魏玉婷，劉善慮，張 博，房家立，王 荃，苗春暉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2.美國俄亥俄州立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，哥倫布 43210）

在病毒感染前期，人類的固有免疫應(yīng)答是抵抗病毒感染的第一道防御[1].有研究[2-3]指出，在抵抗病毒感染過程中固有免疫應(yīng)答可通過調(diào)控干擾素刺激基因ISG（包括ISG15、Tetherin、IFITM家族蛋白等）的表達(dá)，抑制病毒的入侵和復(fù)制.Viperin（virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum-associated，interferon-inducible）是一種在固有免疫應(yīng)答中由干擾素和病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有多種抗病毒功能的蛋白[4].人體中Viperin蛋白包含361個氨基酸，在結(jié)構(gòu)上主要由N端兩性的α螺旋結(jié)構(gòu)域、中間SAM結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域組成.N端結(jié)構(gòu)域是Viperin蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[5]，序列在不同物種間差異較大；中間SAM結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域在物種間非常保守，對Viperin蛋白的抗病毒活性同樣具有重要作用[6].近年來，有研究[7-8]表明，Viperin在許多物種（包括禽類、魚類、畜類等）中對病毒感染有強(qiáng)烈的抑制作用，但作用機(jī)制尚不明確.Lim等[9]研究發(fā)現(xiàn)，靈長類動物中Viperin參與物種進(jìn)化中的正向選擇，其變化位點(diǎn)可能與宿主和病毒間的相互作用密切相關(guān).多項研究[10-12]指出，某些抗病毒蛋白在非人類靈長類動物中的表達(dá)活性與在人類中的表達(dá)活性不同，且更加有效，如抗病毒蛋白PKR、Tetherin、TRIM5α以及APOBEC3G等.

細(xì)胞自噬是人體自我抵御外源病原體感染的主要手段之一，該過程可利用多種細(xì)胞因子識別入侵病原體，形成包裹病原體的自噬泡，以融合溶酶體的方式使病原體在自噬溶酶體中降解[13-14].在以往研究中，本課題組觀察到Viperin過表達(dá)的人腎臟上皮細(xì)胞HEK293中存在較多的囊泡，因此，推測Viperin可能對細(xì)胞自噬有調(diào)控作用，從而在固有免疫中發(fā)揮作用，并在物種進(jìn)化中參與靈長類動物進(jìn)化的正向選擇.本研究在人腎臟上皮細(xì)胞HEK293和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中，利用過表達(dá)、免疫熒光、Western blotting等分子生物學(xué)技術(shù)，比較分析Viperin在多個物種中對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為病毒治療的臨床研究提供新靶點(diǎn)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人腎臟上皮細(xì)胞HEK293、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，美國ATCC公司.

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基和RPMI培養(yǎng)基，美國Gibco Invitrogen公司；胎牛血清和磷酸鹽緩沖液，以色列Biolog-ical Industries公司；胰酶，加拿大MRC公司；RIPA裂解液，北京索萊寶科技有限公司；SDS上樣緩沖液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；xfect Transfection Reagent，北京TaKaRa公司；LC3B抗體、β-actin抗體和DAPI染料，美國Sigma-Aldrich公司；Beclin 1抗體和P62抗體，美國CST公司；mCherry-GFP-LC3質(zhì)粒，淼靈質(zhì)粒共享平臺；多個物種的Viperin質(zhì)粒，美國Michael Emerman實(shí)驗(yàn)室贈與.

1.1.3 儀器

1300 SERIES A2生物安全柜、FORMA Direct Heat CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Nano Drop2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；Amersham Imager 600超敏多靈敏成像儀，英國GE公司；Leica TCS SP8共聚焦熒光顯微鏡，德國Leica Microsystems公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，在RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)A549細(xì)胞，2種培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素合劑，培養(yǎng)箱條件：5%CO2、37℃.

1.2.2 細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將適量的HEK293細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后，更換為預(yù)熱至37℃的無血清DMEM培養(yǎng)基.每孔細(xì)胞用PEI試劑轉(zhuǎn)染0.5～1.0μg的Viperin質(zhì)粒，1μg質(zhì)粒的試劑用量為5μL.6 h后更換為含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染多種靈長類動物的Viperin，使用xfect polymer轉(zhuǎn)染試劑，1μg質(zhì)粒的試劑用量為0.3μL.

