王雅博 王曉曉 李雪強(qiáng) 張西龍 張京京 諸 凱

(天津商業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院 天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300134)

生物組織是一個復(fù)雜的有機(jī)體，包含細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙等微觀結(jié)構(gòu)，其中90%的水均存在于細(xì)胞內(nèi)。對于生物材料而言，水分運(yùn)輸方式包括水分自由擴(kuò)散和水勢梯度驅(qū)動下的水分遷移，相比于自由擴(kuò)散，在水勢梯度下的水分遷移更能反映植物組織內(nèi)水分輸運(yùn)特性[1]。水分遷移會引起組織收縮出現(xiàn)質(zhì)壁分離等宏觀現(xiàn)象，也會發(fā)生細(xì)胞破裂進(jìn)而形成孔隙等微觀結(jié)構(gòu)變化。如熱風(fēng)干燥產(chǎn)品細(xì)胞組織收縮、塌陷，真空冷凍干燥產(chǎn)品呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)[2]。微觀結(jié)構(gòu)變化會導(dǎo)致宏觀變化，也會通過影響質(zhì)量傳遞的擴(kuò)散進(jìn)而影響脫水過程，所以研究干燥過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化具有重要意義。

目前，大量研究集中于物料的水分遷移規(guī)律引起的微觀結(jié)構(gòu)變化。張群等[3]分析了藍(lán)莓在干燥過程中水分遷移和內(nèi)果皮微觀結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，隨著干燥過程中水分的散失，藍(lán)莓果干發(fā)生皺縮現(xiàn)象，微觀上為細(xì)胞壁微絲排列由緊密有序變得松散無序。盧映潔等[4]研究了帶殼鮮花生在熱風(fēng)干燥過程中內(nèi)部水分遷移情況以及花生仁和花生殼的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，花生在干燥過程中內(nèi)部水分逐漸向外遷移，花生內(nèi)部弱結(jié)合水含量不斷減少且干燥會使花生殼與花生仁的結(jié)構(gòu)變形。

由于生物組織具有一定的體積，在水勢梯度驅(qū)動下，靠近組織表面的細(xì)胞水分最容易蒸發(fā)，而組織中心的水分需由中心向外擴(kuò)散至表面蒸發(fā)。因此，脫水過程中，從組織中心至表面這一水分遷移路徑中的不同位置的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯差異。此外，物料的結(jié)構(gòu)、成分及干燥條件也會影響脫水過程中水分遷移路徑[5]。廉苗苗等[6]對獼猴桃進(jìn)行脫水實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，獼猴桃中心和邊緣部分的細(xì)胞大小差異顯著，影響了水分在中心和邊緣部分的遷移。H.C.P.Karunasena等[7]對新鮮的gala蘋果細(xì)胞組織研究發(fā)現(xiàn)，干燥初始階段食物材料表面水分主要從材料表面快速蒸發(fā)，內(nèi)部水分傾向于向外表面擴(kuò)散，并隨著熱氣流蒸發(fā)。楊興勝[8]構(gòu)建了蘋果組織內(nèi)水分遷移微觀模型并進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)微觀模型分析蘋果不同微觀結(jié)構(gòu)內(nèi)的水分遷移規(guī)律，發(fā)現(xiàn)蘋果組織表面失水速率比中心快100～1 000倍。劉顯茜[9]建立了生物多孔材料干燥組織非穩(wěn)態(tài)收縮遞推模型，結(jié)果表明，物料組織收縮并非由外到內(nèi)同步收縮，而是先失去水分的外部先收縮，失水多的外部收縮幅度大于失水少的內(nèi)部，沒有失水的部位不收縮。

