譚 佳 郭瑩瑩 周新麗

(上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所 上海 200093)

近50年來(lái)，男性精子數(shù)量呈大幅下降趨勢(shì)[1]，且男性不育癥的患病率已接近10%[2]，這引發(fā)了人們對(duì)現(xiàn)代環(huán)境影響生育的擔(dān)憂。男性不育可能是由多種潛在因素造成的，包括精子產(chǎn)生和精子傳遞缺陷。其中，非梗阻性無(wú)精癥是影響男性生殖健康最為嚴(yán)重的一類表型，目前尚缺乏使患者恢復(fù)生精功能的治療手段。此外，醫(yī)療手段的進(jìn)步使青少年癌癥患者的整體生存率提高，但放化療對(duì)其生育力的損傷在一定程度上是不可逆的，男性兒童癌癥幸存者的不孕不育率已達(dá)到46%[3]。由于精液冷凍僅適用于青春期后的患者，對(duì)于還未產(chǎn)生精子的青春期前男孩并不適用。已有研究證實(shí)對(duì)青春期前的女孩進(jìn)行卵巢組織的冷凍保存，并在成年時(shí)移植，可恢復(fù)其生育能力[4]。那么，對(duì)于無(wú)法取精的不育患者，或者患有癌癥需放化療的精液中未產(chǎn)生精子的青春期前男孩，將其睪丸組織進(jìn)行冷凍也是潛在的保存生育力的方法。冷凍復(fù)蘇后的睪丸組織可自體移植，重建生精過(guò)程，使患者恢復(fù)生育力而自然生育。

睪丸組織的低溫保存方法主要有慢速冷凍法與玻璃化冷凍法，兩者的主要區(qū)別在于冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant, CPA)的濃度和使用的冷卻速率。在慢速冷凍保存中，即使在最佳冷卻速率下，仍不可避免細(xì)胞外冰晶帶來(lái)的機(jī)械損傷。而在玻璃化凍存中，細(xì)胞及高濃度保護(hù)劑溶液以足夠快的冷卻速率降溫，從而形成玻璃態(tài)，理論上避免了胞內(nèi)外結(jié)晶引起的冰晶損傷。但睪丸組織由于體積較大，且細(xì)胞的滲透特性不一，與單個(gè)細(xì)胞(如精子)相比，玻璃化保存也更具挑戰(zhàn)性。目前，關(guān)于成人和青春期前小鼠睪丸組織玻璃化凍存的研究尚不完善，且有學(xué)者指出玻璃化凍存可能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、DNA完整性喪失等[5]。

玻璃化凍存在冷凍前需要加載較高濃度的CPA，由于睪丸組織自身對(duì)水及保護(hù)劑的滲透能力較低，若加載時(shí)間過(guò)短，保護(hù)劑無(wú)法滲透至生精小管內(nèi)部；若加載時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將導(dǎo)致組織表層的精原細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于保護(hù)劑溶液中，使其受到較大的滲透損傷和毒性損傷[6]。因此，為了在滲透作用與毒性作用之間找到平衡，最大限度地提高保護(hù)劑對(duì)睪丸組織的保護(hù)作用，需要對(duì)睪丸組織玻璃化冷凍所使用的保護(hù)劑種類、濃度及加載時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。C. Yildiz等[7]對(duì)比了三種不同濃度及加載時(shí)間的一日齡新生小鼠的整個(gè)睪丸組織玻璃化凍存效果，分別為：1)G. Rahimi等[8]的凍存方法：一步法添加保護(hù)劑，體積分?jǐn)?shù)為40%的EG+體積分?jǐn)?shù)為18%的Ficoll+0.35 mol/L蔗糖，在1.8 mL凍存瓶中浸泡6 min后直接投入液氮；2)F. Migishima等[9]的凍存方法：兩步添加保護(hù)劑，體積分?jǐn)?shù)為7.5%DMSO的保護(hù)劑溶液中浸泡5 min，轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為15%的DMSO+1 mol/L乙酰胺+3 mol/L丙二醇中浸泡3 min，裝載于1.5 mL凍存管投入液氮；3)R. C. Chain等[10]的凍存方法：兩步添加保護(hù)劑，在體積分?jǐn)?shù)為7.5%的EG+體積分?jǐn)?shù)為7.5%的PROH中浸泡5 min，轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為15%的EG+體積分?jǐn)?shù)為15%的PROH+0.5 mol/L蔗糖中浸泡2 min后，裝載于凍存管投入液氮，將各組睪丸組織冷凍復(fù)溫后移植于小鼠體內(nèi)，觀察組織移植后產(chǎn)生精子的能力，結(jié)果表明，只有第一組高濃度保護(hù)劑玻璃化產(chǎn)生了活性精子?？梢钥闯觯壳安G丸組織玻璃化凍存方法中所使用的保護(hù)劑種類、濃度及加載方案區(qū)別較大，所得到的凍存結(jié)果也相差很大。