1.2.3 siRNA介導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白敲低

將適量的HEK293細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后更換為預(yù)熱至37℃的無血清DMEM培養(yǎng)基.每孔細(xì)胞用Lipofectamin 3000試劑轉(zhuǎn)染0.04 nmol siRNA，0.01 nmol siRNA的試劑用量為1μL，6 h后更換為含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.

1.2.4 Western blotting檢測

用PBS清洗細(xì)胞后棄掉上清液，加入RIPA裂解液，冰上放置20 min.在4℃下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液與SDS上樣緩沖液混合，100℃水浴10 min.樣品制成后，在恒壓100 V條件下，于12%或15%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h.然后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)于PVDF膜，恒壓100 V保持1 h.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在室溫下于5%脫脂奶/PBS中封閉1 h，然后加入相應(yīng)的一抗在4℃條件下孵育過夜.過夜之后，用0.1%TBS-T緩沖液洗膜3次，室溫下加入相應(yīng)的二抗保持1 h，用0.1%TBST緩沖液洗膜3次后曝光.

1.2.5 免疫熒光觀察LC3介導(dǎo)的自噬體形成

將適量HEK293細(xì)胞接種于4孔細(xì)胞培養(yǎng)小室中，24 h后更換為預(yù)熱至37℃的無血清DMEM培養(yǎng)基.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用PEI試劑共轉(zhuǎn)染300 ng mCherry-GFP-LC3B和500 ng Viperin，對照組細(xì)胞用空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染.48 h后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，棄上清液后加入DAPI，在室溫下避光孵育10 min進(jìn)行染核，之后用PBS清洗，采用共聚焦熒光顯微鏡觀察自噬體的形成.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用NIHImageJ software軟件（美國National Institutes of Health）檢測免疫印跡的條帶灰度值，并且對自噬體進(jìn)行計數(shù).

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，采用Student’sttest或ANOVA方法計算組間差異：P＜0.05，*；P＜0.01，**；P＜0.001，***.

2 結(jié)果與分析

2.1 Viperin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬蛋白LC3的脂化及P62的降解

在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的Viperin蛋白，48 h后細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志分子LC3與P62的表達(dá)情況如圖1所示.由圖1（a）可以看出，同對照組（轉(zhuǎn)染0 ng）相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中LC3-Ⅱ的含量隨著Viperin轉(zhuǎn)染量的增加而逐漸增加.從圖1（b）可以看出，500 ng實(shí)驗(yàn)組中LC3-Ⅱ的相對密度約為對照組的2倍（P=0.0015），表明Viperin使胞內(nèi)的LC3由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化，自噬體數(shù)量增多.自噬蛋白P62的含量逐漸減少，說明隨著自噬體的增多P62隨自噬流降解的效果增強(qiáng).

圖1 轉(zhuǎn)染Viperin蛋白后HEK293細(xì)胞內(nèi)LC3與P62的表達(dá)Fig.1 Expression of LC3 and P62 in HEK293 after transfection of Viperin

2.2 Viperin誘導(dǎo)自噬體形成

LC3-Ⅱ型增多可能是因?yàn)樾纬傻淖允审w數(shù)量增加或合成的自噬溶酶體數(shù)量減少[15].本研究通過免疫熒光技術(shù)觀察在Viperin過表達(dá)細(xì)胞中GFP-mCherry-LC3介導(dǎo)的自噬體的形成，結(jié)果如圖2所示.由圖2（a）可以看出，同對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Viperin的過表達(dá)不僅使雙色（黃色）的自噬體數(shù)量增加，而且使單色（紅色）的自噬溶酶體數(shù)量增加.從圖2（b）可以看出，實(shí)驗(yàn)組的黃色小體數(shù)量約為對照組的3倍，P=0.0453；實(shí)驗(yàn)組的紅色小體數(shù)量約為對照組的2倍，P=0.0053.以上結(jié)果表明，Viperin誘導(dǎo)了自噬體的形成，但并未抑制自噬溶酶體的形成.

圖2 Viperin對自噬體形成過程的誘導(dǎo)Fig.2 Induction of autophagosome formation by Viperin

2.3 Viperin促進(jìn)自噬核心蛋白Beclin 1的表達(dá)

Beclin 1復(fù)合物是自噬通路中自噬體形成的核心蛋白[16].轉(zhuǎn)染不同數(shù)量的Viperin后，A549細(xì)胞中自噬核心蛋白Beclin 1的表達(dá)情況如圖3所示.由圖3可以看出，隨著Viperin轉(zhuǎn)染量的增加，A549細(xì)胞中Beclin 1的表達(dá)量顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)了LC3的脂化.

