葛玲玲 李沂鍵 黎其友 古賢梁 黃小娜 陶醉 徐海偉

陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院眼科 視覺損傷與再生修復重慶市重點實驗室，重慶 400038

視網(wǎng)膜變性疾病是包含視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變等在內(nèi)的一類疾病，可導致視力障礙，嚴重影響患者的生活質量。該類疾病的主要特點是視網(wǎng)膜神經(jīng)元功能障礙和喪失，繼而導致視覺功能不可逆的損害，目前尚無有效的治療方法。細胞替代治療是恢復異常視網(wǎng)膜視覺功能一種潛在的有效方法，已成為視網(wǎng)膜再生研究的重要方向。通過干細胞移植可再生損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，但存在增生能力偏低、難以向特定神經(jīng)元優(yōu)先分化等問題，成為有效修復視網(wǎng)膜的技術瓶頸。MIO-M1細胞是自然篩選的人源永生化Müller細胞系，具有自我更新的干細胞特性，并有分化成為各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的潛能。研究表明，MIO-M1細胞能夠與視網(wǎng)膜神經(jīng)元進行細胞整合和分化，取代退化的視網(wǎng)膜細胞，是一種理想的移植細胞來源，但MIO-M1細胞同樣存在上述增生能力和定向分化問題。有研究報道間充質干細胞條件培養(yǎng)基可以提高細胞增生和分化的潛力。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細胞，可以通過成熟的技術獲得，因此受到廣泛關注。前期有研究表明，BMSCs能通過產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子促進神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的增生和分化，具有較強的神經(jīng)保護作用。在視網(wǎng)膜的研究中，BMSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎細胞因子和外囊泡對青光眼和光損傷視網(wǎng)膜模型有較好的治療效果。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs和視網(wǎng)膜祖細胞(retinal progenitor cells，RPCs)聯(lián)合移植于視網(wǎng)膜變性大鼠的視網(wǎng)膜下腔，較單獨移植一種細胞(BMSCs或RPCs)能更好地維持視網(wǎng)膜功能，并提高RPCs向感光細胞分化的比率。此外，既往研究也表明，BMSCs與NSCs體外共培養(yǎng)可促進NSCs分化和軸突發(fā)育。然而BMSCs對MIO-M1細胞增生能力和定向分化的影響尚未明確。本研究中擬探索BMSCs來源的條件培養(yǎng)基對MIO-M1細胞增生和分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞來源 BMSCs由陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院生物樣品庫提供；293T細胞購自美國ATCC細胞庫；Müller細胞系MIO-M1細胞由上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院眼科張敬法教授饋贈。

1.1.2

主要試劑及儀器 高糖DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)(美國HyClone公司)；特級南美胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(烏拉圭Lonsera公司)；兔抗SOX9單克隆抗體(ab185966)、兔抗Rhodopsin單克隆抗體(ab221664)、小鼠抗胞內(nèi)視黃醛結合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein，CRALBP)單克隆抗體(ab15051)、兔抗MAP2多克隆抗體(ab183830)、兔抗SOX2多克隆抗體(ab97959)(美國Abcam公司)；小鼠抗vimentin單克隆抗體(SC6260)、小鼠抗CHX10單克隆抗體(SC369915)(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)單克隆抗體(MAB302)、小鼠抗Tuj1單克隆抗體(T5076)(美國Sigma-Aldrich公司)；兔抗CCND3多克隆抗體(PA5-86224)(美國Invitrogen公司)；流式檢測抗體CD34-FITC(11-0349-41)、CD45-FITC(MHCD4501)、人類白細胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)-FITC(MHLDR01)、CD73-PE(12-0739-41)、CD90-PE(12-0909-42)、CD105-PE(12-1057-42)(美國Thermo公司)；Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG(A-11029)、Alexa Fluor 568標記山羊抗小鼠IgG(A-11031)、BeyoClick5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)-488細胞增生檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；OriCell成人BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒[賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司]；人源表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國PeproTech公司)；血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(北京索萊寶科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(RR047A)、實時熒光定量試劑盒(RR820A)(寶日醫(yī)生物技術有限公司)。ACEA NovoCyte流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司)；OLYMPUS-IX70型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；LSM880型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)；Thermo ScientificStratos離心機、酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1