目前關(guān)于睪丸組織凍存的研究，大多以復(fù)蘇后細(xì)胞和組織的活性對(duì)凍存方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以此為依據(jù)調(diào)整凍存工藝，耗費(fèi)較多的材料和人力。M. Curaba等[11]以乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)評(píng)估的組織活力，免疫組化檢測(cè)的細(xì)胞凋亡和增殖，光鏡檢測(cè)的小管直徑、完整性和細(xì)胞密度作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比了青春期前小鼠睪丸組織玻璃化和慢速冷凍的結(jié)果，結(jié)果顯示兩種方法均保留了青春期前小鼠睪丸組織的存活、發(fā)育和完整性。C. S. Andrae等[12]以生精小管基底膜脫離的比例、各類細(xì)胞的凋亡情況為依據(jù)，對(duì)比了灰狼睪丸組織玻璃化和慢速冷凍，結(jié)果表明慢速冷凍可以更好地保持冷凍保存的睪丸組織形態(tài)。差示掃描量熱法通過(guò)測(cè)量樣品在特定的降溫程序下發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象時(shí)的相變溫度和相變過(guò)程中的焓變，判斷特定種類及濃度的保護(hù)劑抑制冰晶形成和生長(zhǎng)的能力，從而對(duì)保護(hù)劑的選擇起到指導(dǎo)作用[13]，大大減少了實(shí)驗(yàn)工作量。李鑫等[14]借助差式掃描量熱儀(DSC) 研究了天然氨基酸中的L-賴氨酸、L-脯氨酸、甘氨酸和 L-絲氨酸水溶液的成核溫度、結(jié)晶焓和冰點(diǎn)溫度隨溶液濃度及降溫速率的變化規(guī)律，獲得了4種氨基酸低溫保護(hù)劑水溶液的未凍水含量，并分析了氨基酸類保護(hù)劑與水分子的作用機(jī)理。受以上研究的啟發(fā)，若運(yùn)用DSC檢測(cè)加載保護(hù)劑后睪丸組織在降溫過(guò)程中形成組織內(nèi)冰晶的相變溫度及相變焓，可用于研究不同體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑溶液及不同浸泡時(shí)間加載保護(hù)劑后，抑制組織內(nèi)形成冰晶的能力，對(duì)睪丸組織凍存過(guò)程中保護(hù)劑加載方案的選擇具有指導(dǎo)性意義。

基于以上分析，本文首先運(yùn)用差示掃描量熱儀，對(duì)在不同體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑中浸泡不同時(shí)間后的睪丸組織進(jìn)行熱分析，推測(cè)不同保護(hù)劑加載方案對(duì)組織內(nèi)部抑制冰晶形成的能力；其次，對(duì)睪丸組織進(jìn)行玻璃化冷凍保存，結(jié)合熱分析結(jié)果及睪丸組織的凍后管腔完整率及組織內(nèi)各生殖細(xì)胞的凋亡率，綜合分析玻璃化凍存效果；最后，將睪丸組織玻璃化凍存與優(yōu)化的慢速冷凍保存結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，得出更適用塊狀睪丸組織冷凍的方法。本研究的結(jié)果對(duì)推動(dòng)人睪丸組織凍存的臨床應(yīng)用有參考意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及其配置