目前，有關(guān)水分遷移路徑上細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的文獻(xiàn)較少。本文將蠶豆種子的微觀結(jié)構(gòu)變化用尺寸參數(shù)和形狀參數(shù)進(jìn)行量化，可以看出不同位置的細(xì)胞大小以及形狀變化，分析對比水分遷移路徑上不同位置下的細(xì)胞直徑、周長和面積與上表面組織邊緣細(xì)胞的直徑、周長和面積比值變化，進(jìn)而得出蠶豆種子水分遷移路徑上不同位置細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。對于理解潛在的細(xì)胞機(jī)制、蠶豆種子等生命材料的貯藏及后續(xù)建立干燥過程數(shù)學(xué)和物理模型提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為種植用蠶豆種子，購自天津。樣品在(4±0.5)℃的溫度下避光過夜。第二天進(jìn)行脫水實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將蠶豆手工去皮，切成10 mm×10 mm×5 mm(長×寬×高)的長方體，質(zhì)量為(0.41±0.01) g。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程及樣品制備

圖1所示為蠶豆樣品制備示意圖。本文實(shí)驗(yàn)設(shè)備與文獻(xiàn)[10]真空脫水實(shí)驗(yàn)設(shè)備相同。利用上述實(shí)驗(yàn)設(shè)備，在97 kPa真空度下進(jìn)行兩組脫水實(shí)驗(yàn)，溫度分別為0 ℃和8 ℃，將上述處理的樣品脫水0、30、90、120、180、240、270 min，且每個時間點(diǎn)的樣品獨(dú)立制備。然后將樣品在液氮中冷凍至斷裂獲得用于顯微鏡檢查的新切面。挑選具有相對平坦切面的樣品，使用掃描電鏡(SEM，SH-5000M，日本)分別觀察研究脫水過程中的S、A、B、C、D、E處的微觀結(jié)構(gòu)的變化。掃描電鏡下觀察到的切片位置為切片縱切面由上至下平均分成5份后取得每一份中間位置面積相等的方形A、B、C、D、E及由上表面中心位置取得的與A、B、C、D、E面積相等的方形S。由圖1可知，S、A、E位置處為組織邊緣，其中S位置處為上表面組織邊緣；B、C、D位置處為組織內(nèi)部，其中C為樣品中心、組織中心。掃描電鏡下觀察到的切片的呈現(xiàn)方式為面積相等的蠶豆細(xì)胞和組織二維圖。

圖1 切片樣品制備

1.3 圖像處理分析

在本實(shí)驗(yàn)中，采用1.2節(jié)的方法獲取不同溫度下各階段S、A、B、C、D、E處的SEM圖像，每個工況下可獲得約 200 張顯微圖像。使用Image-Pro Plus6.0軟件對獲得的圖像進(jìn)行中值濾波、調(diào)整對比度與 γ 值、劃分子區(qū)域、二值化與邊界識別[7,10-11]，使用每個SEM圖像中可用的刻度將其轉(zhuǎn)換為實(shí)際尺寸。同樣得到直徑、周長、圓度和伸長率。對于每張給定組織樣品的SEM圖像，所有的子區(qū)域進(jìn)行相同處理，得到所有數(shù)據(jù)后利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最后得到S、A、B、C、D、E處整體的具有代表性的平均細(xì)胞直徑、周長、面積，圓度及伸長率。每種情況下(每個時間點(diǎn))，可統(tǒng)計(jì)150～200個細(xì)胞。

2 參數(shù)確定

為了更好地了解水分遷移路徑上不同位置細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，以t時刻S位置處的細(xì)胞平均值為基準(zhǔn)，將細(xì)胞參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。這種數(shù)據(jù)處理方法可以簡化數(shù)值而且可以更加清晰地觀察A、B、C、D、E位置處細(xì)胞與S位置處細(xì)胞的相對大小變化。

(1)

式中：D為t時刻下A、B、C、D、E相對應(yīng)位置的細(xì)胞平均直徑，μm；D0為t時刻下S處細(xì)胞平均直徑，μm。

(2)