BMSCs的培養(yǎng)及鑒定 BMSCs用含體積分數(shù)10%FBS和質量分數(shù)1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察細胞生長情況；待細胞生長至80%～90%融合度時進行傳代，取第3～5代BMSCs用于后續(xù)實驗。使用成骨、成軟骨及成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)第3代BMSCs，使用茜素紅、阿利辛藍及油紅O進行染色。制備1×10個/ml的BMSCs單細胞懸液，使用流式抗體對細胞進行避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min收集細胞，PBS漂洗后進行流式細胞儀檢測分析。

1.2.2

293T細胞和MIO-M1細胞的培養(yǎng) 293T細胞和MIO-M1細胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞生長至融合度為90%，用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代。

1.2.3

免疫熒光法鑒定MIO-M1細胞特性 取常規(guī)培養(yǎng)的MIO-M1細胞，采用免疫熒光染色法檢測Müller細胞標志物SOX9、GS、vimentin和CRALBP蛋白的表達以及視網(wǎng)膜干細胞標志物SOX2、nestin和CHX10的表達。將MIO-M1細胞以1 000個/cm接種于含去分化培養(yǎng)基(含體積分數(shù)2%B27、20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液)的低黏附培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取培養(yǎng)3 d的神經(jīng)球滴于包被多聚賴氨酸的細胞爬片上，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后采用免疫熒光染色法檢測神經(jīng)球中干細胞標志物SOX2、CHX10和細胞增生標志物CCND3的表達。

1.2.4

293T細胞、BMSC培養(yǎng)上清的收集及實驗分組 將BMSCs和293T細胞接種至直徑10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待融合度至70%～80%時，棄去培養(yǎng)液并用PBS洗3次，換為含1%青鏈霉素的基礎培養(yǎng)基(DMEM/F12)；培養(yǎng)24 h收集培養(yǎng)上清液，2 000×

g

離心10 min后，取培養(yǎng)上清液用0.22 μm濾器過濾，-80 ℃保存。將MIO-M1細胞分為標準培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和BMSC條件培養(yǎng)基組，分別在標準培養(yǎng)基、293T培養(yǎng)上清液和BMSC培養(yǎng)上清液中培養(yǎng)72 h。

1.2.5

MIO-M1細胞形態(tài)學分析和細胞計數(shù) 將標準培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和BMSC條件培養(yǎng)基組的MIO-M1細胞免疫標記vimentin和DAPI，并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。使用ImageJ軟件對細胞的形態(tài)學進行計算分析。形態(tài)學參數(shù)包括細胞面積、周長、圓度[4π(細胞面積)/(細胞周長)]和伸長系數(shù)(細胞長軸與短軸的比值)。細胞計數(shù)是至少計數(shù)5個獨立區(qū)域共30個細胞中DAPI染色的細胞核。

1.2.6

MIO-M1神經(jīng)球形態(tài)學分析 將標準培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和BMSC條件培養(yǎng)基組的神經(jīng)球在光學顯微鏡下觀察并拍照。使用ImageJ軟件對細胞面積進行計算分析。100倍視野下，隨機選取20個神經(jīng)球進行統(tǒng)計分析。

1.2.7

EdU染色法檢測細胞增生 將MIO-M1細胞接種于細胞爬片上分組培養(yǎng)24 h，將37 ℃預熱的EdU(終濃度為10 μmol/L)加入細胞中，繼續(xù)孵育4 h。EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入質量分數(shù)4%多聚甲醛固定，用0.5%TritonX-100室溫破膜10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。然后根據(jù)BeyoClickEdU-488細胞增生檢測試劑盒的說明書進行實驗，加入現(xiàn)配的Click反應液室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加DAPI室溫下避光孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min；最后用抗熒光淬滅劑進行封片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡于波長488 nm和405 nm分別檢測EdU和細胞核染色情況。

1.2.8

流式細胞儀檢測細胞周期 將標準培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和BMSC條件培養(yǎng)基組的細胞制備成單細胞懸液，用PBS洗1次，1 500 r/min離心5 min收集細胞，調整細胞濃度為1×10個/ml；取1 ml單細胞懸液，離心后，去上清，用少許PBS重懸細胞，再加入500 μl體積分數(shù)70%預冷乙醇4 ℃固定過夜；用PBS洗1次，加入100 μl RNase A溶液重懸細胞，37 ℃水浴30 min；再加入200 μl PI染色液，4 ℃避光孵育30 min，直接流式細胞儀上機檢測；計算細胞增生指數(shù)，細胞增生指數(shù)=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.2.9

ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1質量濃度 取各組培養(yǎng)24 h的上清液，2 000 ×

g

離心10 min后，用0.22 μm濾器過濾。按照VCAM-1的ELISA試劑盒說明書進行檢測，分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔，除空白孔外每孔加入50 μl對應樣本，用封板膜封板后37 ℃溫育30 min，洗滌5次，甩干；每孔加酶標試劑50 μl后用封板膜封板后37 ℃溫育30 min，洗滌5次，甩干；每孔先后加入顯色液A和B各50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，最后加入終止液50 μl終止反應，在酶標儀450 nm波長下測量各孔的吸光度(

A

)值。根據(jù)標準品測定結果，計算各組上清液中VCAM-1質量濃度。

1.2.10

MIO-M1細胞誘導分化 將MIO-M1細胞接種于包被纖連蛋白的分化培養(yǎng)基[含有體積分數(shù)1%N2、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青鏈霉素、5%FBS和1.2 ng/ml bFGF的標準培養(yǎng)基(DMEM/F12)、293T條件培養(yǎng)基或BMSC條件培養(yǎng)基]的培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO中培養(yǎng)7 d。收集不同培養(yǎng)條件下的細胞進行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.11

實時熒光定量PCR檢測細胞中各視網(wǎng)膜神經(jīng)元標志物基因的表達 取各組培養(yǎng)細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞1次，加入Trizol裂解液提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，檢測3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)α、Rhodopsin、β-微管蛋白(β-tubulin，Tuj1)和微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)的mRNA相對表達水平，本研究使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)反應體系：SYBR Green 7.5 μl、雙蒸水5.5 μl、正向和反向引物各0.5 μl、cDNA 1.0 μl，總反應體系15.0 μl。擴增條件為95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2法計算各基因相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of genes基因名稱引物序列(5’-3’)產(chǎn)物長度(bp)GAPDH正向:CCATGTTCGTCATGGGTGTGA140反向:CATGAGTCCTTCCACGATACCAPKCα正向:GCCTATGGCGTCCTGTTGTA271反向:GTGGCTGGATCTCCCTGTTCRhodopsin正向:CTACGTGCCCTTCTCCAATG213反向:GCTAGGTTGAGCAGGATGTAGTTGTuj1正向:CAGCAAGGTGCGTGAGGAGTA185反向:TGCGGAAGCAGATGTCGTAGAMAP2正向:CATACAGGGAGGATGAAGAGG266反向:TGGAGAAGGAGGCAGATTAGVCAM-1正向:GTCAATGTTGCCCCCAGAGA112反向:TTTTCGGAGCAGGAAAGCCC 注:GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶;PKC:蛋白激酶C;Tuj1:β-微管蛋白;MAP2:微管相關蛋白2;VCAM:血管細胞黏附分子 Note:GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;PKC:protein kinase C;Tuj1:β-tubulin;MAP2:microtubule-associated protein 2;VCAM:vascular cell adhesion molecule

1.2.12

免疫熒光染色觀察細胞中各視網(wǎng)膜神經(jīng)元標志物蛋白的表達 將細胞接種于細胞爬片上，用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%TritonX-100破膜10 min，并用5%BSA封閉1 h；分別滴加SOX9抗體(1∶ 400)、CRALBP抗體(1∶ 200)、vimentin抗體(1∶ 200)、GS抗體(1∶ 500)、MAP2抗體(1∶ 200)、Tuj1抗體(1∶ 200)、Rhodopsin抗體(1∶ 200)、SOX2抗體(1∶ 200)、CHX10抗體(1∶ 200)、CCND3抗體(1∶ 400)于4 ℃條件下孵育過夜；PBS洗滌3次，滴加相應二抗室溫孵育1 h；PBS漂洗3次，加入DAPI染液室溫孵育10 min；PBS漂洗3次，抗熒光淬滅劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。各計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以進行表達。采用均衡分組三水平研究設計，3個組間細胞形態(tài)學相應指標、細胞增生率、不同細胞周期細胞比例、細胞黏附特性和細胞分化能力相應指標的總體差異比較均采用單因素方差分析，各組細胞培養(yǎng)不同時間點細胞面積的總體差異比較采用兩因素方差分析，多重比較均采用Tukey檢驗。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs細胞形態(tài)及鑒定