睪丸組織基礎(chǔ)液為含體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的DF12(DMEM/F-12 medium)培養(yǎng)液。用基礎(chǔ)液按照體積分?jǐn)?shù)配置三組玻璃化冷凍液、復(fù)蘇溶液及洗滌溶液，具體組成如表1所示。每組玻璃化冷凍液由平衡溶液(equilibration solution, ES)和玻璃化溶液(vitrification solution, VS)兩部分組成。

表1 玻璃化冷凍液及復(fù)蘇液

1.2 小鼠睪丸組織采集

選取5～8周齡的雄性小鼠，將其安樂(lè)死后快速置于手術(shù)臺(tái)上，用酒精棉輕輕擦拭腹部，用消毒后的無(wú)菌剪刀剪開(kāi)小鼠下腹部，找到睪丸后剪去附睪連接組織以取出睪丸，置于室溫下(約24～26 ℃)的睪丸組織基礎(chǔ)液中，用鑷子與剪刀夾住睪丸表面白膜輕輕撕開(kāi)，獲得睪丸內(nèi)部組織，備用。

1.3 睪丸組織的保護(hù)劑溶液加載方案

睪丸組織采用兩步法進(jìn)行玻璃化保護(hù)劑的加載。首先，將睪丸組織在各組平衡溶液(ES1、ES2、ES3)中浸泡10 min，然后在其對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液(VS1、VS2、VS3)中分別加載1、3、5 min，得到9組保護(hù)劑溶液加載方案。以玻璃化溶液中DMSO的體積分?jǐn)?shù)和加載時(shí)間表示9種保護(hù)劑的冷凍方案，如表2所示。例如20%(體積分?jǐn)?shù))-1 min表示睪丸組織在平衡溶液ES1中浸泡10 min，然后對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液VS1中加載1 min。

表2 睪丸組織在不同保護(hù)劑加載方案后的熱分析

1.4 睪丸組織的量熱分析

采用差示掃描量熱儀(DSC200 F3，Netzsch，德國(guó))進(jìn)行熱分析，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行溫度和靈敏度校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)每組取約9 mg小鼠睪丸組織，按照兩步法保護(hù)劑加載方案在對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液中平衡對(duì)應(yīng)時(shí)間后，將組織放置于吸水紙上停留3 s吸取組織表面殘留溶液，然后將組織平鋪于鋁坩鍋中，將鋁坩鍋及參皿放入分析腔，以100 ℃/min的降溫速率將樣品溫度降至-150 ℃，然后以100 ℃/min的升溫速率將樣品加熱至室溫25 ℃。根據(jù)升降溫的熱流曲線記錄每組升降溫過(guò)程中的結(jié)晶溫度、結(jié)晶焓、融溶溫度及熔融焓。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 睪丸組織玻璃化冷凍

玻璃化塑料載片(郜鴻生物科技有限公司，上海)由帶有標(biāo)圈的塑料薄片及手柄組成，為方便在液氮中移動(dòng)操作，用鐵絲將其固定。玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示。實(shí)驗(yàn)分9組，每組取1/3個(gè)睪丸，分別按照9種保護(hù)劑加載方案在對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液中平衡對(duì)應(yīng)時(shí)間，加載完成后吸去多余保護(hù)劑溶液，將睪丸組織平鋪于冷凍載片上，隨后迅速投入液氮保存。1 h后依次取出，將含有組織的一端浸入提前預(yù)熱至37 ℃的復(fù)蘇溶液中，組織解凍從載片脫落后繼續(xù)平衡1 min，將組織轉(zhuǎn)移至洗滌溶液1中平衡3 min，然后轉(zhuǎn)移至洗滌溶液2中繼續(xù)平衡5 min，隨后取出用DF12洗滌2～3次，放入含有體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS的DF12溶液的孔板內(nèi)，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