圖3 轉(zhuǎn)染不同劑量的Viperin后自噬核心蛋白Beclin 1的表達(dá)Fig.3 Expression of autophagy core protein Beclin 1 after transfection of Viperin

2.4 敲低Beclin 1對Viperin誘導(dǎo)LC3脂化的抑制

用siRNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，敲低細(xì)胞內(nèi)的Be clin 1表達(dá)，結(jié)果如圖4所示.Western blotting結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染siRNA后，HEK293細(xì)胞中的Beclin 1的表達(dá)量明顯降低，Beclin 1的敲低降低了Viperin過表達(dá)細(xì)胞中LC3-Ⅱ的水平，該水平與對照組中的相近.這一結(jié)果也證實(shí)Viperin促進(jìn)了Beclin 1依賴的細(xì)胞自噬的形成.

圖4 敲低Beclin 1對Viperin誘導(dǎo)LC3脂化的抑制Fig.4 Knockdown of Beclin 1 inhibits lipidation of LC3 induced by Viperin

2.5 非人類靈長類動物中Viperin的生物學(xué)活性

與人類相比，非人類靈長類動物的ISG有更強(qiáng)的生物學(xué)活性，Viperin參與了包含人類在內(nèi)的靈長類動物的正向選擇[9].多種靈長類動物中Viperin對LC3和Beclin 1的作用結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出，在A549細(xì)胞中過表達(dá)不同物種的Viperin均會促進(jìn)LC3-Ⅱ型的表達(dá)，與人類的Viperin相比，非人類靈長類動物的Viperin作用更強(qiáng).同樣，在A549細(xì)胞中，非人類靈長類動物的Viperin對Beclin 1的誘導(dǎo)作用更強(qiáng).

圖5 多種靈長類動物中Viperin對LC3-Ⅱ和Beclin 1的作用Fig.5 Effects of Viperin on induction of LC3-II and Beclin 1 in different Primates

3 結(jié)論

本研究通過一系列過表達(dá)和敲低Viperin蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，證明Viperin在人表皮細(xì)胞中可以促進(jìn)Beclin 1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)了LC3的脂化，使自噬體形成，最終上調(diào)了細(xì)胞自噬的水平.近年來研究發(fā)現(xiàn)，Viperin對多種病毒的感染具有強(qiáng)烈抑制作用[17-18]，且抗病毒作用機(jī)制針對不同的病毒也各不相同.細(xì)胞自噬參與胞內(nèi)的多種活動，多種入侵的病毒可被其相關(guān)蛋白識別，進(jìn)而運(yùn)送到自噬溶酶體中降解[19-20]，從而起到對病毒的抵抗作用.本課題組針對Viperin是否影響細(xì)胞自噬的水平進(jìn)行初步探究.人類HEK293細(xì)胞中Viperin的表達(dá)水平極低，選取該細(xì)胞進(jìn)行Viperin蛋白的過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Viperin蛋白的表達(dá)水平和活性均較好，可促進(jìn)細(xì)胞中LC3的脂化，而且自噬體形成的效果比較明顯.同時，Viperin過表達(dá)細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白P62的減少證明了自噬流的增強(qiáng)，表明該細(xì)胞中LC3的脂化及自噬體形成的上調(diào)并非由自噬流的抑制作用導(dǎo)致.自噬體的形成與自噬相關(guān)蛋白（ATGs）及Beclin 1的作用密切相關(guān)[19].本研究發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞中Viperin可明顯促進(jìn)Beclin 1的表達(dá)上調(diào).進(jìn)一步通過siRNA敲低Beclin 1的水平，發(fā)現(xiàn)Beclin 1水平下降能夠抑制Viperin對細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用，證實(shí)Viperin是通過Beclin 1實(shí)現(xiàn)其上調(diào)細(xì)胞自噬的功能.

在Viperin進(jìn)化與功能相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，Viperin作為抗病毒蛋白在許多物種中均有表達(dá)[21-23]，其中，人類與猩猩的Viperin具有較高同源性[24]，而非人類靈長類動物中的Viperin同其他已報道的抗病毒蛋白一樣，與人類的同類抗病毒蛋白相比具有優(yōu)勢，這在一定程度上驗(yàn)證了抗病毒蛋白與物種進(jìn)化選擇的相關(guān)性.本研究在A549細(xì)胞中過表達(dá)了多種猴源和人源的Viperin蛋白，結(jié)果也證實(shí)了非人類靈長類動物中的Viperin促進(jìn)Beclin 1上調(diào)的作用較強(qiáng).