水稻中5個FT-Like家族成員的基因編輯突變體的創(chuàng)建與分析

王 鑫，楊曉穎，田 瑤，周詩晨，蘭志鵬，王馨翊，胡又川，梁閃閃，張泗舉，欒維江

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

水稻育種中，傳統(tǒng)育種方式和隨機(jī)突變方式均存在費(fèi)時、費(fèi)力、周期長等局限性.近年來，隨著基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中展現(xiàn)出的巨大應(yīng)用潛力，該技術(shù)在水稻育種中也得到了廣泛應(yīng)用[1-2].基因編輯技術(shù)能夠?qū)μ囟ɑ蚧蚧蛱囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行敲除、定點(diǎn)插入及替換[3]，導(dǎo)致基因發(fā)生突變，從而影響基因功能及生物學(xué)性狀.其中，第3代的簇狀規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas系統(tǒng)因具有結(jié)構(gòu)簡單、效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，迅速取代鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）技術(shù)，成為目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)[4].CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源于Ishino等首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一段具有串聯(lián)重復(fù)的特殊結(jié)構(gòu)，之后多位科學(xué)家在不同物種中發(fā)現(xiàn)存在類似的重復(fù)結(jié)構(gòu)[5]，將其命名為CRISPR序列.CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌中的一種獲得性免疫機(jī)制，其適應(yīng)性免疫過程分為3個階段：外源DNA的獲取、初級CRISPR RNA的成熟以及靶標(biāo)干擾，最終實(shí)現(xiàn)識別和降解外源DNA[6-7].由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向切割作用能夠?qū)崿F(xiàn)對生物體內(nèi)基因組的定向編輯，促進(jìn)靶基因突變，實(shí)現(xiàn)高效率定點(diǎn)突變，因此該技術(shù)在基因功能分析及調(diào)控、基因治療及作物改良等方面發(fā)揮著重要作用[8].科學(xué)家們已將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于擬南芥[9-11]、水稻[12-14]、煙草[15]、油菜[16]、玉米[17]、大豆[18]、番茄[19]等物種中，水稻中主要以單基因編輯為主[20-21].Cas9具有在同一個體中同時編輯多個位點(diǎn)的優(yōu)勢，可在特定區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)不同靶序列的多個sgRNA，將Cas9導(dǎo)向特定的對應(yīng)位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多基因編輯[22-23].CRISPR/Cas9多基因編輯技術(shù)已在多種植物中廣泛應(yīng)用，如擬南芥[24]、水稻[25-27]、大豆[28]、楊樹[29]等.由于sgRNA對靶序列的結(jié)合能力不同，因此每個靶點(diǎn)的編輯率可能存在差異.如Zeng等[26]在高產(chǎn)且耐寒性水稻的研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對穗長OsPIN5b、粒級GS3和耐寒OsMYB30這3個基因共設(shè)計(jì)6個靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，在最終獲得的轉(zhuǎn)基因株系T0代中，OsPIN5b-site1、OsPIN5b-site2、GS3-site1、GS3-site2、OsMYB30-site1和OsMYB30-site2的編輯率分別為53%、42%、66%、63%、63%和58%.CRISPR/Cas9還存在一定的脫靶率，例如Bao等[28]在對大豆植株的研究中，對其SPL9家族中的GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c和GmSPL9d基因同時編輯，共設(shè)計(jì)7個靶點(diǎn)，分析其后代的編輯類型時發(fā)現(xiàn)，第3個表達(dá)盒中GmSPL9a及GmSPL9b靶點(diǎn)和第4個表達(dá)盒中的GmSPL9d靶點(diǎn)均未發(fā)生基因編輯.

抽穗期是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵時期，成花素基因是決定水稻抽穗期的關(guān)鍵因子，隸屬于水稻FT-like亞家族.該亞家族共有13個成員，除了OsFTL2（Heading date 3a，Hd3a）和OsFTL3（RICE FLOWERING LOCUS T1，RFT1）的精確功能有明確報道外[30]，其他基因的功能尚不清楚.因此，本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對該亞家族中有高度同源性的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7以及OsFTL11基因進(jìn)行共編輯，創(chuàng)建五突突變體，為全面研究FT-like亞家族的功能提供材料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以粳稻（Oryza sativaspp.Japonica）品種中花11（Zhonghua11）為背景，獲得CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因材料.