圖1 玻璃化冷凍步驟

1.6 睪丸組織慢速冷凍程序

郭瑩瑩[15]對(duì)睪丸組織的慢速冷凍方法進(jìn)行了優(yōu)化，其慢速冷凍保護(hù)劑按照體積分?jǐn)?shù)配置為：10% DMSO+10%FBS+0.1 mol/L蔗糖+DF12。首先在1.8 mL凍存管中裝入1 mL慢速冷凍保護(hù)劑，然后取半顆小鼠睪丸放入凍存管中，最后將小鼠睪丸組織以改進(jìn)兩步法在程序降溫儀(CryoMed Freezer 7453, Thermo Fisher Scientific, USA)中進(jìn)行冷凍。改進(jìn)兩步法冷凍程序?yàn)椋?)4 ℃停留10 min以加載低溫保護(hù)劑；2)1 ℃/min降至-40 ℃，停留1 min；3)快速取出投入液氮。復(fù)溫時(shí)從液氮中快速取出凍存管，置于37 ℃恒溫水浴鍋復(fù)溫，至冰晶融化。然后將冷凍管中的組織塊取出，放入1 mL的培養(yǎng)液中10 min去除保護(hù)劑，并用培養(yǎng)液洗滌3次。將組織放入裝有1 mL培養(yǎng)液的孔板內(nèi)，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

1.7 睪丸組織的凍存效果評(píng)價(jià)

睪丸組織形態(tài)以及生精小管內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性主要通過(guò)HE染色評(píng)價(jià)。半定量評(píng)估切片組織的管腔完整性，正常結(jié)構(gòu)評(píng)分為1，管腔受到損傷結(jié)構(gòu)評(píng)分為0。當(dāng)觀察到以下結(jié)構(gòu)變化時(shí)結(jié)構(gòu)評(píng)分為0∶1)精原細(xì)胞從基底膜分離；2)基底膜破裂；3)小管內(nèi)出現(xiàn)體積較大的空泡；4)小管內(nèi)空泡面積超過(guò)單根小管截面積的40%。最終管腔完整率計(jì)算方法見(jiàn)式(1)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別取3組平行，最終取平均值。

管腔完整率=

(1)

冷凍復(fù)溫后睪丸組織的凋亡水平采用Tunel試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行組織染色，染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，顯色后陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為棕黃色，存活細(xì)胞核顯藍(lán)色。在生精小管內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法(細(xì)胞形狀、核致密性和相對(duì)于基底膜的位置等)來(lái)確定各種細(xì)胞類型[16]。分別計(jì)算各類細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞凋亡數(shù)量，各生精細(xì)胞Tunel陰性率通過(guò)式(2)計(jì)算，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別取3組平行，最后取平均值。

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 睪丸組織不同方案加載保護(hù)劑后的熱分析

將睪丸組織按照9種保護(hù)劑加載方案在對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液中平衡對(duì)應(yīng)時(shí)間，然后運(yùn)用差示掃描量熱儀記錄浸泡后組織在降溫和升溫過(guò)程中的熱現(xiàn)象，睪丸組織相應(yīng)的結(jié)晶溫度、結(jié)晶焓、熔融溫度及熔融焓如表2所示，典型的熱流曲線如圖2所示。