光學顯微鏡下可見第3代BMSCs貼壁生長，形態(tài)均勻一致，呈紡錘形(圖1A)。BMSCs成骨誘導后3周，中心細胞發(fā)生鈣化，茜素紅染色陽性；成脂誘導分化后3周，細胞內(nèi)出現(xiàn)融合的脂肪滴，油紅O染色陽性；成軟骨誘導分化后4周，細胞內(nèi)出現(xiàn)酸性黏多糖，阿利辛藍染色陽性(圖1B～D)。上述結果表明，BMSCs可成功誘導為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞。

圖1 BMSCs細胞形態(tài)及鑒定 A：光學顯微鏡下細胞形態(tài)(×100，標尺=200 μm) 第3代BMSCs呈紡錐形 B：BMSCs細胞成骨誘導分化鑒定(茜素紅 ×200，標尺=100 μm) 細胞發(fā)生鈣化，茜素紅染色陽性(箭頭) C：BMSCs細胞成脂誘導分化鑒定(油紅O ×200，標尺=100 μm) 細胞內(nèi)出現(xiàn)融合的脂肪滴，油紅O染色陽性(箭頭) D：BMSCs細胞成軟骨誘導分化鑒定(阿利辛藍 ×200，標尺=100 μm) 細胞內(nèi)出現(xiàn)酸性黏多糖，阿利辛藍染色陽性Figure 1 Morphology and identification of BMSCs A:Cell morphology under light microscope (×100，bar=200 μm) The morphology of the third-passage human BMSCs was spindle-shaped B:Identification of osteogenic differentiation of BMSCs (Alizarin red ×200，bar=100 μm) The cells were calcified and alizarin red staining was positive (arrow) C:Identification of adipogenic differentiation of BMSCs (Oil red O ×200，bar=100 μm) Integrated fat granules were found in the cells and oil red O staining was positive (arrow) D:Identification of chondrogenic differentiation of BMSCs (Alcian blue ×200，bar=100 μm) Acid mucopolysaccharide was found in the cells and alcian blue staining was positive

流式細胞術鑒定結果顯示，第3代BMSCs中造血干細胞相關的表面抗原CD34、CD45和HLA-DR呈低表達，百分率分別為0.24%、0.45%和0.15%，表面抗原CD73、CD90和CD105呈高表達，百分率分別為97.90%、95.99%和96.97%，符合BMSCs的生物學特性，提示第3代BMSCs純度較高，可用于后續(xù)實驗(圖2)。

圖2 第3代BMSCs的表面抗原流式細胞檢測 BMSCs的造血干細胞相關表面抗原CD34、CD45和HLA-DR呈低表達，表面抗原CD73、CD90和CD105呈高表達 HLA-DR：人類白細胞DR抗原Figure 2 Assay of surface antigen of P3 BMSCs by flow cytometry The expression of hematopoietic stem cell-associated surface antigens CD73，CD90 and CD105 was enhenced，and the expression of CD34，CD46 and HLA-DR was weakened HLA-DR:human leukocyte antigen DR

2.2 MIO-M1細胞的Müller細胞及干細胞特征鑒定

MIO-M1細胞中Müller細胞標志蛋白SOX9和GS染色呈陽性表達，細胞骨架蛋白vimentin染色陽性，細胞質和細胞核CRALBP染色陽性(圖3)。同時貼壁培養(yǎng)的MIO-M1細胞中視網(wǎng)膜干細胞標志物SOX2、nestin和CHX10表達陽性；在干細胞誘導培養(yǎng)基中MIO-M1細胞可形成神經(jīng)球，同時表達干細胞標志物SOX2、CHX10和細胞增生標志物CCND3(圖4)，提示MIO-M1細胞具有干細胞特性。

