石 悅，劉拴成，房永雨，丁海君，呂二鎖，路玉紅

（1.集寧師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古集寧 012000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.敖漢旗四家子鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古四家子 024300）

高丹草是高粱與蘇丹草的種間雜交品種，分蘗多、產(chǎn)草量高、抗逆性和適應(yīng)性強、適口性好、再生能力強，可多次刈割飼喂家畜[1-2]，飼用價值和生態(tài)價值高。近年來，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牧草遺傳性狀差異分析、圖譜構(gòu)建及相關(guān)性狀QTL 定位和新品種選育研究，如RAPD[3]、SSR[4-5]、EST-SSR[6]、ISSR[7]、AFLP[8]、SRAP[9]等分子標(biāo)記技術(shù)均有報道。關(guān)于高丹草分子標(biāo)記體系優(yōu)化的研究報道，李杰勤等[3]研究不同因素水平（Mg2+、退火溫度和Taq 酶含量）對蘇丹草RAPD 反應(yīng)體系進行PCR 擴增，確定蘇丹草RAPD 反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。溫瑩等[6]選取14 對引物，對50 份高丹草、3 份蘇丹草和7 份高粱進行EST-SSR 擴增，并根據(jù)擴增結(jié)果進行聚類分析。

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)（sequence -related amplified polymorphism）是由LI 等[10]提出的一種利用特殊引物設(shè)計對開放閱讀框架（ORFs）進行多態(tài)性擴增的新分子標(biāo)記技術(shù)，其多態(tài)性是由不同作物的啟動子和內(nèi)含子與間隔區(qū)域長度不同產(chǎn)生的。SRAP 分子標(biāo)記具有試驗操作簡便、共顯性強、擴增結(jié)果穩(wěn)定、正向和反向引物可通過自由組合形成引物對而降低合成引物費用等優(yōu)點。目前，SRAP-PCR分子標(biāo)記的擴增體系已應(yīng)用于多種作物，如馬鈴薯[11]、結(jié)縷草屬植物[12]、石斛屬植物[13]等，但迄今還未見關(guān)于高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化和引物篩選的研究報道。

本試驗以高丹草基因組DNA 為模板，采用單因素水平和正交試驗設(shè)計相結(jié)合的方法，對SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個因素（dNTP、DNA、引物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+）進行試驗體系優(yōu)化和適宜引物篩選，旨在建立適合高丹草SRAR-PCR 的最佳反應(yīng)體系，從而為高丹草遺傳差異分析、新品種選育、遺傳作圖及相關(guān)性狀QTL 精細(xì)定位等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為蒙農(nóng)9 號高丹草（散穗高粱×紅殼蘇丹草）部分單株，種植于集寧師范學(xué)院植物園試驗基地。

1.2 基因組DNA 提取

拔節(jié)期剪取高丹草幼嫩葉片裝入塑封袋，放入冰盒帶回實驗室，將葉片剪碎稱取1.0 g，用植物基因組試劑盒提取樣品DNA，檢測基因組DNA 的純度（1.4%瓊脂糖凝膠電泳），并將DNA 稀釋至50 ng/μL，于-80 ℃冰箱備用。

1.3 SRAP 引物來源及程序

SRAP 引物采用LI 等[10]報道的引物序列，正向引物和反向引物堿基序列見表1。本試驗由6 對正向引物（m2、m4、m5、m9、bm8、bm9）和9 對反向引物（e2、e4、e6、e9、k2、k4、be10、coe7、coe9）隨機組合形成的54 對SRAP 引物序列，委托上海生物工程公司合成。高丹草SRAP-PCR 擴增程序參照李佳奇等[14]基于SRAP 分子標(biāo)記構(gòu)建冰草遺傳圖譜中的程序。

