王娜，韓海霞，鐘志明，王娟

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

紅樹莓(RubusidaeusL.)又名覆盆子，薔薇科懸鉤子屬類植物[1]，含有多種有益的化合物，包括必需礦物質(zhì)、維生素、脂肪酸和膳食纖維，以及廣泛的酚類化合物[2]，紅樹莓中酚類物質(zhì)有花青素、鞣花單寧、黃酮醇(槲皮素)、黃烷醇(兒茶素)、原花青素(原花青素B2)、羥基肉桂酸(沒(méi)食子酸)等，具有抗氧化、抗炎、抗菌的生物活性[3-4]。

酚類化合物對(duì)因產(chǎn)生過(guò)氧化作用而導(dǎo)致生物體在結(jié)構(gòu)和功能上損傷的DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基等有顯著的清除作用，還能與金屬形成螯合物，是天然的抗氧化劑[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物作為天然抗氧化劑對(duì)提高肉類和肉制品貨架壽命和脂質(zhì)穩(wěn)定性有積極的作用，同時(shí)還具有增強(qiáng)食品風(fēng)味、去除臭味等功能，在食品工業(yè)中應(yīng)用具有廣闊的前景。酚類化合物還能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控腫瘤抑制基因或致癌基因的表達(dá)等，具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗抑郁、抑菌、調(diào)節(jié)血脂和提高免疫力等生物學(xué)特性[6]。

盡管酚類化合物應(yīng)用廣泛，但其在水果和蔬菜中含量都較低。目前對(duì)紅樹莓中酚類化合物的含量和抗氧化能力的高低，以及對(duì)人類健康和營(yíng)養(yǎng)的好處還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用紫外分光光度法(ultraviolet absorption spectrophotometry，UV)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定紅樹莓凍干粉中酚類化合物含量，并研究其抗氧化的藥用價(jià)值，為紅樹莓凍干粉在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓凍干粉的制備：將購(gòu)于新疆伊犁的新鮮紅樹莓打漿后在-55 ℃冷凍干燥24 h，過(guò)80目篩，其質(zhì)量為紅樹莓鮮重的12.35%，呈淡紅色的狀態(tài)疏松，封裝備用。

標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素：均購(gòu)于成都麥德生科技有限公司；福林酚：購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：均購(gòu)于上海如吉生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：購(gòu)于天津市北辰方正試劑廠；超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀、DAD 檢測(cè)器；XPE105電子分析天平(0.01 mg) 梅特勒-托利多(上海)有限公司；80-1電動(dòng)離心機(jī) 金壇市恒豐儀器廠；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；KQ-250DE超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；YKW-303恒溫?fù)u床 長(zhǎng)沙永樂(lè)康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液前處理

準(zhǔn)確稱取1 g紅樹莓冷凍干燥粉于50 mL燒杯中，加入75%乙醇30 mL，封口，超聲提取20 min，離心15 min，即為樣品溶液。

1.3.2 總多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚比色法測(cè)定總多酚含量[7]。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量[8]。

1.3.4 花青素含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定花青素含量[9]。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素對(duì)照品適量，用二甲基亞砜溶解，制成濃度分別為沒(méi)食子酸6 μg/mL、兒茶素15 μg/mL、原花青素B220 μg/mL、蘆丁10 μg/mL、鞣花酸20 μg/mL、槲皮素0.5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.6 HPLC測(cè)定方法

沒(méi)食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素的測(cè)定方法：Target TC-18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動(dòng)相采用甲醇(A)-0.1% 甲酸(B)梯度洗脫，0～2 min，5% A→10% A；2～5 min，10% A→18% A；5～15 min，18% A →30% A；15～32 min，30% A→55% A；32～42 min，55% A→80% A；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為沒(méi)食子酸273 nm、兒茶素270 nm、原花青素B2280 nm、蘆丁390 nm、鞣花酸254 nm、槲皮素254 nm。

1.3.7 體外抗氧化活性

1.3.7.1 羥自由基清除能力的測(cè)定

參照蔡惠鈿等[10]的方法稍作修改。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照張玲玲等[11]的方法稍作修改。

1.3.7.3 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參照米雪等[12]的方法稍作修改。

1.3.7.4 還原能力的測(cè)定

參照米雪等的方法稍作修改。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV法測(cè)定總多酚、總黃酮和花青素含量

