陳培材，廖偉鋒，饒俊平

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院粵東醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 (廣東 梅州 514000)

多發(fā)性硬化(MS)屬于自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變，常會(huì)累及腦室周圍白質(zhì)、視神經(jīng)、脊髓、腦干和小腦等，是導(dǎo)致中青年致殘的重要因素。目前臨床上缺乏有效的根治措施，而且治療費(fèi)用高昂，給患者及其家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。近年來，研究顯示：維生素D(VD)缺乏是引發(fā)MS的危險(xiǎn)因素[1]。因此，VD也開始應(yīng)用與MS治療中，但其作用機(jī)制尚不明確。研究顯示：T細(xì)胞免疫在MS發(fā)病中起到了重要作用，而自噬又參與維持免疫系統(tǒng)平衡，同時(shí)VD能激活自噬[2]。為了闡明VD通過影響自噬改善MS的可能性，為VD在MS預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供參考，本研究建立了MS的動(dòng)物模型進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

(1)實(shí)驗(yàn)小鼠：6～8周的健康雌性C57BL/6及同源Atg5(+/-)小鼠各12只，體重20～30g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，22～26℃的飼養(yǎng)環(huán)境、12h光照周期，飲水?dāng)z食自由。(2)造模試劑：MOG35-55、完全福氏佐劑、結(jié)核菌素H37Ra、百日咳毒素均購(gòu)自美國(guó)默克集團(tuán)。(3)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑、LC3抗體、Atg5抗體、熒光標(biāo)記羊抗兔二抗、HE染色液、髓鞘染色試劑盒等。(4)實(shí)驗(yàn)設(shè)備：臺(tái)式高速低溫離心機(jī)、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)、雙恒定時(shí)電泳儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)實(shí)驗(yàn)分組：將6～8周的健康雌性C57BL/6及同源Atg5(+/-)小鼠各12只，分別隨機(jī)分4組，A組為C57BL/6小鼠+蓖麻油，B組為C57BL/6小鼠+1,25(OH)2D3，C組為Atg5(+/-)小鼠+蓖麻油，D組為Atg5(+/-)小鼠+1,25(OH)2D3，各6只。

(2)動(dòng)物模型建立：將MOG35-55多肽250μg溶于500μL生理鹽水中，并與含有1mg/mL結(jié)核菌素的500μL完全福氏佐劑混合，再加入結(jié)核桿菌H37Ra將結(jié)核菌素補(bǔ)充到400ng，將上述材料充分混合成油包水乳劑，制成完全抗原，在小鼠雙側(cè)背部4點(diǎn)行皮下注射。免疫后第0h和48h往小鼠腹腔內(nèi)注射500ng百日咳毒素，建立小鼠EA3E模型，免疫當(dāng)天為0天。

(3)藥物干預(yù)：用潔凈的蓖麻油將1,25(OH)2D3稀釋到濃度為1μg/mL，B組、D組小鼠從免疫當(dāng)天起每隔2天腹腔注射1,25(OH)2D30.1mL，A組、D組從免疫當(dāng)天起每隔2天腹腔注射0.1mL蓖麻油，在造模后20天處死小鼠，留取腦組織、脊髓、脾臟。

(4)臨床評(píng)分方法：自免疫當(dāng)天起，分別與8∶00和16∶00采取雙盲法對(duì)4組小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際通用的Kono評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]具體如下：0分為神經(jīng)系統(tǒng)檢查正常；1分為尾部緊張；2分為尾部松弛；3分為共濟(jì)失調(diào)，后肢輕癱；4分為后肢完全癱瘓；5分為瀕死狀態(tài)或死亡。

(5)病理組織學(xué)檢查：制作腦和脊髓組織的組織切片，采用HE染色觀察腦和脊髓組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，采用砂羅鉻花青法(SolochromeCyanin)染色觀察髓鞘的脫失情況。

(6)炎癥因子檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)4組小鼠腦及脾臟中IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-17、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