表1 SRAP 引物的堿基序列

1.4 優(yōu)化高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系

1.4.1 SRAP-PCR反應(yīng)體系單因素試驗設(shè)計

以引物m5be10 進行SRAP-PCR 體系優(yōu)化，結(jié)合單因素和正交試驗方法：（1）對高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個因素設(shè)置水平梯度，篩選適宜濃度區(qū)域；（2）利用正交試驗每個因素設(shè)置8 個濃度梯度水平，確定最優(yōu)組合（表2）。優(yōu)化試驗前需做預(yù)試驗，設(shè)定SRAP-PCR反應(yīng)體系各因子參數(shù)為濃度梯度的中間值，分別為：模板DNA 濃度3.0 ng/μL、Mg2+濃度2.50 mmol/L、Taq DNA 聚合酶用量1.00 U、dNTP 濃度200 μmol/L、引物濃度1.0 μmol/L，最后用ddH2O 補足至20 μL。

表2 SRAP-PCR反應(yīng)體系單因素試驗

1.4.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗設(shè)計

試驗以影響高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個因素（dNTP、DNA、引物、Taq DNA 聚合酶和Mg2+）以及利用單因素試驗確定的4 個最優(yōu)濃度梯度水平進行體系篩選（表3），即利用L16（45）正交試驗設(shè)計進行優(yōu)化，每個處理組合重復(fù)3 次。依據(jù)SRAP-PCR反應(yīng)體系擴增產(chǎn)物的電泳條帶數(shù)目、多態(tài)性情況、電泳結(jié)果清晰程度、是否有雜帶等，對16 個試驗組合進行評定打分[15-16]。以擴增條帶多態(tài)性豐富且清晰為最高分（16 分），條帶數(shù)少且模糊不清為最低分（1 分），其余組合按照這個標(biāo)準(zhǔn)劃分為2～15 分。

表3 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計

1.5 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化驗證

以雙親基因組DNA 作為對照，對高丹草基因組DNA 進行SRAP-PCR反應(yīng)體系擴增，依據(jù)表1 列出的引物進行自由組合，以bm8e6、m4e9、bm9e4、m5e9、m9e9、m9e2、m9e4 和m9k4 引物對進一步驗證上述優(yōu)化反應(yīng)體系的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料DNA 純度和濃度檢測

采用植物基因組試劑盒提取高丹草幼嫩葉片DNA，經(jīng)純度電泳檢測結(jié)果顯示，DNA 純度較高、條帶清晰、無降解、無雜質(zhì)、質(zhì)量好；用紫外分光光度計測定各供試材料的DNA，濃度為50 ng/μL，經(jīng)電泳檢測條帶清晰、純度高，可用于SRAP-PCR 擴增（圖1）。

圖1 試驗材料DNA 電泳檢測結(jié)果

2.2 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 dNTP 濃度對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

SRAP-PCR 延伸過程中，dNTP 主要影響DNA模板鏈的形成，其濃度高低可影響PCR 擴增效果的準(zhǔn)確性、條帶數(shù)量、特異性、聚合酶的活性。在其他因素不變的條件下，dNTP 濃度梯度由圖2a 可知，隨著dNTP 濃度的逐漸增加，在濃度為250 μmol/L 和275 μmol/L 時，擴增條帶最多且清晰穩(wěn)定；當(dāng)濃度增加到300 μmol/L 時，條帶清晰但數(shù)量有所減少，因此正交試驗選用的dNTP 濃度為200～275 μmol/L 。

2.2.2 DNA 濃度對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

DNA 作為SRAP-PCR反應(yīng)體系模板，其純度（有無降解和其他雜質(zhì)污染等情況）和濃度大小影響擴增結(jié)果。試驗對模板DNA 設(shè)置8 個濃度梯度（0.5～4.0 ng/μL）。由圖2b 可知，DNA 濃度為0.5 ng/μL 時，背景模糊不清、條帶數(shù)量最少且多態(tài)性效果差；當(dāng)SRAP-PCR 體系體積為20 μL，DNA 濃度在1.0～3.5 ng/μL 時，高丹草電泳條帶數(shù)目有所增加、分布范圍廣（100～1 500 bp）、背景清晰；綜合電泳擴增效果，正交試驗確定模板DNA 濃度為2.0～3.5 ng/μL。