式中：P為t時刻下A、B、C、D，E相對應(yīng)位置的細(xì)胞平均周長，μm；P0為t時刻下S處細(xì)胞平均周長，μm。

(3)

式中：A為t時刻下A、B、C、D，E相對應(yīng)位置的細(xì)胞平均面積，μm2；A0為t時刻下S處細(xì)胞平均面積，μm2。

圓度：選擇圓度(R)作為形態(tài)變化指標(biāo)，表征細(xì)胞形狀的變化。R=1代表圓形，且R越小說明偏離圓的程度越大[12-13]。圓度可按式(4)計(jì)算：

(4)

式中：AP為細(xì)胞面積，μm2；Pi為細(xì)胞周長，μm。

伸長率：

(5)

3 結(jié)果與分析

SEM掃描圖像可以直觀地研究不同位置下的蠶豆細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)，0 ℃時在電子掃描顯微鏡 200倍成像情況下得到脫水60 min不同位置的蠶豆樣品SEM圖像，如圖2所示?？芍煌恢孟碌募?xì)胞形態(tài)大小差異顯著。在所有樣品中，S位置的細(xì)胞最小，D位置的細(xì)胞最大。C、D、E位置的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均勻，具有光滑的細(xì)胞壁且無明顯的收縮跡象。而S位置處的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不均勻，觀察到嚴(yán)重的折疊和收縮跡象。A、B位置觀察到較小的折疊和收縮跡象。這主要是由于S位置處的細(xì)胞最容易失水且最先失水，組織內(nèi)部的細(xì)胞不容易失水。

圖3(a)所示為 0 ℃時不同位置的細(xì)胞相對直徑變化。由圖3(a)可知，新鮮樣品(0 min)時，不同位置細(xì)胞直徑相對變化量無規(guī)律性，說明新鮮樣品各位置上細(xì)胞直徑隨機(jī)分布。與0 min時顯著不同，隨著脫水進(jìn)行細(xì)胞直徑相對變化量呈明顯的規(guī)律性。120 min之前，細(xì)胞相對直徑變化量隨樣品深度的增加先增加后減小。說明同時刻下細(xì)胞內(nèi)部各處細(xì)胞直徑高于邊緣細(xì)胞，D位置處細(xì)胞具有最大直徑。這是由于：樣品邊緣(S位置)的細(xì)胞最容易向外界環(huán)境失水并產(chǎn)生嚴(yán)重收縮，而內(nèi)部(B、C、D位置)水分要跨越細(xì)胞和細(xì)胞間隙才能流至細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)。E位置直接與反應(yīng)釜底面接觸，影響了底面細(xì)胞水分的直接蒸發(fā)，導(dǎo)致D位置水分最不易流出。在120 min時，雖然仍呈現(xiàn)出中心細(xì)胞直徑遠(yuǎn)大于邊緣細(xì)胞的情況，但D位置細(xì)胞相對變化量與C位置接近。說明90～120 min時間內(nèi)C位置處的細(xì)胞比D位置處的細(xì)胞經(jīng)歷了更大程度的失水及收縮。180 min的曲線相對平緩，但仍出現(xiàn)組織內(nèi)部細(xì)胞相對直徑變化量大于邊緣細(xì)胞的情況。這種現(xiàn)象是由于樣品內(nèi)部的溶質(zhì)分子隨水分不斷向表面遷移，積累在表面形成結(jié)晶，從而造成表面硬化。產(chǎn)品表面硬化產(chǎn)生以后，水分移動的毛細(xì)管斷裂，水分移動受阻，導(dǎo)致邊緣細(xì)胞水分變化不大。此時，由于細(xì)胞內(nèi)部也逐漸趨于脫水平衡，內(nèi)部細(xì)胞直徑略大于邊緣細(xì)胞直徑。0～60 min，各個位置的相對直徑變化量不斷增加，說明內(nèi)部細(xì)胞直徑和上表面組織邊緣細(xì)胞直徑差距不斷增大。60 min后，組織內(nèi)部細(xì)胞直徑和上表面組織邊緣細(xì)胞直徑差距逐漸縮小。這是因?yàn)?～60 min時上表面組織邊緣大量失水，細(xì)胞收縮，上表面組織邊緣細(xì)胞直徑逐漸變小。組織內(nèi)部剛開始失去自由水不發(fā)生收縮，內(nèi)部細(xì)胞直徑無顯著變化。二者的相對直徑變化量增加。60 min后，上表面組織邊緣細(xì)胞已經(jīng)失去大量結(jié)合水，水分含量較低，細(xì)胞直徑不再發(fā)生劇烈變化。組織內(nèi)部細(xì)胞失去結(jié)合水后收縮，內(nèi)部細(xì)胞直徑逐漸縮小，二者的相對直徑變化量減小。

