何靜怡，楊梅，林佳，梁安文，李廣宏，王方海

有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

水稻是我國(guó)重要糧食作物，而白背飛虱是危害水稻的主要害蟲(chóng)之一。白背飛虱（Sogatella furcifera）屬昆蟲(chóng)綱（Insecta），半翅目（Hemiptera），飛虱科（Delphacidae）［1］。雄性成蟲(chóng)黑褐色，雌性成蟲(chóng)黃褐色，因其前胸背板和中胸背板呈白色而得名［2］。白背飛虱生活周期包括卵期、若蟲(chóng)期和成蟲(chóng)期，成蟲(chóng)有長(zhǎng)翅和短翅兩種翅型［3］。長(zhǎng)翅型成蟲(chóng)擅長(zhǎng)遷飛，可以逃避惡劣的環(huán)境；短翅型雌蟲(chóng)多為留居型，具有較高的繁殖力，其產(chǎn)卵量是長(zhǎng)翅雌蟲(chóng)的2～4倍［4］。長(zhǎng)、短翅型的比例是預(yù)測(cè)飛虱危害的重要參數(shù)［5-6］。

表觀遺傳是在基因組DNA 沒(méi)有改變的前提下，通過(guò)化學(xué)修飾影響基因表達(dá)，從而造成表型變化，可以穩(wěn)定遺傳給后代。表觀遺傳參與生物體多種重要的生命活動(dòng)，也是生物體應(yīng)對(duì)外界脅迫和環(huán)境變化的重要機(jī)制［7］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs，DNA methyltransferases）的催化下，給DNA 添加甲基修飾的過(guò)程，是一種重要的表觀遺傳修飾［8］。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可將DNMTs 分為DNMT1、DNMT2 和DNMT3。DNMT1主要負(fù)責(zé)在半保留復(fù)制中，以親代甲基化位點(diǎn)為模板，催化子鏈甲基化。雖然傳統(tǒng)概念認(rèn)為DNMT1只有維持甲基化功能，但近年來(lái)研究表明，DNMT1 在DNA 從頭甲基化中同樣起著非常重要的作用［9-10］。DNMT2 主要催化tRNA 甲基化，但不具備催化CpG 島甲基化的特性［11］。DNMT3 是從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分裂初期催化未甲基化的DNA生成新的甲基化位點(diǎn)［12］。

在昆蟲(chóng)中，通常都存在DNMT1 和DNMT2；而DNMT3 僅在少數(shù)昆蟲(chóng)（如膜翅目昆蟲(chóng)） 中被發(fā)現(xiàn)［12-13］。

我們研究發(fā)現(xiàn)，飛虱雌性和雄性成蟲(chóng)體內(nèi)的基因組甲基化式樣和水平存在明顯差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在不同翅型個(gè)體中的基因組甲基化式樣和水平也存在明顯差異［14-17］。而DNMT1 是導(dǎo)致基因組甲基化式樣和水平發(fā)生變化的關(guān)鍵因子之一，故DNMT1 基因在白背飛虱性二型和翅二型分化過(guò)程中應(yīng)發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。

本研究通過(guò)建立白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的白背飛虱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的方法首先重點(diǎn)闡明白背飛虱DNMT1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，然后利用熒光定量PCR 具體測(cè)定了DNMT1 基因在雌雄成蟲(chóng)個(gè)體中的頭、胸、腹等部位的表達(dá)。該研究將增進(jìn)對(duì)稻飛虱DNMTs 的具體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，并為探索新的防治稻飛虱的方法或途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白背飛虱采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，在實(shí)驗(yàn)室已連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件：溫度（28±2）℃、相對(duì)濕度70%、光周期為16 h 光照：8 h 黑暗。選取羽化后24 h 內(nèi)的雌雄成蟲(chóng)各10 頭，冷凍后用刀片將蟲(chóng)體頭、胸、腹3 部分分離，并分別收集頭、胸、腹3部分作為待檢測(cè)樣品。

本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)得白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。根據(jù)注釋?zhuān)谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到包含有白背飛虱DNMT1 基因的序列片段，序列號(hào)為c88319.graph_c0，片段長(zhǎng)度為4 524 bp。GenBank 登錄號(hào)為MW291509。白背飛虱基因組序列來(lái)自NCBI 的Genome數(shù)據(jù)庫(kù)（ID 18187）。

1.2 開(kāi)放閱讀框分析

使用NCBI 的ORFfinder （https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/orffinder/）對(duì)白背飛虱DNMT1 基因的開(kāi)放閱讀框序列進(jìn)行分析。

