基于磁性納米材料修飾的離子液體萃取番茄中的過氧化氫酶

王 濤，翟 晨，欒鑫鑫，王書雅，謝云峰，王 亮*

（1 新疆大學生命科學與技術學院 烏魯木齊 830017 2 中糧營養(yǎng)健康研究院 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室 北京 102209 3 北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部 北京 100124）

番茄是世界產(chǎn)量最豐富的常見蔬菜之一，其內(nèi)富含番茄紅素、維生素C 和過氧化氫酶，營養(yǎng)價值極高[1-2]，然而易產(chǎn)生劣變。過氧化氫酶是一種典型的抗氧化酶，廣泛存在于細胞內(nèi)，用于代謝乙醇。過氧化氫酶將過氧化氫分解后，產(chǎn)生無毒、無害的水和氧氣，可以保護細胞免受來自內(nèi)源性代謝的過量活性氧（ROS）或外部微環(huán)境，減緩果蔬腐敗變質[3-5]。

在所有可能的溶劑中，水無疑具有出色的安全性，這是因為水無毒、不易燃，價格便宜且資源豐富。除具有安全和環(huán)保優(yōu)勢外，水還表現(xiàn)出優(yōu)異的物理和化學性質。其獨特而牢固的氫鍵網(wǎng)絡可以直接影響反應機理，加速或降低反應速率。離子液體通常由陽離子（有機）和陰離子（無機或有機）組成，組成離子熔點較低（<100 ℃）。其中，陽離子通常由咪唑、季銨鹽或磷離子組成，常見的陰離子部分包括氯離子、溴離子、四氟化硼、六氟化磷、雙（三氟磺酰）亞胺等。其具有較高的熱穩(wěn)定性，相對較高的黏度，較大的電化學窗口，非常低的揮發(fā)性等特性，這些特性吸引研究人員在合成和萃取時應用[6-8]。離子液體對與之混溶液體的極性接受度高，支持有機和無機物質的同步溶解，因而被成功用于從溶液中提取物質的研究。通過選擇合適的、烷基鏈長度不同的陽離子和陰離子，可以調(diào)節(jié)離子液體的物理性質[9-15]。離子液體在有機合成、催化、液-液萃取、電化學、形態(tài)研究、核后處理等方面的應用近年來得到廣泛的研究[16-19]。水和離子液體可以相互受益，形成一種新的介質，從而發(fā)揮兩種成分的優(yōu)點。借助弱范德瓦爾斯力、庫侖力，強共價鍵等，以化學成鍵吸附或物理吸附等形式，增大離子液體與納米材料之間的接觸面積，從而提高離子液體的催化、分離性能，同時磁性納米粒子的引入可以有效避免離子液體的損失[20-23]。不僅拓寬彼此適用范圍，還能降低成本。

Zhu 等[24]采用咪唑鎓離子液體-水混合物從小球藻中提取葉黃素，提取率高達98.06%。Mishra等[25]研究用極少量離子液體三辛基硫代水楊酸銨在不同體積、pH 值和鈾濃度的水介質中提取鈾的效率，結果表明對于雜質含量較低的樣品，離子液體提取鈾的效率高達85%。Geng 等[26]利用N-烷基碳酸咪唑離子液體分離萃取高酸油中的環(huán)烷酸，其再生及回收率高達92%，離子液體也可回收利用。Li 等[27]采用六烷基胍離子液體液-液萃取茶樹油中的4-萜烯醇，單次提取率可達90%。Deng等[28]以疏水離子液體為萃取劑，在最佳提取條件下，對生物油水餾分中乙酸、苯酚、愈創(chuàng)木酚和4-甲基愈創(chuàng)木酚的提取率分別為2.71%，95.41%，92.04%和97.98%，表明此種離子液體對生物油水餾分中的酚類物質具有較好的選擇性和提取效率。上述研究表明利用離子液體的萃取是可行的。

本研究選用1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體，萃取番茄細胞中的過氧化氫酶。通過測定萃取酶活性，考察1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量、萃取時間和溫度等參數(shù)對酶活的影響，確定提取過氧化氫酶的最優(yōu)參數(shù)并與緩沖溶液萃取法作比較，旨在為實現(xiàn)高活性過氧化氫酶等蛋白類物質的高效萃取拓展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

由上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn)的過氧化氫酶2 000 U/mg，由海默尼化工科技有限公司生產(chǎn)的1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；11-102-49SH 渦旋混勻器，德國IKA公司；U-3900 紫外可見分光光度計，日本Hitachi公司；THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司；PB-10 pH 計，德國Sartorius 公司；Thermo ST16R 離心機，德國Eppendorf 公司；Multi-mode Synergy Mx 酶標儀，美國Bio-Tek 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 1 -羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體萃取酶蛋白 準確稱取175 mg 納米磁流體加入離心管中，加入1.5 mL 水溶解，形成雙水相體系，再加入預制番茄泥0.1 g，充分振蕩后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，于200 r/min 轉速下振蕩20 min，靜置直至兩相分離，提取上層清液中的過氧化氫酶，測定活性指標。圖1為磁性固相體系萃取酶的原理圖。

圖1 磁性固相體系萃取酶原理圖Fig.1 Schematic diagram of extractase in magnetic solid phase system

