禤淑霞 謝小雷 陳晨 劉艷枚 林金端 李付廣 潘意珍 湯巧敏 尹衛(wèi)國

1997年Lo 等［1］發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在胎兒游離DNA（cell?free fetal DNA，cffDNA），2008年提出應(yīng)用高通量測序（Next?generation Sequencing，NGS）技術(shù)對cffDNA 進行檢測，經(jīng)生物信息學(xué)分析評估胎兒患常見染色體非整倍體風(fēng)險的方法［2］，即無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)（Non?invasive prenatal test?ing，NIPT）。2012年，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（Amer?ican College of Obstetricians and Gyencologists，ACOG）聲明NIPT 可用于胎兒罹患染色體非整倍體疾病的高風(fēng)險人群［3］，這是國外最早明確NIPT用途的指南。在國內(nèi)，2016年國家衛(wèi)健委明確將NIPT 檢測技術(shù)作為介于血清學(xué)篩查和羊水穿刺染色體核型分析之間的二次篩查手段，是對常規(guī)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)的有益補充［4］。

隨著NIPT 的深入研究及技術(shù)優(yōu)化，國內(nèi)外對NIPT 的臨床應(yīng)用共識也在不斷改變、調(diào)整、細化。NIPT 應(yīng)用人群從指定的唐篩高風(fēng)險人群擴展到普通人群，而慎用人群中的雙胎妊娠也更改為適用人群［5?6］。但隨之而來的問題也浮現(xiàn)，例如NIPT 能否取代血清學(xué)篩查作為一線篩查技術(shù)，是否應(yīng)用于性染色體異常（Sex Chromosome Aneuploidies，SCA）以及罕見染色體非整倍體（Rare autosomal trisomies，RATs）篩查等，甚至存在NIPT 可以代替產(chǎn)前診斷的誤解。因此，如何更好地將NIPT 應(yīng)用于不同人群的產(chǎn)前篩查，降低畸形出生率，是每一位產(chǎn)前診斷工作者面臨的挑戰(zhàn)。

本研究通過分析NIPT 檢測結(jié)果，結(jié)合NIPT高風(fēng)險孕婦的羊水細胞核型分析，對NIPT 低風(fēng)險人群進行產(chǎn)前及產(chǎn)后隨訪，評價NIPT 并技術(shù)對不同染色體異常的陽性預(yù)測值（PPV），以及不同臨床指征中的陽性檢出率，評價NIPT 在產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2017年10月至2021年6月在清遠市人民醫(yī)院行NIPT 檢測的孕婦6 535 例，納入標準：孕周12周以上，單雙胎，因臨床或個人要求行NIPT 在研究截止時已得知妊娠結(jié)局。排除標準：曾有染色體異常分娩史；夫妻一方有明確染色體疾?。辉袐D一年內(nèi)接受過異體輸血；移植手術(shù)；細胞治療或接受過免疫治療等可能對高通量測序結(jié)果造成干擾的；胎兒B 超懷疑有異常的；各種基因病的高風(fēng)險人群［4］。納入的例數(shù)中，6 446 例為單胎妊娠，89 例為雙胎妊娠；6 403 例為自然受孕，132 例為輔助生殖受孕。孕婦年齡平均（30.00±4.94）歲；孕周平均（17.20±4.19）周。所有受檢者均經(jīng)過充分咨詢，自愿選擇NIPT 并簽署知情同意書。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審批通過。

1.1.1 臨床指征分組

將所有孕婦按照不同指征進行分組［7］。第一組：①高齡組，即孕婦預(yù)產(chǎn)年齡≥35 歲。②低齡組，孕婦產(chǎn)齡<35 歲；第二組：①唐篩高風(fēng)險組：經(jīng)血清學(xué)篩查，21 三體的截斷值≤270，18 三體的截斷值≤350。②唐篩臨界風(fēng)險組：經(jīng)血清學(xué)唐氏篩查，21 三體270<截斷值≤1 000，18 三體350<截斷值≤1 000。③唐篩單指標異常組：經(jīng)血清學(xué)三聯(lián)或四聯(lián)篩查，AFP、β?HCG、uE3、PAPPA（四者任一）的MoM 值偏高或偏低；第三組：①超聲軟指標異常組：經(jīng)B 超檢測發(fā)現(xiàn)NT 增厚或臨界性增厚、脈絡(luò)叢囊腫、鼻骨偏短、胎兒生長受限、側(cè)腦室增寬、心室強回聲光點、腸回聲增強等情況。②不良生育史組：曾有不良生育情況的人群。③無臨床指征但要求NIPT 組：無臨床指征，但孕婦自己要求做NIPT 檢測的人群，其中包括未行血清學(xué)篩查、輔助生殖（IVF）及雙胎人群。