圖2 睪丸組織凍融過(guò)程的熱流曲線

在體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO溶液中浸泡1、3、5 min后，典型熱流曲線如圖2(a)所示，降溫過(guò)程中有明顯結(jié)晶峰，升溫過(guò)程中有明顯融化峰。對(duì)比睪丸組織在體積分?jǐn)?shù)為20%組保護(hù)劑中浸泡3 min及1 min的數(shù)據(jù)，3 min組相變溫度降低，結(jié)晶焓值和熔融焓值均有所降低，說(shuō)明升降溫過(guò)程中形成的冰晶量減少。因此適當(dāng)延長(zhǎng)加載時(shí)間，可加強(qiáng)保護(hù)劑的跨膜運(yùn)輸，使組織在降溫過(guò)程中抑制組織內(nèi)冰晶形成的能力升高，減小組織內(nèi)部冰晶形成量。而當(dāng)浸泡時(shí)間延長(zhǎng)至5 min時(shí)，熔融焓值為64.2 J/g，低于1 min組，但高于3 min組，說(shuō)明5 min組在升降溫過(guò)程中形成的冰晶量高于3 min組。已有研究證實(shí)，細(xì)胞在保護(hù)劑溶液中浸泡時(shí)，在滲透壓差的作用下先失水皺縮，體積減小至最小值后將吸水恢復(fù)部分體積[6]，組織在浸泡5 min后可能正經(jīng)歷吸水膨脹過(guò)程，組織內(nèi)保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)低于20%，使組織內(nèi)形成冰晶量增大。

在體積分?jǐn)?shù)為30%的DMSO溶液中浸泡3 min后的睪丸組織，降溫過(guò)程中相變溫度及結(jié)晶焓值均小于1 min組，說(shuō)明浸泡3 min后的組織內(nèi)冰晶形成量小于1 min組。當(dāng)浸泡時(shí)間為5 min時(shí)，熱流曲線如圖2(b)所示，在降溫過(guò)程中未出現(xiàn)明顯結(jié)晶峰，實(shí)現(xiàn)了玻璃化；但升溫過(guò)程中，在-103.42 ℃出現(xiàn)反玻璃化現(xiàn)象，結(jié)晶焓值為11.47 J/g, 在-29.41 ℃反玻璃化形成的冰晶開(kāi)始融化，熔融焓值為26.21 J/g。

在體積分?jǐn)?shù)為40%的DMSO溶液中浸泡1、3、5 min后，典型熱流曲線如圖2(c)所示，在降溫過(guò)程中均未出現(xiàn)結(jié)晶峰，在復(fù)溫過(guò)程中也未出現(xiàn)反玻璃化現(xiàn)象，成功在降溫及升溫過(guò)程中實(shí)現(xiàn)玻璃化。原因可能在于體積分?jǐn)?shù)為40%的DMSO保護(hù)劑濃度較高，組織內(nèi)外滲透壓差較大，促進(jìn)了水及保護(hù)劑的跨膜運(yùn)輸，在短時(shí)間內(nèi)使組織內(nèi)濃度升高至玻璃化水平，因此在升降溫過(guò)程中均未出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象。

2.2 睪丸組織不同加載方案玻璃化凍存結(jié)果

將睪丸組織按照9種保護(hù)劑加載方案在對(duì)應(yīng)的保護(hù)劑溶液中平衡對(duì)應(yīng)時(shí)間，放在塑料載片上投入液氮中進(jìn)行玻璃化冷凍保存，對(duì)凍后睪丸組織進(jìn)行HE及Tunel染色，不同加載方案玻璃化的凍后管腔完整率及細(xì)胞凋亡陰性率如表3所示。