圖3 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞相對直徑

圖3(b)所示為8 ℃時不同位置的細(xì)胞相對直徑變化。對比圖3(a)和(b)可知，不同位置處的細(xì)胞直徑變化量均呈先增加后減小的趨勢，但8 ℃時同一時刻下各個位置的相對直徑變化量小于0 ℃時的，此規(guī)律在最大相對直徑變化量上體現(xiàn)的更顯著。8 ℃脫水時，在C位置處呈現(xiàn)最大相對變化量。說明同一時刻，C位置處細(xì)胞的直徑高于其他位置細(xì)胞，是因?yàn)闇囟葘λ诌w移有積極影響。在更高的溫度下，水分子的運(yùn)動增加導(dǎo)致更高的水分?jǐn)U散率，內(nèi)部水分向外擴(kuò)散[14]。此時溫度對于水分遷移的積極影響可以抵消E位置處直接接觸的消極影響。與圖3(a)不同的是圖3(b)中顯示90 min后細(xì)胞的相對直徑變化量出現(xiàn)上升趨勢。這是由于溫度升高，細(xì)胞發(fā)生破裂融合的比例上升，使所測量細(xì)胞直徑增加[10,15]。

圖4所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細(xì)胞相對周長變化。圖5所示為0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞相對面積變化。

圖4 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞相對周長

圖5 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞相對面積

脫水過程中相同溫度下不同位置的細(xì)胞相對直徑、相對周長、相對面積的變化趨勢一致。由圖可知，30～180 min邊緣細(xì)胞和內(nèi)部細(xì)胞的尺寸差距較大，180 min時尺寸差距顯著減小。相對直徑變化與相對周長變化的范圍在-0.1～0.9之間，相對面積變化范圍在-0.2～2.4之間。表明脫水過程中不同位置下的細(xì)胞相對面積的變化要遠(yuǎn)大于細(xì)胞相對直徑與相對周長的變化。這可能是因?yàn)榧?xì)胞面積的變化更能夠體現(xiàn)出細(xì)胞體積的變化。因此本文專門針對絕對面積進(jìn)行分析。

通過對比分析圖3～圖5可知，溫度對不同位置的細(xì)胞尺寸參數(shù)的變化有影響。這是因?yàn)檩^高的溫度可以增加空氣和樣品之間的熱傳遞，并加速水的遷移[16]。0～30 min，溫度越高，各個位置的尺寸參數(shù)變化越大。這種現(xiàn)象是因?yàn)闇囟饶芙档退炙艿降氖`力[17]，導(dǎo)致水分逐漸散失且內(nèi)部水分逐漸向外遷移，促進(jìn)細(xì)胞的收縮變形。相同溫度下的細(xì)胞相對直徑最大變化量、細(xì)胞相對周長最大變化量以及細(xì)胞相對面積最大變化量均在同一位置取得。0 ℃時最大相對變化量呈現(xiàn)在D位置處。8 ℃時最大相對變化量呈現(xiàn)在C位置處。