2.2.3 引物濃度對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

引物濃度對于SRAP-PCR反應(yīng)體系擴增效率起著主要作用，過高或過低都會增加引物與模板DNA 的錯配率，導(dǎo)致條帶特異性差。由圖2c 可知，引物濃度太低，如0.6 μmol/L 和0.7 μmol/L 時，PCR 擴增條帶數(shù)少且不清晰；濃度過高，如1.2 μmol/L和1.3 μmol/L 時，條帶模糊且數(shù)量減少，試驗效果不好；引物濃度在0.8～1.1 μmol/L 時，隨著濃度增加擴增條帶豐富且清晰，因此正交試驗選用的引物濃度為0.8～1.1 μmol/L。

2.2.4 Taq DNA 聚合酶用量對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

Taq DNA 聚合酶在SRAP-PCR 擴增試驗中起到直接影響作用。以DNA 為模板合成新鏈時，Taq DNA聚合酶起到了關(guān)鍵作用，濃度過高會產(chǎn)生非特異性擴增，濃度過低擴增條帶數(shù)少且效果差。由圖2d 可知，Taq DNA 聚合酶用量為0.50 U 時，條帶背景模糊、條帶數(shù)少；Taq DNA 聚合酶用量為2.00 U 和2.25 U時，條帶數(shù)雖然多但不清晰，Taq DNA 聚合酶用量影響PCR 擴增效果；Taq DNA 聚合酶用量在0.75～1.50 U時，擴增產(chǎn)物條帶豐富且清晰穩(wěn)定，因此正交試驗選用的Taq DNA 聚合酶用量為0.75～1.50 U。

圖2 不同濃度水平高丹草單因素的SRAP-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.5 Mg2+濃度對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

Mg2+濃度會在一定程度上影響Taq DNA 聚合酶活性，導(dǎo)致引物、模板DNA、dNTPs 產(chǎn)生結(jié)合現(xiàn)象。由2e 可知，Mg2+濃度在1.25～2.00 mmol/L 時，擴增產(chǎn)物條帶少、背景模糊、效果差；Mg2+濃度在2.25～3.00 mmol/L時，擴增產(chǎn)物條帶豐富且清晰穩(wěn)定，因此正交試驗選用的Mg2+濃度為2.25～3.00 mmol/L。

2.3 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗結(jié)果分析

高丹草SRAP-PCR 正交試驗擴增結(jié)果見圖3。由圖3 可知，處理組合5、14、16 中擴增電泳條帶數(shù)目最少（2～4 條）、多態(tài)性差、擴增效果差；處理組合1、3、4、7、8、10、11、15 電泳條帶分布范圍小、數(shù)目較少、有缺條帶且背景較模糊；2、6、9、12、13 處理組合的電泳條帶數(shù)目多、多態(tài)性豐富、分布范圍廣（100～1 500 bp），且背景清晰、擴增效果較好；對SRAP-PCR反應(yīng)體系試驗擴增結(jié)果進行直觀分析和評定打分，確定處理組合13 為高丹草SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，具體為：275 μmol/L dNTP、3.0 ng/μL DNA、1.1 μmol/L 引物、1.00 U Taq DNA 聚合酶和2.25 mmol/L Mg2+，用ddH2O 補至20 μL。

圖3 高丹草SRAP-PCR 正交試驗擴增結(jié)果

試驗對5 個因素（3 次重復(fù)）水平進行極差分析，k值表示在SRAP-PCR反應(yīng)體系中各因素同一水平下產(chǎn)生條帶數(shù)的平均值，其數(shù)值越大擴增效果越好；R值是指高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系中同一因素在不同水平下的極差，即R值越大，對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度越大。高丹草SRAP-PCR 正交試驗統(tǒng)計結(jié)果（表4）表明，各因素對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度為：DNA 濃度＞Taq DNA 聚合酶用量＞dNTP 濃度＞引物濃度＞Mg2+濃度。