1.3 同源序列驗(yàn)證

使用NCBI 的在線BLAST 工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行白背飛虱DNMT1的同源序列尋找，并使用DNAMAN 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建樹(shù)的物種序列信息均來(lái)自NCBI。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)白背飛虱DNMT1基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5 外顯子和內(nèi)含子的分布

將白背飛虱DNMT1 基因的開(kāi)放閱讀框與白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。能比對(duì)上的序列是白背飛虱DNMT1 基因的外顯子，位于外顯子中間的非編碼基因序列則是白背飛虱DNMT1 基因的內(nèi)含子。

1.6 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

在ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）上對(duì)白背飛虱DNMT1 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.7 蛋白糖基化位點(diǎn)分析

應(yīng)用NetNGlyc （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）軟件分析蛋白N 型糖基化位點(diǎn)。應(yīng)用YinOYang （http：//www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/）軟件分析蛋白O型糖基化位點(diǎn)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

首先用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）抽提法從白背飛虱各樣品中提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix（TaKaRa，日本）的操作說(shuō)明將得到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著使用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)出DNMT1 基因的引物為（F：ACGCCCAAGACGACAACT；R：CATGACAATGCCGACCAG）。內(nèi)參基因?yàn)锳lpha 1-tubulin（NCBI 登錄號(hào)為KP735521），qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)采用SYBR green 法，3 次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-△△Ct法進(jìn)行處理，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白背飛虱DNMT1基因的開(kāi)放閱讀框分析

對(duì)包含白背飛虱DNMT1 基因的測(cè)序片段c88319. graph_c0 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框在線分析。結(jié)果表明，位于序列首端的ATG 和序列尾端的TGA 組成了最大的開(kāi)放閱讀框（圖1）。說(shuō)明c88319.graph_c0 的全長(zhǎng)即為白背飛虱DNMT1 基因的開(kāi)放閱讀框，長(zhǎng)度為4 524 bp，編碼由1 507 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組片段c88319.graph_c0的開(kāi)放閱讀框Fig.1 The open reading frame of c88319.graph_c0

2.2 同源序列驗(yàn)證

將白背飛虱DNMT1 基因的開(kāi)放閱讀框序列通過(guò)NCBI 的在線BLAST 進(jìn)行同源序列尋找，發(fā)現(xiàn)該序列與多種生物的DNMT1 基因高度同源，和褐飛虱的同源性最大。這進(jìn)一步驗(yàn)證了我們所獲得的白背飛虱DNMT1基因的開(kāi)放閱讀框序列是正確的。

利用NCBI 獲取不同昆蟲(chóng)的DNMT1 蛋白序列（表1），用DNAMAN 進(jìn)行同源度分析，白背飛虱與褐飛虱（Nilaparvata lugens）、茶翅蝽（Halyomorpha halys）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、收獲蟻（Pogonomyrmex barbatus）、紅火蟻（Solenopsis invicta）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蠶（Bombyx mori）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的蛋白序列同源度分別為83.65%、53.02%、50.56%、46.35%、46.12%、42.96%、42.72%、35.67%和28.75%。將以上不同物種構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖2），從圖2 中可以看到DNMT1 在各種昆蟲(chóng)之間高度保守，白背飛虱的DNMT1 和褐飛虱的親緣關(guān)系最近，并與同為半翅目的茶翅蝽聚為一支，但與鱗翅目和鞘翅目的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖2 白背飛虱DNMT1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DNMT1 of Sogatella furcifera and other homologous sequences from insects

表1 不同物種DNMT1的氨基酸登錄號(hào)Table 1 Amino acid accession numbers of DNMT1 in different species

2.3 保守結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)白背飛虱DNMT1 基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖3 所示，白背飛虱DNMT1的結(jié)構(gòu)具有典型的DNMT1特征，包括一個(gè)DNMT1 相關(guān)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DMAP binding domain）、一個(gè)復(fù)制灶靶向序列（RFTs，replication foci targeting sequence）、一個(gè)富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)域（CXXC zinc finger domain）、聚溴同源結(jié)構(gòu)域（PBHD，polybromo homology domain）和一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域（dcm domain）。

圖3 白背飛虱DNMT1的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domains of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.4 外顯子和內(nèi)含子的分布