根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，以縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為沒(méi)食子酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。福林-酚比色法測(cè)得總多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0128X+0.0858，R2=0.9995，總多酚的含量為72.2 mg/g，高于Anttonen M J等測(cè)得的35.9 mg/g[13]；亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)得總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0106X+0.026，R2=0.9995，總黃酮含量為10.84 mg/g，高于Saifullah M等測(cè)得的4.1 mg/g[14]；pH示差法測(cè)得花青素含量為0.18 mg/g，低于Si Xu等測(cè)得的0.54 mg/g[15]。

2.2 HPLC法測(cè)定酚類物質(zhì)含量

2.2.1 線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表1可知，儀器精密度、重復(fù)性好，穩(wěn)定性和線性關(guān)系均良好，符合分析要求。

表1 線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果(n=6)Table 1 The linear relation, precision, repeatability and stability test results(n=6)

2.2.2 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的紅樹莓凍干粉末9份，每份約1.0 g，精密稱定。精密加入已知濃度的混合對(duì)照品溶液；按1.3.1項(xiàng)下方法制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品溶液，在1.3.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery rate test results of samples

由表2可知，6種多酚類成分的加樣回收率范圍在97.1%～99.3%，RSD均小于5%，其回收率和RSD符合分析的要求。

2.2.3 HPLC測(cè)定結(jié)果

取對(duì)照品和供試品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜超濾后進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。定量方法采用外標(biāo)法，結(jié)果見(jiàn)表3。

A

由表3可知，測(cè)得紅樹莓中的沒(méi)食子酸含量高于孟實(shí)等測(cè)得的0.14 μg/g[16]，但低于Mayara Schulza等測(cè)得的0.74 mg/g[17]；兒茶素低于孟實(shí)等測(cè)得的4.81 μg/g,但高于Mayara Schulza等測(cè)得的0.73 μg/g；原花青素B2低于孟實(shí)測(cè)得的1.92 μg/g；鞣花酸0.64 μg/g高于孟實(shí)測(cè)得的0.51 μg/g；槲皮素的含量低于Mayara Schulza等測(cè)得的1.5 μg/g；紅樹莓中蘆丁含量測(cè)定目前還未見(jiàn)報(bào)道，酚類物質(zhì)含量的差異可能是由于品種、環(huán)境和地理差異造成的。

表3 紅樹莓凍干粉的HPLC含量測(cè)定結(jié)果Table 3 The content determination results of Rubus idaeus L. lyophilized powder by HPLC

2.3 紅樹莓凍干粉體外抗氧化活性結(jié)果

2.3.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基具有很高的反應(yīng)活性，被認(rèn)為是對(duì)生物體有害的氧化劑。羥基自由基會(huì)嚴(yán)重破壞鄰近的生物分子，從而導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化破壞。因此，除去羥基自由基對(duì)于保護(hù)生命系統(tǒng)至關(guān)重要[18]。

由圖2可知紅樹莓凍干粉和對(duì)照VC對(duì)羥基自由基的清除能力。紅樹莓凍干粉的濃度從0.0625 mg/mL增加到1 mg/mL，與羥自由基清除能力表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在0.0625～0.25 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，紅樹莓凍干粉的羥基自由基清除能力高于VC，但隨著濃度的增大，紅樹莓的羥基自由基清除能力低于VC，當(dāng)紅樹莓凍干粉的濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到73.56%。由此可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，紅樹莓凍干粉的羥基自由基清除能力高于對(duì)照組VC。

圖2 紅樹莓凍干粉對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.2 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on hydroxyl radical

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是基于抗氧化劑的氫供體能力。它通過(guò)測(cè)量簡(jiǎn)單性，快速性和敏感性廣泛用于測(cè)試各種抗氧化劑樣品的抗氧化能力[19]。

由圖3可知紅樹莓凍干粉和對(duì)照Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明，紅樹莓凍干粉對(duì)DPPH自由基的清除能力具有濃度依賴性，當(dāng)紅樹莓凍干粉濃度從0.0625～1 mg/mL增加時(shí)，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，當(dāng)紅樹莓濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到73.84%，對(duì)照組Vc隨著濃度的升高其DPPH自由基的清除能力變化不顯著，而紅樹莓凍干粉對(duì)DPPH自由基的清除能力始終低于Vc。

圖3 紅樹莓凍干粉對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.3 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on DPPH radical

2.3.3 ABTS+·清除能力

ABTS法用于測(cè)定生物樣品的抗氧化能力。ABTS+·經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+·，向其中加入被測(cè)物質(zhì),如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色[20]。與其他幾種抗氧化能力的體外測(cè)定法相比，ABTS法快速、簡(jiǎn)便，與抗氧化劑的生物活性相關(guān)性強(qiáng)，因而被廣泛地應(yīng)用于物質(zhì)的抗氧化能力測(cè)定。

