楊婷婷 趙立華 邱潤霜,3 陳 思,3 張 潔 李博文,3 張仲凱 馬長樂

（1. 西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南省高校園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223；3. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233）

本氏煙（Nicotiana benthamiana）與辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanum lycopersicum）均屬于茄科（Solanaceae）植物，其最早流行于澳大利亞，目前在世界各地的實(shí)驗(yàn)室被廣泛栽培[1]。本氏煙作為模式植物用于植物-微生物互作、代謝路徑、疫苗生產(chǎn)、合成生物學(xué)等方面研究，同時因其易受多種植物病毒侵染而廣泛應(yīng)用于病毒的檢測和鑒定、病毒誘導(dǎo)的基因沉默的基因功能驗(yàn)證等方面[2-3]。TSWV（tomato spotted wilt orthotospovirus）是布尼亞病毒目（Bunyavirales）、番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）、正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）的代表種，在經(jīng)濟(jì)學(xué)和科學(xué)研究性上位于世界十大植物病毒的第2位[4]。TSWV在我國西南地區(qū)大量發(fā)生，致使煙草、辣椒以及番茄等經(jīng)濟(jì)作物減產(chǎn)減量，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。本研究通過構(gòu)建NSm、NSs基因沉默載體，為TSWV基因功能及致病機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)材料，并為TSWV田間綠色防控奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)手段。

病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（VIGS）是指一種將目標(biāo)基因片段插入病毒載體并使其感染植物，從而抑制內(nèi)源基因表達(dá)并引起相應(yīng)的生理和表型變化的簡單、快速、高效的評估植物基因功能的方法[8-9]。目前，已發(fā)現(xiàn)幾十種病毒可用作VIGS載體，如馬鈴薯病毒X（PVX）、甘藍(lán)卷葉病毒（CaLCuV）、煙草脆裂病毒（TRV）、煙草花葉病毒（TMV）、豌豆早褐變病毒（PEBV）、水稻東格魯桿狀病毒（RTBV）[10]等，其中一些已經(jīng)成功地應(yīng)用于代謝途徑、植物發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫的基因功能研究中。研究發(fā)現(xiàn)用TRV載體沉默番茄MYB80基因、本氏煙中的高鐵還原酶基因FRO1以及南非醉茄（Withania somnifera）中MVA、MEP途徑的相關(guān)基因能顯著增強(qiáng)植物對脅迫的抗性和生長能力[11-13]。VIGS技術(shù)已應(yīng)用于植物病毒的防控方面，如沉默甜椒脂氧合酶基因CaLOX2，發(fā)現(xiàn)該基因介導(dǎo)了依賴于茉莉酸（JA）的信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致植株對薊馬產(chǎn)生抗性[14]；將番茄中乙烯信號通路負(fù)調(diào)控基因LeCTR1沉默，可明顯減弱活性氧（ROS）的積累和葉片卷曲癥狀，增強(qiáng)植株對印度東部的番茄曲葉病毒（ToLCJoV）的耐受性[15]；沉默本氏煙分子伴侶NbSGT1基因，可強(qiáng)烈抑制TSWV的NSm細(xì)胞間的移動，進(jìn)而抑制TSWV對本氏煙的侵染[16]。與其他VIGS載體相比，TRV能較溫和地侵染植株，并且它可以迅速蔓延到整個植物的多種組織和器官，包括葉片、花、根和果實(shí)以及分生組織[17-19]，且TRV是一種宿主范圍廣泛的RNA病毒，包括本氏煙、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄、辣椒、小麥（Triticum aestivum）、玫瑰（Rosa rugosa）、棉花（Gossypiumspp.）等[18,20-24]。

NSm和NSs是TSWV的非結(jié)構(gòu)蛋白，NSm為病毒的移動蛋白，輔助病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間運(yùn)動；NSs為病毒沉默抑制子，通過應(yīng)對植物RNA沉默防御輔助病毒的侵染[25-26]。但目前TSWV非結(jié)構(gòu)蛋白NSm和NSs對病毒系統(tǒng)侵染及誘導(dǎo)囊泡的機(jī)制方面尚不清楚。本研究將TSWV的NSm、NSs基因構(gòu)建到載體pTRV-PTV00上，通過實(shí)時熒光定量PCR定量分析抗TSWV的沉默效率，構(gòu)建TSWV的NSm、NSs基因沉默載體，這為研究NSm、NSs基因在病毒致病機(jī)制方面提供了前期材料和有力依據(jù)，為研究與TSWV復(fù)制、裝配密切相關(guān)的囊泡的產(chǎn)生機(jī)制提供材料，為實(shí)現(xiàn)田間正番茄斑萎病毒屬病毒病的綠色防控提供新的方法。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本氏煙種子、TSWV毒源由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所植物病毒課題組保存提供；含有PDS基因菌株、PTV00空載體菌株、PBINTRA載體的菌株、GV3101菌株均有昆明植物研究所吳建強(qiáng)課題組提供。NSm和NSs基因PCR引物根據(jù)GenBank中TSWV己知基因序列（JF960236.1、JF960235.1）設(shè)計(jì)，引物序列見（表1），由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