表3 不同加載方案玻璃化的凍后管腔完整率及細(xì)胞凋亡陰性率

由表3可知，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，浸泡3 min凍后睪丸組織管腔完整率為69.3%，高于1 min及5 min組。對(duì)比表2中的熱分析數(shù)據(jù)，浸泡3 min后的睪丸組織熔融焓值低于1 min及5 min組，說(shuō)明3 min組在降溫過(guò)程中抑制組織內(nèi)形成冰晶的能力較高,對(duì)管腔造成的機(jī)械損傷較小。此外，雖然DSC結(jié)果顯示睪丸組織浸泡5 min后的結(jié)晶量低于1 min，但睪丸組織在保護(hù)劑溶液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡受到了較大的毒性損傷，導(dǎo)致5 min組管腔完整率低于1 min組。對(duì)比體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO溶液中浸泡不同時(shí)間后凍融后的精原細(xì)胞凋亡情況，可以得出，隨著浸泡時(shí)間的增加，精原細(xì)胞凋亡率顯著增加。這可能是由于精原細(xì)胞位于管腔外周，其凋亡率易受管腔外溶液影響，與高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑溶液接觸時(shí)間越長(zhǎng)，精原細(xì)胞受到的毒性損傷越大。而精子細(xì)胞隨浸泡時(shí)間呈現(xiàn)的凋亡規(guī)律與精原細(xì)胞相反，隨著浸泡時(shí)間的增加，精子凋亡率下降。精子位于生精小管內(nèi)部，組織內(nèi)細(xì)胞種類復(fù)雜，且生精小管呈圓柱形，體表比值較大，對(duì)保護(hù)劑的滲透率較低，因此加載時(shí)間越長(zhǎng)，保護(hù)劑滲透?jìng)髻|(zhì)行為進(jìn)行得越充分，越能實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)部精子的保護(hù)作用。

當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，浸泡3 min管腔完整率為71.9%，高于 1 min及5 min組。對(duì)比表2，睪丸組織在30%DMSO中浸泡3 min相比于1 min組結(jié)晶量降低，說(shuō)明相較于浸泡1 min，浸泡3 min后組織在凍融過(guò)程中受到的冰晶機(jī)械損傷較小，因此管腔完整率較高。而5 min組在DSC熱分析中顯示可在降溫過(guò)程中實(shí)現(xiàn)非晶態(tài)固化，但在升溫過(guò)程中出現(xiàn)了反玻璃化現(xiàn)象。G. M. Fahy等[17]研究指出復(fù)溫過(guò)程中的反玻璃化現(xiàn)象，極易造成細(xì)胞在復(fù)溫過(guò)程中死亡。對(duì)于大體積樣本而言，升溫速率難以提高，若在復(fù)溫過(guò)程中造成重結(jié)晶，將對(duì)細(xì)胞帶來(lái)致命傷害。因此受反玻璃化影響，浸泡5 min組的管腔完整率僅為45.9%，顯著低于3 min組。體積分?jǐn)?shù)為30%組的凍后精原細(xì)胞及精子凋亡規(guī)律與體積分?jǐn)?shù)為20%實(shí)驗(yàn)組相似，位于管腔外側(cè)的精原細(xì)胞凋亡率隨浸泡時(shí)間的增加而增加，而位于管腔中心的精子細(xì)胞凋亡率隨加載時(shí)間增大而減小。

當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，浸泡3 min后的管腔完整率(84%)高于1 min及5 min組。相比于對(duì)照組，在體積分?jǐn)?shù)為40%的DMSO溶液中睪丸組織凍后精原細(xì)胞凋亡率顯著提高，不同浸泡時(shí)間后的精原細(xì)胞凋亡情況無(wú)顯著性差異。此外，由于體積分?jǐn)?shù)為40%的DMSO濃度較高，組織內(nèi)外的滲透壓差較大促進(jìn)了傳質(zhì)速率，因此，保護(hù)劑滲透至管腔內(nèi)部的所需時(shí)間較短，隨加載時(shí)間增加，管內(nèi)精子與高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑接觸時(shí)間增加，因此精子凋亡率隨浸泡時(shí)間增加呈上升趨勢(shì)。