由圖4可知紅樹莓凍干粉和對(duì)照Vc對(duì)ABTS+·的清除能力。紅樹莓的ABTS+·具有濃度依賴性。當(dāng)紅樹莓凍干粉濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)到66.15%，但ABTS+·的清除率始終低于Vc。

圖4 紅樹莓凍干粉對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on ABTS+·

2.3.4 還原能力的測(cè)定

抗氧化劑與還原能力之間有直接的相關(guān)性，還原劑可以與某些過(guò)氧化物的前體反應(yīng)，防止了過(guò)氧化物的形成[21]。因此，化合物或提取物的還原能力是目前應(yīng)用最為廣泛的抗氧化活性的指標(biāo)之一。

由圖5可知紅樹莓凍干粉和對(duì)照Vc的還原能力，還原能力與紅樹莓凍干粉的濃度呈正相關(guān)。紅樹莓凍干粉濃度和VC濃度從0.0625～1 mg/mL，還原能力隨著濃度的增大而不斷增加，但是與VC的還原能力相比，紅樹莓凍干粉的還原能力始終低于VC。但紅樹莓凍干粉的濃度升高到一定程度之后是否會(huì)高于VC有待我們進(jìn)一步試驗(yàn)的驗(yàn)證。

圖5 紅樹莓凍干粉的還原能力Fig.5 The reducing power of Rubus idaeus L. lyophilized powder

2.4 紅樹莓凍干粉中酚類化合物與抗氧化活性的相關(guān)性分析

根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將紅樹莓凍干粉中的酚類物質(zhì)與抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 紅樹莓凍干粉中酚類化合物與抗氧化活性的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant activity of Rubus idaeus L. lyophilized powder

由圖6可知，原花青素B2與還原力和DPPH·呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.96。沒(méi)食子酸與羥基自由基呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為1；對(duì)ABTS+·與還原力呈負(fù)相關(guān)，分別為0.89和0.85。兒茶素與羥基自由基呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.94；與ABTS+·呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為1。蘆丁對(duì)羥基自由基呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為1；對(duì)ABTS+·呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.94。鞣花酸對(duì)羥基自由基、DPPH·、ABTS+·和還原力的影響均較小。槲皮素對(duì)ABTS+·呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.99；對(duì)羥基自由基呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.85。對(duì)羥基自由基影響最大的為蘆丁。對(duì)ABTS+·影響最大的為槲皮素和兒茶素，且槲皮素和兒茶素呈負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)為0.98。對(duì)還原力和DPPH·影響最大的為原花青素B2，且還原力和DPPH·呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為1。綜上可知，槲皮素、兒茶素、蘆丁和沒(méi)食子酸對(duì)ABTS+·和羥基自由基清除能力的影響較大，蘆丁、沒(méi)食子酸和原花青素B2對(duì)還原力和DPPH·的影響較大，而鞣花酸對(duì)抗氧化活性均無(wú)較大影響，說(shuō)明蘆丁和沒(méi)食子酸的含量對(duì)抗氧化活性的影響較為明顯，且蘆丁和沒(méi)食子酸的相關(guān)系數(shù)為0.99。

3 結(jié)論

近年來(lái)，隨著對(duì)具有抗氧化特性的水果生化含量的研究，人們對(duì)水果在人類健康和營(yíng)養(yǎng)中的重要作用有了更深入的認(rèn)識(shí)。本研究采用UV法和HPLC法測(cè)得紅樹莓凍干粉中總多酚、總黃酮和花青素含量分別為72.2，10.84，0.18 mg/L，6種酚類物質(zhì)含量高低為原花青素B2>鞣花酸>兒茶素>沒(méi)食子酸>蘆丁>槲皮素。在抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、兒茶素、蘆丁和沒(méi)食子酸對(duì)ABTS+·和羥基自由基清除能力的影響較大，而蘆丁、沒(méi)食子酸和原花青素B2對(duì)還原力和DPPH·的影響較大，而鞣花酸對(duì)抗氧化活性均無(wú)較大影響，說(shuō)明蘆丁和沒(méi)食子酸的含量對(duì)抗氧化活性的影響較為明顯，且蘆丁和沒(méi)食子酸的相關(guān)系數(shù)為0.99。這些結(jié)果突出了紅樹莓具有良好的抗氧化活性，所獲得的凍干粉可以被用作天然著色劑或抗氧化劑，并將其作為穩(wěn)定和多功能的成分被應(yīng)用于食品、化妝品和制藥工業(yè)。由此如果紅樹莓凍干粉作為功能性食品中的成分，它可能會(huì)產(chǎn)生很大的吸引力。