表 1 實(shí)驗(yàn)中采用的引物及序列Table 1 Sequence of the primers used in this study

1.2 TSWV NSm和NSs的VIGS載體構(gòu)建

按照說明書（Trans）從接種TSWV并具有TSWV癥狀的煙草葉片中提取總RNA，應(yīng)用cDNA第1鏈合成試劑盒（Trans）合成cDNA，利用Q5超保真DNA聚合酶（NEB）進(jìn)行NSm和NSs序列擴(kuò)增，反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 40 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸 2 min。將目的基因片段連接到Blunt-Zero（Trans）載體上，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen）提取質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII同時對該質(zhì)粒和pTRV-PTV00質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將目的基因與pTRV-PTV00載體在16 ℃下過夜連接，并于42 ℃熱擊30 s轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（Escherichia. coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過菌落PCR鑒定獲得陽性克隆后，送至廣州華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)序列比對分析，測序正確者則為pTRVPTV00-NSm、pTRV-PTV00-NSs重組載體。

1.3 農(nóng)桿菌注射

將重組質(zhì)粒pTRV-PTV00-NSm、pTRVPTV00-NSs通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，在卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子，PCR 鑒定呈陽性的克隆菌液即為 pTRV-PTV00-NSm、pTRVPTV00-NSm 根癌農(nóng)桿菌菌液。

本實(shí)驗(yàn)采用先注射菌液后接種TSWV的處理方式。用滲透緩沖液10 mmol/LMES和MgCl2重懸菌液，取pTRV-PTV00-NSm、pTRV-PTV00-NSs菌重懸液分別與pTRV-PBINTRA（轉(zhuǎn)化pBINTRA質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌株）菌重懸液按1:1體積充分混勻，使用1 mL注射器注射侵染于生長適合的本氏煙葉片。以注射pTRV-PDS（轉(zhuǎn)化 PDS 質(zhì)粒的 GV3101 農(nóng)桿菌菌株）菌液為陽性對照，以注射pTRV-PTV00（轉(zhuǎn)化 PTV00 質(zhì)粒的 GV3101 農(nóng)桿菌菌株）菌液為空白對照，每組10株，3次重復(fù)。待注射pTRV-PTV00-PDS植株10～15 d后心葉開始褪綠、發(fā)白，則開始接種TSWV。接種7～10 d后，未注射任何菌液、只接種TSWV的植株出現(xiàn)TSWV發(fā)病癥狀，采樣進(jìn)行沉默效率檢測。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測NSm、NSs基因的沉默效率

將TSMVQ、TSNSsQ擴(kuò)增片段構(gòu)建到pMD 18-T載體上，并將其陽性質(zhì)粒連續(xù)稀釋為具有10倍濃度梯度（10-1～10-6）的質(zhì)粒為實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取所采樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，再根據(jù)KAPA SYBR?FAST qPCR Kit Master Mix（2×）試 劑 盒 進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3分鐘，95 ℃變性5秒，57 ℃ 退火30 秒，72 ℃ 延伸30 秒，40個循環(huán)。

式中：C為只接種TSWV的植株葉片目的基因基因拷貝數(shù)的平均值；T為注射沉默載體的植株葉片TSWV 目的基因拷貝數(shù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSWV NSm和NSs的VIGS載體構(gòu)建結(jié)果分析

采集接種TSWV 病毒7～10 d后有明顯癥狀的本氏煙系統(tǒng)葉（接種葉上一葉），提取葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為模板cDNA，用TSVMF1/TSVMR1、TSVNSsF1/ TSVNSsR1特異性引物擴(kuò)增含HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)的NSm、NSs基因片段。用1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在100～200 bp處出現(xiàn)條帶清晰且單一的特異性條帶（圖1），符合預(yù)期結(jié)果。將目的條帶純化回收后并連接至Blunt-Zero載體，菌落PCR驗(yàn)證同樣獲得相同大小片段，送至公司測序，經(jīng)過軟件SnapGene序列比對結(jié)果顯示成功獲得158 bpNSm、150 bpNSs片段。將質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證（圖2）后與pTRV-PTV00載體連接，序列分析正確，獲得重組載體。通過電擊法將重組質(zhì)粒pTRV-PTV00-NSm、pTRV-PTV00-NSs轉(zhuǎn)化入GV3101中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證條帶大小正確，成功構(gòu)建TSWV重組病毒VIGS載體pTRV-PTV00-NSm、pTRVPTV00-NSs，可繼續(xù)開展沉默效率的檢測。