1.2 靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)

FT-like家族成員OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7以及OsFTL11基因序列來自NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov），使用CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/）網(wǎng)站輔助設(shè)計(jì)靶點(diǎn).靶點(diǎn)片段大小為20 bp左右，選擇GC含量在40%～60%之間、具有（N）20NGG結(jié)構(gòu)特征的序列作為靶點(diǎn).之后對選擇的靶點(diǎn)進(jìn)行BLAST序列比對，選擇特異性高的靶點(diǎn)構(gòu)建載體.按照上述篩選原則，所選擇靶點(diǎn)的引物序列如表1所示.

表1 5個FT-like家族成員靶位點(diǎn)及引物序列Tab.1 Target sites and primer sequences of five FT-like members

1.3 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，將包含sgRNA和啟動子U6a、U6b、U3的載體作為模板，用5個靶點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將不同的靶基因序列整合到對應(yīng)基因的sgRNA表達(dá)盒中，將靶位點(diǎn)和sgRNA依次連接，構(gòu)建成為U6a：：6T1-sgRNA、U6b：：5T1-sgRNA、U6b：：4T1-sgRNA、U6c：：7T1-sgRNA以及U3：：11T1-sgRNA，使用BsaI和DNA連接酶將U6a：：T1-sgRNA、U6b：：T2-sgRNA、U6b：：T3-sgRNA、U6c：：T4-sgRNA和U3：：T5-sgRNA與CRISPR/Cas9載體進(jìn)行邊切邊連，最終將5個靶點(diǎn)裝載到CRISPR/Cas9目標(biāo)載體中.連接體系：1.5μL的10×CutSmart Buffer、1.5μL的10μmol/L ATP、3μL的CRISPR/Cas9載體、30 ng二輪產(chǎn)物、0.5μL的BsaI、0.5μL的T4 DNA ligase，ddH2O補(bǔ)至15μL.擴(kuò)增程序?yàn)椋?7℃5 min，10℃5 min，20℃5 min，15個循環(huán)，37℃5 min.

1.4 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化與組織培養(yǎng)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法[31]，將驗(yàn)證正確的重組載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，然后侵染野生型粳稻品種中花11的愈傷組織，再進(jìn)行篩選、分化、生根、煉苗等過程，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化材料.將其幼苗移栽，生長健壯后進(jìn)行表型觀察.

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測及突變類型

待轉(zhuǎn)化幼苗生長30 d后，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的方法提取水稻葉片基因組DNA.使用CRISPR/Cas9載體的抗性篩選標(biāo)記特異性引物（hyg-F和hyg-R）進(jìn)行分子檢測.用OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11靶位點(diǎn)的檢測引物（表2）對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行測序，并運(yùn)用BioXM2.6軟件和在線解碼工具DSDecode分析其序列，鑒定突變類型.

表2 靶位點(diǎn)的檢測引物序列Tab.2 Primer sequences of target sites detection

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-like亞家族的基因結(jié)構(gòu)與靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

本研究運(yùn)用MEGA軟件，采用Neighbor Joining法構(gòu)建水稻FT-like家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1（a）所示.由圖1（a）可以看出，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11均屬于FT-like亞家族的同一個分支，具有較高的同源性.此外，它們的基因結(jié)構(gòu)相似，均含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，且氨基酸的一致性達(dá)到82.49%，如圖1（b）所示.推測這些成員的功能可能冗余，因此構(gòu)建了5個基因的共編輯材料，以期進(jìn)行功能研究.

圖1 FT-like家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹和氨基酸序列比對Fig.1 Phylogenetic tree and amino acid sequence alignment of FT-like family genes

2.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的原則，在基因的外顯子上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn).其中，OsFTL4、OsFTL7和OsFTL11的靶點(diǎn)均位于各自的第4個外顯子上，OsFTL5和OsFTL6的靶點(diǎn)均位于各自的第1個外顯子上，5個成員具體的基因結(jié)構(gòu)和靶位點(diǎn)如圖2所示.

圖2 5個FT-like家族成員的基因結(jié)構(gòu)與靶位點(diǎn)Fig.2 Gene structure and target loci of five FT-like members

將5個靶點(diǎn)分別連接到sgRNA表達(dá)盒中，最后組裝到CRISPR/Cas9載體中，獲得重組載體.通過菌落PCR驗(yàn)證獲得的重組載體，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出了預(yù)期的目的片段，PCR鑒定結(jié)果如圖3（a）所示.對重組載體進(jìn)行酶切鑒定，確定得到了正確的目的條帶，酶切鑒定結(jié)果如圖3（b）所示.上述結(jié)果表明5個成員的靶點(diǎn)均已連入到目的載體中，之后將驗(yàn)證正確的重組載體質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).