1.3.2 緩沖溶液法萃取分離酶蛋白 量取4.5 mL pH=7.8 的PBS 緩沖液置于離心管，再加入0.1 g 番茄泥漿，充分混合后于5 000 r/min 轉速下保持40 min，靜置后提取上層清液待用，離心和靜置保存均于4 ℃恒溫下完成。

1.3.3 提取工藝優(yōu)化 測定不同離子液體添加量 （150，175，200，225，250 mg）、萃取溫度（20，25，30，35，40 ℃） 及離心時間（20，25，30，35，40 min）條件下，提取酶活性的變化。

1.3.4 響應面試驗設計 以提取酶活性作為響應值，針對3 個變量設計單因素響應面試驗，每個變量因素設定3 個水平，各因素具體設定值如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface experimental design

1.3.5 酶蛋白活性測定 采用紫外分光光度法測定酶活[29]。

2 結果與分析

2.1 萃取參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 1 -羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體用量 由圖2a 可知，隨離子液體加入量的提高酶活逐漸升高，當加入量達到175 mg 時，萃取效果最好，之后隨著離子液體加入量升高，酶活性逐漸降低，因此離子液體加入量應控制在175 mg。

2.1.2 萃取溫度 如圖2b 所示，當其它試驗條件固定的前提下，于35 ℃提取的酶活性最理想，即該溫度為試驗最佳萃取溫度參數(shù)。

2.1.3 萃取時間 如圖2c 所示。隨萃取時間增加，過氧化氫酶活性逐漸增加，30 min 時酶活性最高。因此，最優(yōu)萃取時間為30 min。

圖2 單因素酶活試驗結果Fig.2 Single factor enzyme activity test results

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面設計及結果 對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到二次回歸擬合方程Y=347.64+0.27A+1.78B-0.031C+2.94AB+1.25AC+8.34BC-28.01A2-26.91B2-30.26C2。

表2 響應面試驗設計方案Table 2 Response surface experiment design scheme

模型方程方差小于0.0001，為差異極顯著因素；失擬項P 值為0.5090（＞0.05），表明該因素差異不顯著，即回歸方程擬合結果與試驗結果相吻合。因此，該模型用于酶活分析獲取的結果真實可靠。在A、B、C 3 個因素中，B 對酶活影響最大，A次之，C 相對最小，即萃取溫度最顯著，1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量次之，萃取時間影響相對較小。

2.2.2 響應面分析 繪制如圖3所示的響應曲面圖，用于分析對比A、B、C 因素兩兩組合對酶活影響的強弱。

表3 方差分析表Table 3 Anova table

圖3 三因素間兩兩交互的響應面及等高線圖Fig.3 The response surface and contour map of the interaction among various factors

由上圖三維響應面趨勢可知，三因素的兩兩交互作用對酶活影響顯著，由等高線圖可確定最高酶活對應的三因素水平范圍，分析結果與試驗結果相一致，證明響應面模型和等高線模型的可靠性，并由此確定最佳過氧化氫酶萃取試驗條件：1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量175.99 mg、萃取溫度及時間分別為34.87 ℃、30.14 min。

2.3 驗證試驗

為兼顧試驗操作可行性，將各因素設定為1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量176 mg、萃取溫度及時間分別設定為35 ℃、30 min。由酶活測量的3 次平行試驗結果可知，酶活平均值（345.68 U/g）與預測值（345.15 U/g）相近，進而再次證明所建立模型的可靠性。

2.4 磁性固相體系與PBS 緩沖溶液萃取番茄中5 種蛋白酶的比較

表4為在最優(yōu)條件下對番茄中5 種抗氧化酶進行萃取的結果，由表可以看出，通過磁性固相提取的各種酶的活性均明顯高于PBS 緩沖溶液法，且大部分標準偏差更小，導致這一現(xiàn)象的主要原因是納米材料與離子液體對蛋白酶的強有力的吸附萃取效果，實現(xiàn)高活性蛋白酶類物質的高效提取?？偠灾c傳統(tǒng)萃取技術相比，由磁性固相體系萃取法抵御外界干擾的效果更優(yōu)，提取的蛋白酶活性更穩(wěn)定。

表4 磁性固相體系與PBS 緩沖溶液萃取番茄中5 種蛋白酶的比較Table 4 Comparison of five proteases extracted from tomato with magnetic solid phase system and PBS buffer solution

3 結論

本研究基于新型離子液體1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體，以番茄細胞過氧化氫酶提取為例，優(yōu)化了蛋白酶類物質萃取試驗條件。以酶活為指標對1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體的加入量、萃取溫度及時間進行調(diào)整，并對以上3 個顯著變量分別設計單因素響應面試驗，并與試驗所得結果進行對比。模型、試驗兩方面的數(shù)據(jù)結果顯示：1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量176 mg、萃取溫度及時間分別設定為35 ℃、30 min 時，提取酶的活性最高。本試驗以番茄細胞過氧化氫酶提取為基礎，優(yōu)化了傳統(tǒng)的蛋白酶類物質萃取方法，將萃取周期由原來的40 min 縮短至30 min，在保證酶活的同時提高了萃取效率。