圖3 MIO-M1細胞中Müller細胞標志物免疫熒光染色圖(×200，標尺=40 μm) A：SOX9蛋白免疫熒光染色 細胞核呈紅色熒光(Alexa Fluor 568) B:GS蛋白免疫熒光染色 細胞質呈綠色熒光(Alexa Fluor 488) C：Vimentin蛋白免疫熒光染色 細胞骨架呈紅色熒光(Alexa Fluor 568) D：CRALBP蛋白免疫熒光染色 細胞質和細胞核呈紅色熒光(Alexa Fluor 568) GS：谷氨酰胺合成酶；CRALBP：胞內(nèi)視黃醛結合蛋白Figure 3 Immunofluorescence staining of Müller cell markers in MIO-M1 cells (×200，bar=40 μm) A:Immunofluorescence staining of SOX9 protein Nuclei showed red fluorescence (Alexa Fluor 568) B:Immunofluorescence staining of GS protein Cytoplasm presented green fluorescence (Alexa Fluor 488) C:Immunofluorescence staining of vimentin protein Cytoskeleton exhibited red fluorescence (Alexa Fluor 568) D:Immunofluorescence staining of CRALBP protein Cytoplasm and nuclei both showed red fluorescence (Alexa Fluor 568) GS:glutamine synthetase;CRALBP:cellular retinaldehyde-binding protein

圖4 MIO-M1細胞干細胞標志物免疫熒光染色圖(×200，標尺=40 μm) A～C：貼壁培養(yǎng)的MIO-M1細胞表達干細胞標志物SOX2(Alexa Fluor 488)、nestin(Alexa Fluor 568)和CHX10(Alexa Fluor 568) D～F：MIO-M1神經(jīng)球表達細胞增生標志物CCND3(Alexa Fluor 488)和干細胞標志物SOX2(Alexa Fluor 488)、CHX10(Alexa Fluor 568) CCND3：細胞周期蛋白D3Figure 4 Immunofluorescence staining of stem cell markers in MIO-M1 cells (×200，bar=40 μm) A-C:The stem cell markers SOX2 (Alexa Fluor 488)，nestin (Alexa Fluor 568) and CHX10 (Alexa Fluor 568)，showed a positive expression in adherently incubated MIO-M1 cells D-F:The cell proliferation marker CCND3 (Alexa Fluor 488) and stem cell markers SOX2 (Alexa Fluor 488) and CHX10 (Alexa Fluor 568) were positively exprssed in MIO-M1 neurospheres CCND3:cyclin D3

2.3 各組MIO-M1細胞形態(tài)學特征比較

標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組細胞維持扁平細胞形狀，BMSC條件培養(yǎng)基組細胞形成細長的紡錘形或多極形態(tài)(圖5A)。定量形態(tài)學分析表明，各組細胞面積、圓度、伸長系數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=6.973，

P

=0.002；

F

=12.370，

P

<0.001；

F

=6.311，

P

=0.003)；與標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組比較，BMSC條件培養(yǎng)基組細胞面積減少，圓度降低，伸長系數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖5B～D)。各組細胞周長總體比較，差異無統(tǒng)計學意義(

F

=1.669，

P

=0.197)(圖5E)。

圖5 各組MIO-M1細胞形態(tài)變化 A：各組細胞骨架蛋白vimentin免疫熒光染色圖(Alexa Fluor 568 ×200，標尺=40 μm) BMSC條件培養(yǎng)基組細胞形成細長的紡錘形或多極形態(tài) B～E：各組細胞面積、圓度、伸長因子和周長定量分析 細胞面積：F=6.973，P=0.002.圓度：F=12.370，P<0.001.伸長因子：F=6.311，P=0.003.周長：F=1.669，P=0.197.與BMSC條件培養(yǎng)基組比較，a P<0.05(單因素方差分析，Tukey檢驗，n=30) BMSC：骨髓間充質干細胞Figure 5 Morphological changes of MIO-M1 cells A:Immunofluorescence staining of cytoskeleton protein vimentin in various groups (Alexa Fluor 568 ×200，bar=40 μm) The cells in BMSC conditioned medium group were slender spindle-shaped or multipolar B-E:Quantitative analysis of the morphological parameters Cellular area:F=6.973，P=0.002;Circularity: F=12.370，P<0.001;Elongation factor: F=6.311，P=0.003;Perimeter:F=1.669，P=0.197.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test, n=30) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

2.4 各組MIO-M1細胞增生能力變化

在去分化培養(yǎng)條件下，各組不同時間點神經(jīng)球面積總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=134.300，