圖6(a)所示為0 ℃時不同位置下的細(xì)胞面積。30～120 min時，同一時刻下隨著樣品位置距離的增加，細(xì)胞面積由S位置處的4 000～7 500 μm2升至D位置處的13 000～16 000 μm2然后降至E位置處的10 000～11 000 μm2。即細(xì)胞面積隨厚度增加先增加后減小，在D位置處取得最大值。說明相同溫度相同時刻下不同位置的細(xì)胞面積不同，組織邊緣細(xì)胞的面積小于組織內(nèi)部的，上組織邊緣的細(xì)胞面積最小。因?yàn)榻M織邊緣細(xì)胞先于組織中心細(xì)胞失水且發(fā)生收縮，收縮使得細(xì)胞壁發(fā)生折疊，細(xì)胞面積減小。E位置直接和反應(yīng)釜底面接觸減小了其表面擴(kuò)散系數(shù)，導(dǎo)致底面細(xì)胞水分的蒸發(fā)減少致使D位置水分最不易流出，發(fā)生收縮程度小，面積比其他位置大。180 min時不同位置下的細(xì)胞面積集中在5 000～7 500 μm2之間，差異較小，說明完全脫水后，不同位置的細(xì)胞面積并未產(chǎn)生顯著差異。這主要是因?yàn)槊撍M(jìn)行到后期組織邊緣與組織內(nèi)部的細(xì)胞結(jié)合水大量流出，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷使各個位置的細(xì)胞面積大小均勻，無明顯差異。由圖可知D位置的面積具有明顯的增減變化。30～60 min，由15 000 μm2降至13 493 μm2；60～120 min，由13 493 μm2增至15 938 μm2最后到達(dá)16 126 μm2，這兩個階段主要與細(xì)胞膨壓損失和細(xì)胞壁張力有關(guān)。第一個階段隨著脫水的進(jìn)行，膨壓趨于降低，細(xì)胞壁拉伸程度減小，整個細(xì)胞尺寸減小。大氣對細(xì)胞有一個顯著的正膨脹壓力，使細(xì)胞形狀保持橢圓形。然而。由于脫水的影響，細(xì)胞壁收縮，這有助于減小單個細(xì)胞的面積。第二個階段細(xì)胞壁張力減小，并且經(jīng)歷較高程度的翹曲和起皺，以適應(yīng)較低的細(xì)胞流體體積，細(xì)胞面積增加。

圖6 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞面積

圖6(b)所示為8 ℃時不同位置下的細(xì)胞面積。對比圖6(a)和(b)可知，180 min時二者細(xì)胞面積范圍分別為5 000～7 000 μm2以及3 000～5 000 μm2。說明8 ℃下的面積變化大于0 ℃下的面積變化。即較高的溫度會導(dǎo)致面積減少速率增大。這主要是由于膨壓、細(xì)胞壁收縮和組織結(jié)構(gòu)塌陷等快速變化。

圖7所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細(xì)胞圓度。0 ℃時0～180 min，細(xì)胞圓度分布在0.85～0.95。8 ℃ 時0～120 min，細(xì)胞圓度分布在0.80～0.90。這與P. P. Lewicki等[13]認(rèn)為植物細(xì)胞最常見圓度值為0.84和H. R. Bolin等[18]在Granny Smith蘋果的顯微結(jié)構(gòu)表征中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的圓度值為0.82相符。這些數(shù)據(jù)表明植物細(xì)胞的形狀接近于橢圓形。圖7(a)中240 min時細(xì)胞圓度顯著降低說明細(xì)胞偏離圓的程度較大，細(xì)胞形狀變形較大可能由于膨壓損失以及細(xì)胞間隙不規(guī)則性的快速增加。相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]曾報道細(xì)胞間隙會影響細(xì)胞形狀的變化。中心細(xì)胞的圓度遠(yuǎn)大于其他位置，說明細(xì)胞變形是廣泛的和不規(guī)則、不均勻的。孔隙的產(chǎn)生會使形狀更加不規(guī)則，變形更明顯。此階段中心細(xì)胞的孔隙比其他位置的孔隙少，因此中心細(xì)胞變形較小。對比組織的圓度值可知，最后所得樣品的圓度值略小于新鮮樣品的圓度值，這與文獻(xiàn)[21-22]報道的趨勢相似。圖7(b)中180 min時細(xì)胞圓度顯著降低且中心細(xì)胞的圓度遠(yuǎn)大于其他位置，與圖7(a)相比，細(xì)胞圓度在更短的時間內(nèi)有更明顯的下降。說明脫水溫度會影響細(xì)胞圓度的變化趨勢。溫度越高，細(xì)胞圓度減少越明顯，可能與溫度加快水分遷移進(jìn)程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)高度變形以及細(xì)胞骨架坍塌有關(guān)。