圖 1 NSm、NSs基因片段擴(kuò)增Fig. 1 Magnification of NSm, NSs gene

圖 2 NSm、NSs基因片段酶切結(jié)果Fig. 2 Digestion of NSm, NSs gene

2.2 NSm、NSs基因?qū)崟r熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過 特異 引 物TSMVQF1/ TSMVQR1、TSVNSsQF1/ TSVNSsQR1擴(kuò)增得到73 bpNSm、77 bpNSs基因片段，片段大小符合預(yù)期，純化回收后將目的基因片段連接到pMD18-T上，經(jīng)Nano Drop 2000濃度測量儀測得NSm質(zhì)粒濃度為122.286 μg/mL、NSs質(zhì)粒濃度為141.655 μg/mL，分別以10-2～10-6的5個濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，得到標(biāo)椎曲線。NSm與NSs基因標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度之間呈良好的線性關(guān)系，可用于定量分析（圖3）。NSm基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-3.705X+35.261，擴(kuò)增效率為96.162%，相關(guān)系數(shù)為0.999；NSs標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-3.70X+34.165，擴(kuò)增效率為96.309%，相關(guān)系數(shù)為0.999。

圖 3 NSm、NSs基因qRT-PCR標(biāo)椎曲線Fig. 3 Standard curve of NSm, NSs gene by qRT-PCR

2.3 TSWV基因沉默效果

TRV-PDS作為陽性對照，起指示作用，當(dāng)植株P(guān)DS基因沉默后，植株葉片會受到光漂白而褪綠呈現(xiàn)白色（圖4a），而pTRV-PTV00作為陰性對照植株表型則沒有變化（圖4b），表示空載體對植株表型沒有影響。

圖 4 本氏煙中沉默PDS基因Fig. 4 Silencing PDS gene in N. benthamiana

通過先注射載體，待陽性對照PDS沉默植株褪綠呈現(xiàn)白色后接種TSWV，顯癥后采集樣品運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR檢測TSWV的NSm、NSs基因絕對表達(dá)量，結(jié)果顯示NSm基因沉默效率為86.70%，NSs基因沉默效率為92.00%（圖5）。

圖 5 NSm、NSs基因沉默效率Fig. 5 Silencing efficiency of NSm, NSs gene

3 結(jié)論與討論

VIGS技術(shù)已經(jīng)廣泛用于多種植物的目標(biāo)基因功能分析，如病毒防御、植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，但多是沉默宿主植物內(nèi)源基因，對于外源病原菌或病毒則鮮見報(bào)道。TRV是包含2條正鏈的RNA病毒，RNA1編碼復(fù)制酶RdRp、移動蛋白的pTRV1，RNA2編碼外殼蛋白、2個非結(jié)構(gòu)蛋白的pTRV2，并改造為其2個獨(dú)立質(zhì)粒結(jié)構(gòu)（pBINTRA和pTRVPTV00），pTRV1可以不依賴pTRV2，在植物體內(nèi)復(fù)制并系統(tǒng)移動[27]。將pTRV2上的非結(jié)構(gòu)蛋白替換為多克隆位點(diǎn)可用于克隆約2 000～3 000 bp的目標(biāo)基因，但有研究報(bào)道VIGS插入目標(biāo)基因最適長度約為200～1 300 bp[28-29]。本研究將TSWVNSm的157 bp和NSs的150 bp插入pTRV-PTV00載體，經(jīng)浸潤本氏煙，成功將TSWV非結(jié)構(gòu)蛋白沉默。這個插入片段小于之前報(bào)道的，可能是由于插入的是外源基因，這將更有利于片段的擴(kuò)增及減少堿基突變。

植物病毒必須克服重重細(xì)胞屏障，到達(dá)維管組織，才能系統(tǒng)入侵宿主植物[30]。目前研究發(fā)現(xiàn)TSWV的NSm、NSs基因與病毒的系統(tǒng)侵染密切相關(guān)，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究采用先注射后接毒的方式處理本氏煙，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)沉默NSm基因效率為86.7%，沉默NSs基因效率為92%，沉默載體的成功構(gòu)建為TSWV致病機(jī)制的解析提供了技術(shù)手段，本研究選擇TRV作為VIGS載體，可以侵染植物分生組織，且其引起的癥狀較溫和，這將有利于基因沉默表型觀察及提高沉默效率。

TRV-VIGS技術(shù)由于其宿主廣泛、沉默效率高、周期短等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于植物發(fā)育、代謝物的生物合成、生物和非生物脅迫耐受以及植物進(jìn)化的各個方面，本研究也成功沉默TSWV的非結(jié)構(gòu)蛋白。選用本氏煙作為浸潤載體可保證高的轉(zhuǎn)化效率。但仍可能存在沉默脫靶基因、沉默不完全、沉默不一致等缺點(diǎn)，且TRV可能改變植物的代謝或基因表達(dá)，還可能引起相關(guān)表型改變。為解決這些問題，可以增加重復(fù)試驗(yàn)，設(shè)置對照組，改良載體等。本研究通過TSWV非結(jié)構(gòu)蛋白的VIGS載體構(gòu)建，為TSWV非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒致病機(jī)制等方面的解析提供基本材料，為TSWV的綠色防控提供有力新的路徑。

TSWV在我國多省市發(fā)生，嚴(yán)重影響煙草、辣椒以及番茄等經(jīng)濟(jì)作物，甚至造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過pTRV-PTV00載體構(gòu)建NSm、NSs基因沉默載體，沉默效率接近90%，為TSWV基因功能及致病機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)材料，并為TSWV田間綠色防控提供了技術(shù)手段。