P

<0.001；

F

=82.910，

P

<0.001)；BMSC條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)1、3和5 d時細胞形成的神經(jīng)球面積均較標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組大，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.01)(圖6，表2)。標準培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和BMSC條件培養(yǎng)基組EdU陽性細胞率分別為(43.38±3.25)%、(45.30±9.93)%和(67.69±15.65)%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=6.973，

P

=0.002)，其中BMSC條件培養(yǎng)基組EdU陽性細胞率明顯高于標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖7)。

圖6 各組MIO-M1細胞去分化誘導培養(yǎng)不同時間點神經(jīng)球大小變化(×100，標尺=200 μm) BMSC條件培養(yǎng)基組各時間點形成的神經(jīng)球面積較相應時間點標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組大 BMSC：骨髓間充質干細胞Figure 6 Changes of neurosphere size of MIO-M1 cells at different time points in different groups after dedifferentiation induction (×100，bar=200 μm) At different time points of dedifferentiation induction，the area of neurospheres of MIO-M1 cells formed in BMSC conditioned medium group was increased than standard medium group and 293T conditioned medium group BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

圖7 各組細胞EdU染色比較(×200，標尺=40 μm) BMSC條件培養(yǎng)基組EdU陽性細胞較標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組多 EdU染色呈綠色熒光(Azide 488)，細胞核呈藍色熒光(DAPI) EdU：5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽；BMSC：骨髓間充質干細胞Figure 7 Comparison of EdU-positive cells among different groups (×200，bar=40 μm) More EdU-positive cells were seen in BMSC conditioned medium group compared with standard medium group and 293T conditioned medium group EdU staining showed green fluorescence (Azide 488) in cytoplasm and blue fluorescence (DAPI) in the nuclei EdU:5-ethynyl-2'-deoxyuridine;DAPI:4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride;BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

表2 各組不同時間點神經(jīng)球面積比較(x±s,μm2)Table 2 Comparison of neurosphere area at various time points among different groups (x±s,μm2)組別樣本量不同時間點神經(jīng)球面積培養(yǎng)1 d培養(yǎng) 3 d培養(yǎng)5 d標準培養(yǎng)基組204 029±2 14716 411±7 13317 794±6 120293T條件培養(yǎng)基組203 832±1 72515 585±3 56216 286±4 415BMSC條件培養(yǎng)基組2011 497±6 164ab26 407±6 765ab34 214±9 345ab 注:F組別=134.300,P<0.001;F時間=82.910,P<0.001.與同時間點標準培養(yǎng)基組比較,aP<0.01;與同時間點293T條件培養(yǎng)基組比較,bP<0.01(兩因素方差分析,Tukey檢驗) BMSC:骨髓間充質干細胞 Note: Fgroup=134.300,P<0.001;Ftime=82.910,P<0.001.Compared with standard medium group, aP<0.01;compared with 293T conditioned medium group, bP<0.01 (Two-way ANOVA,Tukey test) BM-SC:bone marrow mesenchymal stem cell

各組MIO-M1細胞增生指數(shù)總體比較，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=74.110，

P

<0.001)，其中BMSC條件培養(yǎng)基組MIO-M1細胞的增生指數(shù)均高于標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖8，表3)。

圖8 不同培養(yǎng)基中MIO-M1細胞周期圖 BMSC條件培養(yǎng)基中細胞S期和G2/M期比率之和較標準培養(yǎng)基和293T條件培養(yǎng)基更高 A：標準培養(yǎng)基組 B：293T條件培養(yǎng)基組 C：BMSC條件培養(yǎng)基組Figure 8 MIO-M1 cell cycle in different groups The sum of S-phase and G2/M-phase cells proportion in BMSC conditioned medium group was higher than that in standard medium group and 293T conditioned medium group A:Standard medium group B:293T conditioned medium group C:BMSC conditioned medium group

2.5 各組MIO-M1細胞貼壁能力及VCAM-1表達比較

細胞接種于未包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4 h，光學顯微鏡下可見BMSC條件培養(yǎng)基組貼壁細胞較標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組多(圖9A)。BMSC條件培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組和標準培養(yǎng)基組培養(yǎng)上清液中VCAM-1質量濃度分別為(1 568.00±135.70)、(1 313.00±73.29)和(1 100.00±111.20)pg/ml，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=13.720，