表4 正交試驗設(shè)計結(jié)果的統(tǒng)計分析

2.4 高丹草SRAP-PCR優(yōu)化體系的驗證

選用篩選出的SRAP-PCR 最佳體系對高丹草雙親和3 個單株基因組DNA 進行體系擴增重復(fù)驗證。由圖4 可知，8 對SRAP 引物組合擴增出的電泳條帶數(shù)目多、背景清晰無雜帶、分布范圍廣、多態(tài)性豐富且穩(wěn)定，證明該擴增體系效果和重復(fù)性好、可靠性高，可用于高丹草SRAP-PCR 擴增。

圖4 高丹草SRAP-PCR 的最佳體系驗證

3 討論

篩選適宜的引物組合和穩(wěn)定擴增效果清晰的SRAP-PCR反應(yīng)體系可用于SRAP 分子標(biāo)記多態(tài)性的研究[17-18]。單因素和正交試驗設(shè)計具有操作簡便、均衡分散、可包含多種處理組合、整齊可比等優(yōu)點，能夠體現(xiàn)不同因素水平的相互影響[19]。

本試驗結(jié)合單因素和正交試驗設(shè)計對高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系中5 個主要因素進行優(yōu)化，篩選出高丹草最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系。高丹草SRAP-PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖的條帶數(shù)量和清晰度由于各因素對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度明顯不同，依次為DNA 濃度＞Taq DNA 聚合酶用量＞dNTP 濃度＞引物濃度＞Mg2+濃度。正交試驗結(jié)果表明，對高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系影響最大的是模板DNA 濃度，其次為Taq DNA 聚合酶用量，Taq DNA 聚合酶作為PCR反應(yīng)的催化劑，可直接影響擴增條帶的數(shù)目和清晰度。蘇輝等[20]研究表明，DNA 模板用量是優(yōu)化大豆SSR-PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵因素；于肖夏等[21]研究表明，dNTP 濃度對冰草屬SSR-PCR反應(yīng)體系影響最大；賈新平等[22]利用SSR-PCR反應(yīng)體系在二月蘭研究中得出，影響最大的是Taq DNA 聚合酶用量，其次為Mg2+濃度；戚華沙等[23]以海南油茶植物組DNA 為模板，進行SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，結(jié)果表明，引物濃度對其擴增效果影響最大，其次為dNTPs，并采用優(yōu)化后的體系進行引物篩選獲得清晰穩(wěn)定和多態(tài)性豐富的32 對引物；梁芳瑜等[24]建立寬葉纈草的SRAP-PCR反應(yīng)體系，正交試驗表明，影響其擴增效果最大的為TaqMix 用量，其次為Taq DNA 聚合酶用量，退火溫度最優(yōu)為36.8 ℃，并采用該最優(yōu)體系篩選多態(tài)性豐富、條帶清晰穩(wěn)定的引物17 對。通過上述文獻研究發(fā)現(xiàn)，不同的物種間，對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響因子有所差別。

4 結(jié)論

本試驗篩選出適合高丹草SRAP-PCR 的最佳反應(yīng)體系，總體積為20 μL，dNTP 濃度275 μmol/L、模板DNA 濃度3.0 ng/μL、引物濃度1.1 μmol/L、Taq DNA 聚合酶用量1.00 U 和Mg2+的濃度2.25 mmol/L，其擴增出的電泳條帶數(shù)目多、背景清晰無雜帶、分布范圍廣，并用8 對SRAP 引物驗證了該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，可為開展高丹草遺傳差異分析、新品種選育研究、遺傳作圖及相關(guān)性狀QTL 精細(xì)定位等研究奠定基礎(chǔ)。