1.2 試劑及儀器

胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒（100 人份/盒）購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司（國械注準：20153400461）。主要儀器包括貝瑞和康Illumina NextSeq CN500 高通量測序儀。核型分析采用以色列BI 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，使用ZEISS Axio Image.Z2 全自動顯微鏡進行掃片分析。

1.3 檢測方法

1.3.1 NIPT 檢測

以血漿游離DNA 采血管（Cell Free DNA BCT）采集孕婦外周血8～10 mL，4 h 內(nèi)分離血漿。取1.2 mL 血漿提取胎兒游離DNA、構(gòu)建文庫、定量、高通量測序及生物信息學(xué)分析，計算每條染色體的Z值；當Z值≥3 為三體高風(fēng)險，當Z值<3 為三體低風(fēng)險。生物信息學(xué)分析由北京貝瑞和康基因有限公司完成。

1.3.2 羊水細胞染色體核型分析

對于NIPT 檢測提示胎兒存在21 三體綜合征（21?trismy sydrome，T21）、18 三體綜合征（18?tris?my sydrome，T18）、13 三體綜合征（13?trismy sy?drome，T13）及性染色體異常的高風(fēng)險孕婦，建議進行羊水穿刺。取羊水細胞，均分為2 管，1 800 r/min離心12 min 后取細胞懸液1.5 mL，采用平行雙線分別接種，37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)7 d，經(jīng)換液、轉(zhuǎn)種，約10 d 左右根據(jù)細胞生長情況收取細胞。以秋水仙堿終止羊水細胞生長、刮取細胞、低滲、預(yù)固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及Giem?sa 染色制備羊水染色體片，以ZEISS Axio Image.Z2 掃片。每個標本至少計算30 個分裂相，分析5個完整核型。

1.4 追蹤隨訪

跟蹤隨訪高風(fēng)險孕婦的妊娠結(jié)局；對低風(fēng)險孕婦，進行產(chǎn)前產(chǎn)后隨訪，判斷有無其他異常情況或假陰性的情況出現(xiàn)，以分娩后無異常為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；計量資料采用（±s）表示，計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NIPT 檢測結(jié)果

6 535例孕婦中共有88 例NIPT 高風(fēng)險，檢出率為1.35%。見表1。

表1 NIPT 篩查胎兒染色體非整倍體的檢測結(jié)果［n（%）］Table 1 Detection results of fetal chromosome aneuploidy screened by NIPT［n（%）］

2.2 不同臨床指征的檢測率對比

各組間的陽性檢出率，高齡組和低齡組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；唐篩高風(fēng)險和唐篩臨界風(fēng)險及單指標異常比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不良生育史和超聲軟指標及要求NIPT 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同臨床指征的NIPT 檢測情況比較Table 2 Comparison of NIPT detection of different clinical indications

2.3 隨訪情況

所有經(jīng)羊水細胞核型確診者中，除1 例47，XYY 選擇繼續(xù)妊娠且分娩后新生兒無明顯異常，其余均選擇終止妊娠；確診為正常核型的孕婦繼續(xù)妊娠至分娩，其中2 例NIPT 提示SCA 但核型正常者，分娩后孩子分別為外耳畸形（隱耳）、卵圓孔未閉，其余均正常。NIPT 低風(fēng)險孕婦的后續(xù)產(chǎn)檢無異常，新生兒出生后無異常，未見假陰性。