P

=0.006)，其中BMSC條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)上清液中VCAM-1質量濃度明顯高于標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖9B)。BMSC條件培養(yǎng)基組、293T條件培養(yǎng)基組相對于標準培養(yǎng)基組細胞VCAM-1 mRNA相對表達量分別為1.80±0.46和1.08±0.08，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=7.896，

P

=0.021)；BMSC條件培養(yǎng)基組VCAM-1 mRNA相對表達量明顯高于標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(圖9C)。

圖9 各組MIO-M1細胞貼壁及VCAM-1表達水平比較 A：各組培養(yǎng)4 h細胞光學顯微鏡下觀察(×100，標尺=100 μm) BMSC條件培養(yǎng)基組貼壁細胞數(shù)較標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組多 B：各組培養(yǎng)上清液中VCAM-1質量濃度比較 F=13.720，P=0.004.與BMSC條件培養(yǎng)基組比較，a P<0.05(單因素方差分析，Tukey檢驗，n=3) C：各組細胞VCAM-1 mRNA相對表達量比較 F=7.896，P=0.021.與BMSC條件培養(yǎng)基組比較，a P<0.05(單因素方差分析，Tukey檢驗，n=3) BMSC：骨髓間充質干細胞;VCAM-1:血管細胞黏附分子-1 圖10 BMSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d MIO-M1細胞各視網(wǎng)膜神經(jīng)元標志物免疫熒光染色圖(×200，標尺=40 μm) A：PKCα B：Rhodopsin C：Tuj1 D：MAP2Figure 9 Comparison of MIO-M1 cell adhesion and VCAM-1 expression level among different groups A:Observation of MIO-M1 cells of different groups after 4-hour culture under an optical microscope (×100，bar=100 μm) There were more adherent MIO-M1 cells in BMSC conditioned medium group than standard medium group and 293T conditioned medium group B:Comparison of VCAM-1 mass concentration in MIO-M1 cell culture supernatants among different groups F=13.720，P=0.004.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test，n=3) C:Comparison of VCAM-1 mRNA relative expression level in MIO-M1 cells among different groups F=7.896，P=0.021.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test，n=3) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell;VCAM-1:vascular cell adhension molecule-1 Figure 10 Immunofluorescence staining of retinal neuron markers in MIO-M1 cells after 7-day culture of BMSC conditioned medium(×200，bar=40 μm) A:PKCα B:Rhodopsin C:Tuj1 D:MAP2

2.6 各組MIO-M1細胞分化能力比較

MIO-M1細胞誘導分化7 d，各組細胞均表現(xiàn)出神經(jīng)元形態(tài)，免疫熒光染色結果顯示分化細胞表達視網(wǎng)膜神經(jīng)元標志物PKCα、Rhodopsin、MAP2和Tuj1(圖10)。各組間PKCα、Rhodopsin、Tuj1和MAP2 mRNA相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=14.490，

P

=0.005；

F

=5.424，

P

=0.045；

F

=14.330，

P

=0.005；

F

=7.405，

P

=0.024)；BMSC條件培養(yǎng)基組PKCα、Rhodopsin、Tuj1和MAP2 mRNA相對表達量明顯高于標準培養(yǎng)基組和293T條件培養(yǎng)基組，差異均有統(tǒng)計學意義(均

P

<0.05)(表4)。

表4 不同分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后MIO-M1細胞各基因的mRNA相對表達量比較(x±s)Table 4 Comparison of mRNA relative expression levels of various genes in MIO-M1 cells cultured among different groups (x±s)組別樣本量各基因mRNA相對表達量PKCαRhodopsinTuj1MAP2標準培養(yǎng)基組31.00 1.00 1.00 1.00 293T條件培養(yǎng)基組31.09±0.131.21±0.371.25±0.090.77±0.17BMSC條件培養(yǎng)基組31.92±0.19ab1.97±0.546 7ab2.18±0.49ab2.15±0.69abF值14.4905.42414.3307.405P值0.0050.0450.0050.024 注:與標準培養(yǎng)基組比較,aP<0.01;與293T條件培養(yǎng)基組比較,bP<0.01(單因素方差分析,Tukey檢驗) BMSC:骨髓間充質干細胞;PKC:蛋白激酶 C;Tuj1:β-微管蛋白;MAP2:微管相關蛋白2 Note:Compared with standard medium group, aP<0.01;compared with 293T conditioned medium group, bP<0.01 (One-way ANOVA,Tukey test) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell;PKC:protein kinase C;Tuj1:β-tubulin;MAP2:microtubule-associated protein 2

