大鼠脊髓組織中高表達(dá)，促進(jìn)SCI 繼發(fā)性損傷。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平升高；但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型組，具有劑量依賴性，說明依托咪酯可能通過抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

NLRP3 是一種多蛋白復(fù)合物，NLRP3 炎癥小體受到刺激后可剪切Caspase-1，促使Caspase-1 活化，活化的Caspase-1 進(jìn)一步活化下游蛋白，進(jìn)而促使大量炎癥因子如IL-1β、IL-18 等釋放，加重炎癥反應(yīng)[19]。蔣偉宇等[20]研究顯示，抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，可促進(jìn)SCI 兔神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組，具有劑量依賴性。說明依托咪酯可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，依托咪酯發(fā)揮SCI 腦保護(hù)作用可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。然而本研究并未能明確依托咪酯對(duì)NLRP3/Caspase-1 通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入闡述。