3 討論

本研究分析了6 535 例孕婦外周血樣本，NIPT提示高風(fēng)險的有88 例，檢出率為1.35%，與文獻報道（1.41%）相符［8］。其中68 例經(jīng)羊水細胞分析，21 三體、18 三體、13 三體的PPV 分別為72%、83.3%、0%，低于相關(guān)國外報道（99.17%，98.24%，100%）［9］，但與國內(nèi)報道的結(jié)果相近（84.21%，75%，0%）［10］。分析其原因，一方面，本研究中假陽性病例的的Z 值都處于［?6，6］之間，其中［?5，5］之間的有8 例。研究表明NIPT 真實性與Z 值的大小相關(guān)，Z 值越大，胎兒染色體非整倍體的風(fēng)險越大［11］。另一方面，假陽性與孕婦自身因素如惡性腫瘤、染色體變異、拷貝數(shù)變異、母體嵌合，以及雙胎消失綜合征、胎盤嵌合等因素有關(guān)［12?13］。此外，檢出的例數(shù)較少也可能造成數(shù)據(jù)差異，特別是13 三體只檢出3 例。

SCA 的PPV 為40%，對于45，X 的檢出率較低（3/10），結(jié)果與國內(nèi)外報道的文獻結(jié)果（33.3%～47%）有較高的一致性［10，14］。性染色體較常規(guī)染色體的PPV 低，可能與GC 含量的偏向性有關(guān)，可通過改進染色體內(nèi)標參照方法、分析胎兒特異性甲基化DNA 比例差異，從而修正GC 含量，減小變異系數(shù)，進而提高性染色體檢出率［15］。

RTAs 的PPV 約為7.14%（1/14），與文獻報道（9.38%）接近［16］。RTAs 的致病性多為不明確，可能與胎盤嵌合或單親二倍體有關(guān)［17］。因其檢測的有效性差及致病性的不明確，在實際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)以下的原則進行補充報告：①該變異有明確的致病性，有相關(guān)報道及處理方案；②對病人進行充分的遺傳咨詢，以免造成孕婦不必要的心理負擔(dān)及增加穿刺率甚至引產(chǎn)率。經(jīng)隨訪未發(fā)現(xiàn)假陰性。假陰性主要是由于cffDNA 濃度過低（<4%）［13，18］，在實際應(yīng)用中可通過加強質(zhì)控、優(yōu)化NIPT 管理流程及技術(shù)［19?21］，加強孕期各指標的全流程監(jiān)控，降低假陰性的風(fēng)險。

高齡組、唐篩高風(fēng)險組的PPV 和其他分組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明［22?23］，高齡產(chǎn)婦由于卵細胞質(zhì)量下降，生殖功能減退、生殖細胞或受精卵易發(fā)生染色體畸變或不分離等原因，導(dǎo)致胎兒染色體異常的發(fā)生率較高，特別是21?三體的檢出率明顯增高（35.48%～45.20%）。唐篩高風(fēng)險組的PPV 為1.46%，檢出的9 例中只有5 例確診，若以NIPT 為二線篩查，可大幅減少羊水穿刺的案例，避免因入侵性檢測（約0.4～1%的概率）造成的流產(chǎn)［24］。經(jīng)超聲檢測異常的孕婦，聯(lián)合NIPT 檢測，可提高胎兒染色體異常的檢出率［25］。值得注意的是，NIPT 不能檢測染色體結(jié)構(gòu)異常，當NIPT 為低風(fēng)險但超聲檢查為結(jié)構(gòu)異常時，建議孕婦行進一步的檢查或產(chǎn)前診斷［4］。目前也有關(guān)于NIPT 雙胎妊娠和IVF 人群的應(yīng)用研究［26］，其檢出率也能達到70%～80%，但仍需解決cffDNA 中位值較低，取樣失敗率較高等問題［27?28］。

綜上所述，NIPT 可檢測全部染色體非整倍體，提高了檢出率，既可作為減少侵入性的二次產(chǎn)前篩查，也可作為一線的產(chǎn)前篩查方法。但由于NIPT 存在假陽性及假陰性的情況，13號染色體的PPV較低，性染色體異常及其他染色體異常的檢出也有待完善及優(yōu)化。高齡及唐篩高風(fēng)險人群患染色體異常疾病的風(fēng)險升高，應(yīng)重點關(guān)注NIPT 在此類人群中的應(yīng)用。NIPT 高風(fēng)險的孕婦仍需要核型分析或基因芯片分析，不能作為產(chǎn)前診斷的確認方法。臨床應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實際情況，多種產(chǎn)前篩查方法聯(lián)合應(yīng)用，有助于及早發(fā)現(xiàn)罹患染色體病的胎兒，降低出生缺陷率。