圖8所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細(xì)胞伸長率變化。由圖8(a)可知0 ℃時脫水過程中不同時刻的細(xì)胞最大伸長率在D位置處出現(xiàn)，說明此時主軸長大于次軸長。而8 ℃時無明顯規(guī)律，但30 min時細(xì)胞的伸長率有顯著的減小。對比圖8(a)和(b)可知，0 ℃時細(xì)胞伸長率集中分布在1.2～1.8，8 ℃時細(xì)胞伸長率集中分布在1.2～1.9。8 ℃時曲線波動的幅度更大。即脫水溫度會影響細(xì)胞的伸長率，溫度較高時，曲線波動略大，文獻(xiàn)[7]中也觀察到相似的伸長率趨勢。8 ℃時的細(xì)胞圓度與伸長率比0 ℃時的分布范圍更廣，說明8 ℃時細(xì)胞經(jīng)歷了更大的收縮。然而分析尺寸參數(shù)時0 ℃不同位置下的相對變量遠(yuǎn)大于8 ℃下的相對變量，可知8 ℃時脫水過程中細(xì)胞形狀整體變化趨勢更均勻一致。這是因?yàn)樵谳^低的溫度下，樣品需要更多的時間從材料中去除水分，導(dǎo)致樣品的整體變化比在高溫下處理的樣品更不均勻一致[23]。

圖8 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細(xì)胞伸長率

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對蠶豆種子細(xì)胞進(jìn)行數(shù)形分析，以研究水分遷移路上不同位置的細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，得到以下結(jié)論：

1)脫水過程中，與尺寸直接相關(guān)的細(xì)胞參數(shù)(相對直徑、相對周長、相對面積以及面積)有顯著的變化分布規(guī)律。細(xì)胞相對直徑、相對周長以及相對面積的變化趨勢一致，但相對面積變化更大。對面積而言，組織邊緣細(xì)胞的面積小于組織內(nèi)部的，上組織邊緣細(xì)胞的面積最小。與細(xì)胞形狀相關(guān)的參數(shù)(伸長率、圓度)隨機(jī)分布在一個范圍內(nèi)，未觀察到顯著的規(guī)律性變化。0 ℃時，細(xì)胞圓度大體分布在0.85～0.95，細(xì)胞伸長率集中分布在1.2～1.8。8 ℃ 時，細(xì)胞圓度大體分布在0.80～0.90，細(xì)胞伸長率集中分布在1.2～1.9。

2)脫水溫度會影響尺寸參數(shù)以及形狀參數(shù)的變化。0～30 min，溫度越高，各個位置的尺寸參數(shù)變化越大。0 ℃時最大尺寸參數(shù)變化量呈現(xiàn)在D位置處。8 ℃時最大尺寸參數(shù)變化量呈現(xiàn)在C位置處。與0 ℃相比，脫水過程中8 ℃時的細(xì)胞經(jīng)歷了更大的收縮，細(xì)胞形狀整體變化趨勢更均勻一致。