將白背飛虱DNMT1 基因的開(kāi)放閱讀框與白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)白背飛虱DNMT1 基因位于白背飛虱第3 號(hào)染色體上。白背飛虱3 號(hào)染色體（CM025292.1）全長(zhǎng)67 498 134 bp，而白背飛虱DNMT1 基因位于3 號(hào)染色體的第53 720 184 ～ 53 742 750 bp 處（圖4），是斷裂基因，被許多非編碼區(qū)域序列隔開(kāi)，基因全長(zhǎng)為22 567 bp，含有18 個(gè)外顯子（長(zhǎng)度分別為55、156、140、351、226、123、249、200、141、194、141、465、214、78、92、139、236、1 696 bp）和17 個(gè)內(nèi)含子（長(zhǎng)度分別為73、2833、642、508、631、443、675、805、122、805、1 179、1 608、343、711、2 977、613、2 043 bp）（圖5）。外顯子在圖中用阿拉伯?dāng)?shù)字1～18標(biāo)注，內(nèi)含子在圖中用大寫(xiě)字母A～Q標(biāo)注。

圖4 DNMT1基因在白背飛虱3號(hào)染色體上的位置Fig.4 The location of DNMT1 gene on chromosome 3 of Sogatella furcifera

圖5 白背飛虱DNMT1基因的外顯子和內(nèi)含子分布Fig.5 Exons and introns of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.5 白背飛虱DNMT1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

白 背 飛 虱 DNMT1 蛋 白 分 子 式 為C7466H11720N2098O2317S82，相對(duì)分子質(zhì)量為170 572.77，其中絲氨酸含量最高，占序列的7.8%。蛋白理論等電點(diǎn)為6.15，屬于負(fù)電性的酸類(lèi)有212個(gè)，陽(yáng)性堿類(lèi)的有196個(gè)，所以蛋白基本上可以被認(rèn)為是酸類(lèi)蛋白。其網(wǎng)織紅細(xì)胞存在時(shí)間大約幾十小時(shí)。

2.6 DNMT1在雌雄成蟲(chóng)中的表達(dá)

我們分別檢測(cè)了DNMT1 在雌雄成蟲(chóng)身體各部位的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNMT1 主要在腹部表達(dá)，其次胸部、頭部表達(dá)量很低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)中的整體表達(dá)量明顯高于雄蟲(chóng)，高達(dá)4.3倍（圖6）。

圖6 DNMT1在白背飛虱雌雄成蟲(chóng)中的表達(dá)Fig.6 DNMT1 expression in male and female adults

3 討 論

本文通過(guò)在白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到白背飛虱DNMT1 的cDNA 序列，并通過(guò)NCBI 的ORF finder 網(wǎng)站對(duì)序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框在線分析，得到了全長(zhǎng)4 524 bp的開(kāi)放閱讀框序列，該序列編碼由1 507個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有DNMT1的典型結(jié)構(gòu)：位于N端的DNMT相關(guān)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，復(fù)制灶靶向序列，富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)域，聚溴同源結(jié)構(gòu)域，以及位于C端的催化結(jié)構(gòu)域。再將開(kāi)放閱讀框序列同白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DNMT1 基因位于白背飛虱第3 號(hào)染色體上，長(zhǎng)度為22 567 bp，含有18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子。這是首次有關(guān)白背飛虱DNMT1 基因結(jié)構(gòu)的詳細(xì)報(bào)道，為該基因進(jìn)一步的體外表達(dá)和功能研究打下了基礎(chǔ)，有利于探索該酶在稻飛虱生長(zhǎng)發(fā)育中的具體調(diào)控作用，豐富昆蟲(chóng)DNA 甲基化現(xiàn)象的研究。

已經(jīng)觀察到昆蟲(chóng)與人類(lèi)DNMT1 基因存在C 端結(jié)構(gòu)保守、N端結(jié)構(gòu)不同的特點(diǎn)［18-19］，比如家蠶和蜜蜂DNMT1缺乏DMAP1結(jié)合位點(diǎn)、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA，proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位序列，金小蜂DNMT1c以及豌豆蚜的DNMT1a 和DNMT1b 中缺少鋅離子結(jié)合域［12-13］。我們對(duì)于白背飛虱DNMT1 基因的研究也證明了這一結(jié)論，與人類(lèi)DNMT1相比，白背飛虱DNMT1缺乏PCNA 結(jié)合位點(diǎn)和核定位序列，說(shuō)明DNMT1 在昆蟲(chóng)中的作用模式可能與人類(lèi)中的作用模式有所不同。

DNMT1 在雌成蟲(chóng)中的整體表達(dá)量明顯高于雄成蟲(chóng)，達(dá)4.3 倍，推測(cè)雌成蟲(chóng)的基因組DNA 甲基化率應(yīng)該高于雄成蟲(chóng)。而之前的全基因組的DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)白背飛虱雌成蟲(chóng)的全甲基化率（fully-methylated ratio）為7.64%，高于雄成蟲(chóng)的6.88%［16］，與我們的分析結(jié)果基本一致。