綜合分析可知，在相同的浸泡時(shí)間下，管腔完整率隨保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。同時(shí)，相同浸泡時(shí)間下，高體積分?jǐn)?shù)組的生精細(xì)胞凋亡率高于低體積分?jǐn)?shù)組，雖然高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑可以促進(jìn)組織內(nèi)形成玻璃態(tài)，但高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑帶來(lái)的較大毒性損傷使得組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著高于低體積分?jǐn)?shù)組?，F(xiàn)有研究表明，細(xì)胞的損傷與CPA的滲透和毒性作用有關(guān)[18]。J. D. Benson等[19]建立了積累性毒性損傷模型J，表明加載時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞所受累積性毒性損傷越大?，F(xiàn)有研究多采用HE染色結(jié)果分析生精小管的組織的形態(tài)學(xué)完整性[18]，但該方法的所得管腔完整率被證實(shí)還不能確切地評(píng)估睪丸組織內(nèi)生殖細(xì)胞功能[20-21]。J. P. Milazzo等[21]表明Tunel染色所測(cè)定的細(xì)胞凋亡與睪丸組織功能喪失成正相關(guān)。因此，綜合考慮幾種生殖細(xì)胞的凋亡陰性率，篩選出運(yùn)用塑料載片進(jìn)行的睪丸組織玻璃化實(shí)驗(yàn)中，加載最優(yōu)方案為體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO保護(hù)劑加載1 min?，F(xiàn)有研究[7-10,22]多認(rèn)為高濃度保護(hù)劑對(duì)玻璃化凍存睪丸組織的效果優(yōu)于低濃度保護(hù)劑。這可能是因?yàn)樗麄儾捎脙龃婀軐?shí)現(xiàn)“玻璃化”，凍存體積較大，且凍存管管壁材質(zhì)傳熱性能較低，導(dǎo)致組織在降溫過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)的降溫速率較低，因此需要高濃度保護(hù)劑與低降溫速率相匹配。而本實(shí)驗(yàn)所用冷凍載體為塑料薄片，提高了降溫速率，且組織在裝載前用吸水紙吸去表面多余保護(hù)劑，減小了冷凍體積，所需保護(hù)劑濃度降至體積分?jǐn)?shù)為20%，并因此降低了細(xì)胞所受毒性損傷。

2.3 玻璃化凍存與慢速凍存的結(jié)果對(duì)比

將上述玻璃化凍存最優(yōu)結(jié)果與郭瑩瑩[15]之前優(yōu)化的睪丸組織慢速冷凍結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如表4所示。慢速冷凍保存睪丸組織管腔完整率高于玻璃化組，生殖細(xì)胞凋亡陰性率均顯著高于玻璃化組，且與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。B. S. Pukazhenthi等[23]研究指出凍存方法將影響凍后異種移植效果，對(duì)于新生羔羊睪丸組織，慢速冷凍保存優(yōu)于快速及玻璃化凍存。C. Yildiz等[7]在凍后移植小鼠睪丸組織，結(jié)果表明慢速冷凍可維持支持細(xì)胞產(chǎn)生雄激素能力，而玻璃化組移植后支持細(xì)胞產(chǎn)生激素能力顯著降低。然而，S. F. Moraveji等[22]將小鼠睪丸組織在體積分?jǐn)?shù)為7.5%的EG+體積分?jǐn)?shù)為7.5%的DMSO中浸泡10 min后轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為15%的EG+體積分?jǐn)?shù)為15%的DMSO中浸泡2 min，裝載于凍存管投入液氮，組織凍后管腔完整率達(dá)79%，顯著高于常用慢速冷凍組(62%)。M. Abrishami等[24]對(duì)比了慢速冷凍與固體表面玻璃化冷凍對(duì)小鼠睪丸組織低溫保存的影響，結(jié)果顯示，以DMSO作為保護(hù)劑時(shí)，在玻璃化溶液中浸泡5 min后的固體表面冷凍組織細(xì)胞存活率(80%)優(yōu)于慢速冷凍組(75%)。由以上對(duì)比可知，現(xiàn)有研究由于樣本體積、載體類型、保護(hù)劑種類與濃度及加載方案等因素的不同，對(duì)玻璃化和慢速冷凍兩種凍存方法的對(duì)比并未得出統(tǒng)一的結(jié)論。