(7)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)：采用蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)測(cè)定4組小鼠腦和脾臟中自噬相關(guān)蛋白(LC3、Atg5)的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)測(cè)定4組小鼠腦和脾臟中自噬相關(guān)蛋白(LC3、Atg5)的mRNA表達(dá)。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

比較4組的神經(jīng)功能評(píng)分、HE染色、Solochrome Cyanin染色情況和IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-17、TNF-α等炎癥因子在4組小鼠腦及脾臟中的表達(dá)，以及4組小鼠腦和脾臟中自噬相關(guān)蛋白(LC3、Atg5)的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 VD通過自噬通路可以減輕EAE小鼠的神經(jīng)組織損傷程度

到取材為止，A、C、D組小鼠發(fā)病率為100%，B組發(fā)病率為11.1%。通過比較4組的神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)發(fā)現(xiàn)，自第11天起，B組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于A、C、D組(均P<0.05)；A、C、D組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分無明顯差異(P>0.05)。如表1所示。各組腦和脊髓組織切片HE染色顯示：C、D組可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及“血管袖套”樣改變；A組發(fā)病高峰期可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別切片灰、白交界部位存在“血管袖套”樣改變，為炎性細(xì)胞由小血管滲出并包繞在其周圍所致；B組基本未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)征象。Solochrome Cyanin染色顯示，C、D組可見明顯髓脫失情況；A組發(fā)病高峰期脊髓白質(zhì)內(nèi)可見成片髓鞘脫失區(qū)域，呈白色空泡樣變；B組脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘基本完整，無明顯脫失區(qū)域。

表1 4組的神經(jīng)功能評(píng)分比較 (n=6)

2.2 VD可以改善EAE小鼠的炎癥相關(guān)指標(biāo)

B組的IFN-γ、TNF-α、IL-17表達(dá)低于A、C、D組，TGF-β、IL-4表達(dá)高于A、C、D組，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、C、D組的IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-4、TNF-α表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。如表2所示。

表2 4組的炎癥相關(guān)指標(biāo)比較 (n=6)

2.3 VD可以調(diào)節(jié)EAE小鼠的自噬基因表達(dá)

B組的Atg5蛋白水平高于A組，LC3蛋白水平低于A、B、C組，C、D組未檢測(cè)出Atg5蛋白含量，見圖1。B組的LC3 mRNA表達(dá)量低于A、C、D組(P<0.05)，A、C、D組LC3 mRNA表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，見圖2。

圖1 4組小鼠腦和脾臟中自噬相關(guān)蛋白(LC3、Atg5)表達(dá)

圖2 4組小鼠腦和脾臟中LC3B mRNA表達(dá)比較注：B組與A組相比，aP<0.05，B組與C組相比，bP<0.05，B組與D組相比，cP<0.05；A組與C組相比，dP>0.05；A組與D組相比，eP>0.05；C組與D組相比，fP>0.05

3 討論

目前臨床認(rèn)為MS發(fā)病可能與病毒感染、自身免疫反應(yīng)、環(huán)境因素等多種因素有關(guān)。先天攜帶易感性基因的人更易發(fā)生免疫調(diào)節(jié)紊亂，受后天環(huán)境的影響可能會(huì)誘發(fā)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘成分的異常免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究顯示，MS患者血液中Atg5 mRNA及蛋白水平明顯升高[4]。Atg5作為自噬體形成的重要基因，不僅可以推動(dòng)自噬體向兩端延伸，還可以推動(dòng)LC3向自噬體靠攏，如果缺乏Atg5會(huì)阻礙溶酶體與自噬體融合，由此可以看出自噬參與了MS的發(fā)生。自噬是在進(jìn)化中高度保守的應(yīng)用溶酶體降解胞內(nèi)大分子以及細(xì)胞器的分解代謝過程，其在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡等過程中發(fā)揮了重要作用[5]。但目前關(guān)于MS與其自噬水平的研究較少。已有研究顯示，VD代謝異常與MS等多種自身免疫性疾病易感性增加有關(guān)，且VD能夠調(diào)節(jié)MS免疫并發(fā)揮治療作用[6]。同時(shí)VD還可以激活自噬，自噬可能是VD生物活性的重要內(nèi)在機(jī)制之一。由此可以推測(cè)上調(diào)自噬可能在VD對(duì)MS的保護(hù)作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了證明這一推測(cè)，本研究建立了MS的動(dòng)物模型，觀察Atg5敲除是否對(duì)VD的保護(hù)作用產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步闡明MS的發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，到取材為止，A、C、D組小鼠發(fā)病率為100%，B組發(fā)病率為11.1%。自第11天起，B組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于A、C、D組(均P<0.05)。由此可知，應(yīng)用VD可以有效減輕EAE小鼠神經(jīng)功能損傷，但同時(shí)是應(yīng)用VD，敲除Atg5的小鼠卻依舊全部發(fā)病，說明VD想要發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用需通過自噬通路實(shí)現(xiàn)。

