馬曉年，陳俊秀，農(nóng)蕊瑜，李文廷，蔣夢(mèng)

（1.昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228；2.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500）

0 引言

牛奶能為人體提供多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，在日常生活中不可或缺。食品防腐劑具有良好的殺菌作用[2]，能延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，被廣泛應(yīng)用于食品加工中。

少量的食品添加劑對(duì)人體沒(méi)有影響，過(guò)量則會(huì)對(duì)人體健康造成損害[3]。國(guó)標(biāo)對(duì)于食品防腐劑的添加做出了明確規(guī)定[4]，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸不能添加到牛奶中。目前,國(guó)內(nèi)的研究中檢測(cè)3種防腐劑的方法主要有：氣相色譜法[5-7]、液相色譜法[8-10、13-14]、薄層色譜法[11]，但能同時(shí)快速檢測(cè)3種防腐劑的方法較少。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行研究改進(jìn)，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中3種防腐劑。結(jié)果表明，該法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適合于日常檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo U3000高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器）,美國(guó)賽默飛;高速冷凍離心機(jī)，湖南 赫西儀器;電子天平（0.01 mg）,Sartorius。

牛奶，市購(gòu)；苯甲酸（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；山梨酸、脫氫乙酸，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純），美國(guó)JT Baker；乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀（分析純）、乙酸胺（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸（分析純），北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，用純水定容至10 mL，得到苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸均為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液保存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 樣品前處理

0.2 %乙酸沉淀法：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品于50 mL離心管中,加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸水溶液,渦旋2 min,于轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心1 min,留取上清液,殘?jiān)貜?fù)上述操作兩次,合并水相,并用體積分?jǐn)?shù)0.2%乙酸溶液定容至30 mL,混勻。取適量上清液過(guò)0.22μm濾膜,待液相色譜測(cè)定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A為濃度0.02 mol/L乙的酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為室溫。洗脫條件如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～300 nm范圍內(nèi)對(duì)分析物進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn),在流動(dòng)相中3個(gè)組分的最大吸收波長(zhǎng)分別是苯甲酸230 nm、山梨酸254 nm、脫氫乙酸230 nm。為兼顧各組分的靈敏度和吸收峰值，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)比254 nm和230 nm波長(zhǎng)處取得的混合組分色譜圖，根據(jù)各組分紫外吸收情況，確定在230 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸均取得更高響應(yīng)如見(jiàn)圖1所示，故選用230 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下3種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)色譜

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

本文實(shí)驗(yàn)了甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨、乙腈-磷酸二氫鉀，并調(diào)整有機(jī)相及水相比例以得到最佳的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，磷酸二氫鉀作為水相時(shí)，在不改變pH的情況下，苯甲酸和山梨酸無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，改變流動(dòng)相比例改善效果也并不顯著；乙酸銨作為水相則可較好的分離3種防腐劑，甲醇作為有機(jī)相，3種防腐劑均可實(shí)現(xiàn)基線分離，分析時(shí)間約為15 min；乙腈作為有機(jī)相，3種防腐劑均實(shí)現(xiàn)基線分離且峰型收窄，響應(yīng)增大，分析時(shí)間在7 min內(nèi)如見(jiàn)圖2所示。綜上所述，本文選擇乙腈-乙酸銨作為流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)分析工作。

圖2 不同流動(dòng)相下3種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 樣品前處理方法的確定

牛奶樣品中的蛋白質(zhì)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，故需除去蛋白質(zhì)。目前除蛋白有沉淀法和萃取法兩大類(lèi)[15]。實(shí)驗(yàn)主要考察了沉淀法中的GB 5009.28-2016[12]無(wú)機(jī)試劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀蛋白及有機(jī)試劑沉淀蛋白。

本文對(duì)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸進(jìn)行加標(biāo)6次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比3種方法的加標(biāo)回收率和相對(duì)偏差值,結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)方法過(guò)程較為繁瑣，苯甲酸的回收率在82.6%～116.2%，雖達(dá)到方法驗(yàn)證學(xué)的要求，但RSD大于10%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不佳；山梨酸的回收率較低，在60.6%～70.0%；脫氫乙酸的回收率則完全達(dá)不到方法學(xué)要求。

表2 不同前處理方法樣品的平均加標(biāo)回收率

本文試驗(yàn)了甲醇及乙酸兩種有機(jī)溶劑沉淀蛋白。采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)對(duì)苯甲酸、山梨酸的回收率基本達(dá)到要求，但實(shí)驗(yàn)中存在沉淀不完全的現(xiàn)象，且脫氫乙酸的回收率低至56.8%~70%。乙酸對(duì)水的親和力較大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀，故體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸沉淀法能克服實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣、沉淀不完全兩個(gè)缺點(diǎn)，取得理想效果，對(duì)3種組分的回收率在82.3%～104.0%，RSD在4.5%～5.6%。綜合考 慮，因而選擇體積分?jǐn)?shù)0.2%乙酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.3 樣品提取次數(shù)的選擇

試驗(yàn)按樣品前處理的步驟，對(duì)比了體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸分別對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行1次和3次提取，最后用體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸定容至30 mL，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)4次，得出樣品的平均加標(biāo)回收率和RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 不同提取次數(shù)的樣品加標(biāo)回收率

從表中可以看出，采用3次提取各組分的加標(biāo)回收率均優(yōu)于1次提取，且3次提取的RSD值小于1次提取，重復(fù)性較好。為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)再次使用體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸進(jìn)行4次提取，發(fā)現(xiàn)其平均回收率在88.4%～95.1%，和3次提取結(jié)果無(wú)顯著性差異，因而提取次數(shù)選擇3次。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用純水將混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制成含苯甲酸質(zhì)量濃度分別為1.56，12.5，25.0，50.0，100.0μg/mL；含山梨酸質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.78，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL；含脫氫乙酸質(zhì)量濃度分別為3.12，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；在確定的分析條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限如表4所示。

表4 3種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限mg/g

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

取不含苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的牛奶樣品，加入高中低3個(gè)濃度梯度的防腐劑混標(biāo)，加標(biāo)濃度分別見(jiàn)表5，分別測(cè)定6次，計(jì)算其平均回收率和精密度。苯甲酸平均回收率在86.7%～101.0%，RSD在3.6%～5.7%；山梨酸平均回收率在83.4%～91.9%，RSD在4.4%～6.0%；脫氫乙酸平均回收率在90.1%～97.2%，RSD在3.9%～5.1%。圖3為牛奶樣品加入3種混標(biāo)的色譜圖，由圖可見(jiàn)，3種組分與雜質(zhì)峰完全分離，無(wú)干擾，可準(zhǔn)確定性、定量檢測(cè)。

表5 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果

圖3 加標(biāo)樣品色譜圖

3 結(jié)論

在本方法的條件下，3種防腐劑與牛奶中其他干擾雜質(zhì)峰完全分離，在10 min內(nèi)可快速檢測(cè)出，且定量準(zhǔn)確?？梢怨?jié)約檢測(cè)成本并提高檢測(cè)效率，適合牛奶中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的日常監(jiān)控測(cè)定。