圖3 5個FT-like家族成員的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建Fig.3 Construction of CRISPR/Cas9 vector for five FT-like members

2.3 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及編輯類型的分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，通過種植獲得T2代轉(zhuǎn)基因植株.對T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測以及測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編輯突變體的突變類型主要為osftl4osftl5osftl6三突變體（triple mutant，tm）、osftl4osftl5osftl6osftl11四突變體（quadruple mutant，qm）及osftl4osftl5osftl6osftl7osftl11五突變體（penta mutant，pm）.

tm突變體有2個等位突變（tm1和tm2）.tm1突變體中，OsFTL4基因在PAM區(qū)下游3 bp處插入1個A堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前3 bp處插入1個T堿基，OsFTL6基因在PAM區(qū)前4 bp處插入1個T堿基，如圖4（a）所示.tm2突變體中，OsFTL4基因在PAM區(qū)下游3 bp處插入1個A堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前4 bp處缺失8個堿基且存在2處堿基替換（G-T、T-G），OsFTL6基因在PAM區(qū)前2 bp處缺失2個堿基，如圖4（b）所示.

qm突變體有3個等位突變，分別為qm1、qm2和qm3.qm1中，OsFTL4基因在PAM區(qū)下游3 bp處插入1個A堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前4 bp處缺失27個堿基，OsFTL6基因在PAM區(qū)前4 bp處插入1個T堿基，OsFTL11基因在PAM區(qū)前4 bp處缺失1個堿基，如圖4（c）所示.qm2中，OsFTL4基因在PAM區(qū)下游3 bp處插入1個T堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前4 bp處缺失47個堿基，OsFTL6基因在PAM區(qū)前發(fā)生1個堿基的替換且在PAM區(qū)前3 bp處缺失38個堿基并插入3個堿基，OsFTL11基因在PAM區(qū)前2 bp處缺失2個堿基，如圖4（d）所示.qm3中，OsFTL4基因在PAM下游區(qū)3 bp處插入1個C堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前5 bp處缺失44個堿基，OsFTL6基因在PAM區(qū)前2 bp處缺失3個堿基，OsFTL11基因在PAM區(qū)前3 bp處缺失3個堿基，如圖4（e）所示.

pm突變體中，OsFTL4基因在PAM區(qū)下游3 bp處存在1個雜合編輯，一條鏈插入1個C堿基，另一條鏈插入1個A堿基，OsFTL5基因在PAM區(qū)前3 bp處缺失1個T堿基，OsFTL6基因在PAM區(qū)前2 bp處缺失3個堿基，OsFTL7基因在PAM區(qū)前12 bp處缺失10個堿基，OsFTL11基因在PAM區(qū)前2 bp處缺失2個堿基，如圖4（f）所示.

圖4 編輯突變體的測序分析Fig.4 Sequencing analysis of editing mutants

qm突變體中，OsFTL5基因有大片段缺失的突變類型，用3%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖5所示.

圖5 qm突變體中OsFTL5基因大片段缺失突變的PCR檢測Fig.5 PCR detection of mutation with large deletion of OsFTL5 in qm mutants

20個突變植株中，有4株結(jié)果顯示為44 bp的純合缺失，片段大小為797 bp；有3株為雜合突變，2條鏈的片段大小分別是841 bp和797 bp，與測序結(jié)果一致.