表4 玻璃化與慢速冷凍方法的凍后管腔完整率及細(xì)胞凋亡陰性率

慢速冷凍通過(guò)使用較低濃度保護(hù)劑使得在降溫過(guò)程中在組織外形成冰晶以使細(xì)胞脫水，從而降低細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶的幾率。郭瑩瑩[15]對(duì)常用的睪丸組織慢速冷凍方法進(jìn)行改進(jìn)，提出了改進(jìn)的兩步法冷凍方案，減小了保護(hù)劑加載時(shí)間，提高了慢速冷凍兩個(gè)階段的降溫速率，且慢速冷凍最優(yōu)組所需保護(hù)劑濃度較低(體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO)。而玻璃化凍存是讓高濃度保護(hù)劑中的細(xì)胞在降溫速率較高的情況下胞內(nèi)形成玻璃態(tài)，理論上避免了胞內(nèi)冰晶的形成以減小對(duì)細(xì)胞的冰晶損傷。但高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑造成的較大毒性損傷限制了組織浸泡時(shí)間，且組織對(duì)保護(hù)劑的滲透能力低于單細(xì)胞，在有限的浸泡時(shí)間內(nèi)組織內(nèi)保護(hù)劑濃度難以達(dá)到玻璃化所需濃度，加上睪丸組織由于自身形成了較大熱阻，在冷凍過(guò)程中降溫速率難以提高至與單細(xì)胞相同的高降溫速率，因此在實(shí)際降溫過(guò)程難以實(shí)現(xiàn)完全玻璃化，在20%(體積分?jǐn)?shù))-1 min的DSC熱分析中同樣顯示，降溫過(guò)程中將出現(xiàn)組織內(nèi)冰晶。因此，如果用并未實(shí)現(xiàn)完全玻璃化的結(jié)果和慢速冷凍結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，來(lái)評(píng)價(jià)玻璃化方法相比于慢速冷凍方法的優(yōu)劣是不合適的，但我們可以認(rèn)為，在目前的冷凍條件下，慢速冷凍更適用于塊狀睪丸組織凍存。

3 結(jié)論

本文對(duì)小鼠塊狀睪丸組織的玻璃化保存方法進(jìn)行了研究，運(yùn)用差示掃描量熱儀，對(duì)在不同體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑中浸泡了不同時(shí)間后的小鼠塊狀睪丸組織進(jìn)行熱分析，隨后對(duì)其進(jìn)行玻璃化凍存，并將睪丸組織慢速冷凍保存與玻璃化凍存進(jìn)行了對(duì)比，得到如下結(jié)論：

1)低體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑組在降溫過(guò)程中檢測(cè)到了組織內(nèi)冰晶形成，而高體積分?jǐn)?shù)保護(hù)劑組在降溫過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了玻璃化冷凍，未有冰晶形成。

2)以生精細(xì)胞的凋亡陰性率為依據(jù)，篩選出體積分?jǐn)?shù)為20%DMSO保護(hù)劑溶液中浸泡1 min后進(jìn)行玻璃化凍存為最優(yōu)玻璃化加載方案，其凍后各生殖細(xì)胞凋亡陰性率分別為精原細(xì)胞78.6%，精母細(xì)胞90%，精子細(xì)胞70.1%，支持細(xì)胞89.1%。

3)與玻璃化凍存相比，慢速冷凍保存更能維持睪丸組織的凍后形態(tài)學(xué)完整性，并減小凍后生精細(xì)胞的凋亡率，是更適用塊狀睪丸組織冷凍的方法。

本文受上海市促進(jìn)市級(jí)醫(yī)院臨床技能與臨床創(chuàng)新能力三年行動(dòng)計(jì)劃重大臨床研究項(xiàng)目(SHDC2020CR3077B)資助。(The project was supported by Clinical Research Plan of Shanghai Hospital Development Center(No.SHDC2020CR3077B).)