3 討論

MIO-M1細胞是取自人類視網(wǎng)膜的一株永生化的Müller細胞系，具有Müller細胞和干細胞的特性，但低表達膠質纖維酸性蛋白，表明其在體外未被激活。MIO-M1細胞在體外具有較強的增生能力，能夠分化為多種視網(wǎng)膜神經(jīng)元。已有研究證明MIO-M1細胞可以整合到視網(wǎng)膜變性大鼠視網(wǎng)膜中并分化。此外，成人來源的視網(wǎng)膜細胞系避免了從胚胎或胎兒組織分離細胞的倫理問題。這些特性使MIO-M1細胞和相關細胞系成為視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病細胞替代療法中極具吸引力的候選者。有研究報道，MIO-M1細胞在大鼠青光眼模型中具有與視網(wǎng)膜整合并分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元的潛力。在本研究中，BMSC條件培養(yǎng)基處理的MIO-M1細胞在相同時間內(nèi)形成的神經(jīng)球面積較標準培養(yǎng)基和293T條件培養(yǎng)基更大，EdU陽性率更高，與細胞周期的增生指數(shù)一致，表明BMSC條件培養(yǎng)基對MIO-M1細胞增生有顯著促進作用。

微環(huán)境中相鄰分化細胞和細胞分泌因子的信號對干細胞的自我更新和多譜系分化起著重要作用。有研究報道BMSCs可能通過旁分泌細胞保護因子和有絲分裂因子對神經(jīng)元產(chǎn)生影響。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 條件培養(yǎng)基處理的MIO-M1細胞可分泌更多的VCAM-1。既往有研究表明VCAM-1除了促進細胞黏附外，還在促進細胞增生中發(fā)揮作用。推測BMSC條件培養(yǎng)基可能通過有絲分裂因子和黏附因子促進MIO-M1細胞黏附，有利于細胞生長。

視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病細胞替代治療的最佳目標是誘導干細胞或祖細胞分化成高比例的視網(wǎng)膜神經(jīng)元。本研究結果顯示，BMSC條件培養(yǎng)基組細胞誘導分化后高表達中間神經(jīng)元標志物PKCα和MAP2，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞標志物Tuj1和感光細胞標志物Rhodopsin，說明BMSC條件培養(yǎng)基可刺激MIO-M1細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞分化。這些結果與以往的研究結果一致，即BMSCs與NSCs體外共培養(yǎng)或BMSC條件培養(yǎng)基處理RPC時，均可以促進NSCs或RPCs的增生和神經(jīng)元分化。此外，有研究表明在BMSC條件培養(yǎng)基中加入睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CTNF)和bFGF抗體，RPC向神經(jīng)元分化的能力減弱，而在標準分化培養(yǎng)基中加入CNTF，RPCs視網(wǎng)膜神經(jīng)元標志物MAP2、Brn3a和Rhodopsin的表達水平明顯升高，推測BMSC條件培養(yǎng)基對MIO-M1細胞分化的影響可能是由CNTF介導的。

綜上所述，本研究結果表明BMSC條件培養(yǎng)基促進Müller細胞系MIO-M1細胞增生、黏附及神經(jīng)元的分化。該研究結果為提高視網(wǎng)膜祖細胞的活力和向神經(jīng)元分化的能力提供了一種新的策略，有利于視網(wǎng)膜干細胞的治療。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明

葛玲玲：醞釀和設計實驗，實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計分析；李沂鍵：實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析；黎其友：實施研究，采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析，行政、技術或材料支持；古賢梁：實施研究，采集數(shù)據(jù)，行政、技術或材料支持；黃小娜：實施研究；陶醉：醞釀和設計實驗，統(tǒng)計分析，對文章的知識性內(nèi)容作批判性審閱；徐海偉：醞釀和設計實驗，對文章的知識性內(nèi)容作批判性審閱，獲取研究經(jīng)費，指導實驗