2.4 突變體的氨基酸序列分析

對突變體的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示.OsFTL4的氨基酸序列由于單堿基的插入，在tm、qm和pm突變體中都發(fā)生了氨基酸的移碼，從第114個氨基酸開始移碼，直到終止密碼子.OsFTL5的氨基酸序列由于堿基的替換、插入及缺失，在tm、qm及pm突變體中都發(fā)生了氨基酸的移碼，從第49個氨基酸開始移碼，直到終止密碼子，tm和pm突變體中因堿基發(fā)生變化造成翻譯提前終止，產(chǎn)生了截短的蛋白，而qm突變體中因堿基的大片段缺失而造成氨基酸序列的缺失.OsFTL6的氨基酸序列因堿基的替換、插入及缺失等，在tm、qm及pm突變體中發(fā)生了氨基酸的移碼，從第41個氨基酸開始移碼，直到終止密碼子.其中，在tm1、qm1、qm2突變體中，由于堿基的插入，造成翻譯提前終止，產(chǎn)生了截短的蛋白；而tm2、qm3、pm因3個堿基的缺失而導(dǎo)致缺失1個氨基酸.OsFTL7的氨基酸序列因堿基的大片段缺失，在pm突變體中發(fā)生了氨基酸的移碼，從第113個氨基酸開始移碼，并出現(xiàn)了氨基酸的缺失，直到終止密碼子.OsFTL11的氨基酸序列因堿基的替換、插入及缺失，在tm、qm和pm突變體中發(fā)生了氨基酸的移碼，從第41個氨基酸開始移碼，直到終止密碼子.其中，在tm1、qm1、qm2突變體中，由于堿基的插入，造成翻譯提前終止，產(chǎn)生了截短的蛋白；而tm2、qm3、pm因3個堿基的缺失而導(dǎo)致缺失1個氨基酸.

圖6 tm、qm和pm突變體中氨基酸序列的分析Fig.6 Analysis of amino acid sequence in tm，qm and pm mutants

2.5 突變體的表型分析

對田間T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察后發(fā)現(xiàn)，tm、qm、pm突變體都出現(xiàn)了葉片早衰的表型，主要表現(xiàn)為葉片卷曲及黃化.黃化從葉尖及葉片邊緣開始向葉片中部蔓延，最后從葉尖開始干枯，如圖7所示.tm、qm、pm突變體均出現(xiàn)葉片早衰癥狀，說明OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7、OsFTL11這5個基因可能存在一定的冗余，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6的突變就可以導(dǎo)致葉片早衰表型.tm、qm、pm突變體中共編輯的基因?yàn)镺sFTL4、OsFTL5、OsFTL6，這3個成員中某一成員或者二個成員突變是否就可以引起葉片早衰的表型，還需要進(jìn)一步產(chǎn)生這3個成員各自的單突變體及其相互的雙突變體才能確定.

圖7 野生型與突變型植株的表型Fig.7 Phenotypes of wild type and mutant plants

3 討論

水稻抽穗期是影響產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀.抽穗太早，植株?duì)I養(yǎng)生長不足，庫源不能平衡；抽穗太晚，則容易導(dǎo)致植物遭受低溫冷害.成花素是調(diào)控抽穗的關(guān)鍵因子，主要在葉片中合成，之后轉(zhuǎn)運(yùn)到頂端分生組織.成花素屬于FT-like亞家族，該家族的13個成員中，OsFTL2/Hd3a和OsFTL3/RFT1分別在短日照和長日照條件下發(fā)揮成花轉(zhuǎn)變作用[32].近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Tlike亞家族中有些成員也發(fā)揮著促進(jìn)抽穗或者抑制抽穗的作用，如OsFTL10過量表達(dá)會促進(jìn)水稻抽穗[33]，OsFTL12過量表達(dá)則會抑制水稻抽穗.此外，Wang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，GmFT在大豆根瘤固氮過程中發(fā)揮著重要作用，表明FT-like家族的功能并不局限在開花期調(diào)控上.本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻中具有高度同源性的5個FT-like亞家族成員進(jìn)行共編輯，并對突變體植株測序分析，得到osftl4osftl5osflt6三突變體、osftl4osftl5osflt6osftl11四突變體及osftl4osftl5osflt6osftl7osftl11五突變體，突變類型主要表現(xiàn)為堿基的插入和缺失.這些突變會導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而影響基因功能.對突變體的農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)突變體植株均出現(xiàn)了不同程度的早衰表型，推測這5個成員在功能上可能存在冗余，影響植物的生長發(fā)育，產(chǎn)生早衰現(xiàn)象，也可能這5個成員中某一個基因發(fā)生突變就可產(chǎn)生早衰表型.通過分析發(fā)現(xiàn)，tm、qm及pm突變體中，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6基因都發(fā)生了編輯，是否3個基因中的某個基因突變就會導(dǎo)致早衰表型，還需進(jìn)一步創(chuàng)建單個基因編輯的突變體進(jìn)行驗(yàn)證.綜上所述，本研究為FT-like亞家族5個成員的基因功能的研究提供了實(shí)驗(yàn)材料，也為后續(xù)的農(nóng)作物的抽穗期性狀改良提供了基礎(chǔ)及依據(jù).