近年來，研究證實(shí)，MS不僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)部分，脊髓、丘腦等灰質(zhì)部分也存在病理改變，比如脫髓鞘和血管“套袖樣”改變等，甚至在MS早期未出現(xiàn)明顯炎癥病理改變時(shí)就存在軸索等異常。本研究顯示，C、D組腦和脊髓組織切片HE染色可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及“血管袖套”樣改變；A組發(fā)病高峰期可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別切片灰、白交界部位存在“血管袖套”樣改變，為炎性細(xì)胞由小血管滲出并包繞在其周圍所致；B組基本未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)征象。Solochrome Cyanin染色顯示：C、D組可見明顯髓脫失情況；A組發(fā)病高峰期脊髓白質(zhì)內(nèi)可見成片髓鞘脫失區(qū)域，呈白色空泡樣變；B組脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘基本完整，無明顯脫失區(qū)域。由此可知，發(fā)病的EAE小鼠的確存在神經(jīng)凋亡和損傷的情況，同時(shí)可知自噬在EAE免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

腦血管屏障破壞后毛細(xì)血管靜脈周圍脫髓鞘是引發(fā)MS主要病因之一。MS發(fā)病早期，Toll樣受體和核苷酸結(jié)合寡聚樣受體會(huì)對(duì)病原體相關(guān)的抗原進(jìn)行識(shí)別，并誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，使活化的CD4+T細(xì)胞分化成TH17等相應(yīng)的炎性損傷細(xì)胞，進(jìn)而分泌多種炎性因子及炎性趨化因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和脫髓鞘損傷。本研究測(cè)定4組小鼠腦及脾臟中IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的結(jié)果顯示，B組的IFN-γ、TNF-α、IL-17表達(dá)低于A、C、D組，TGF-β、IL-4表達(dá)高于A、C、D組(均P<0.05)。這提示VD可以改善EAE小鼠的炎癥相關(guān)指標(biāo)。

此外，本研究結(jié)果還顯示，B組的Atg5蛋白水平高于A組，LC3蛋白水平低于A、B、C組。B組的LC3 mRNA表達(dá)量低于A、C、D組(P<0.05)。這提示VD可以提升EAE小鼠的Atg5表達(dá)，促進(jìn)自噬體形成增多。一般造成LC3增多的原因有兩種，一是自噬體形成增多，二是自噬體降解受阻。Atg5可以推動(dòng)LC3向自噬體靠攏，敲掉Atg5后自噬體降解會(huì)受阻，從而導(dǎo)致LC3增多。VD可以提升Atg5表達(dá)，推動(dòng)LC3向自噬體靠攏，形成更大的復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致LC3含量減少。而僅注射助溶劑的EAE小鼠，由于助溶劑不具備VD的功效，所以不會(huì)推動(dòng)LC3向自噬體靠攏，影響自噬體降解?；诒狙芯康氖荓C3蛋白及mRNA表達(dá)情況可以推斷發(fā)病期的EAE小鼠體內(nèi)存在自噬體降解受阻的現(xiàn)象。

綜上所述，VD可以通過調(diào)節(jié)自噬基因的表達(dá)介導(dǎo)保護(hù)神經(jīng)，其有望成為治療多發(fā)性硬化癥(MS)的新方向。