呂海燕 侯廣玉 朱 梅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，牡丹江 157011)

帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是常見于中老年人群的神經(jīng)退行性疾病，患病率隨年齡增加逐步增高[1]，大約有1% 的 60歲以上的人受到 PD 的影響，80 歲以上人群患病率約為3%[2-3]，相關(guān)研究[4]數(shù)據(jù)顯示，我國 PD 患者高達(dá)1.7%，PD 其他相關(guān)疾病的發(fā)病率也隨著年齡的增長而增加。PD 主要病因是黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)以多巴胺(dopamine, DA)合成減少，神經(jīng)生化發(fā)生改變，多巴胺能神經(jīng)元變性壞死會導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺含量顯著減少。目前沒有有效方法治愈 PD 病變，為更好地研究其發(fā)病機制及臨床治療，制備實驗?zāi)Ｐ统蔀楸夭豢缮俚难芯渴侄?。神?jīng)毒素在動物模型中誘導(dǎo) PD 的特定臨床特征，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine,MPTP)、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、百草枯和魚藤酮[5]。PD 模型各有優(yōu)點和不足，不同造模方法、給藥方式及劑量都會影響實驗?zāi)Ｐ偷淖饔脵C制與實驗結(jié)果。本文主要針對 MPTP 誘導(dǎo)的 PD 動物模型進(jìn)行闡述。

1 帕金森病的動物模型

PD病理生理機制復(fù)雜，動物模型不能完全模擬出全部的病理和疾病癥狀。目前PD 動物模型主要為三類：神經(jīng)毒素模型(如：MPTP、6-OHDA、魚藤酮、百草枯等)、轉(zhuǎn)基因模型(如：parkin、PINK1 和 DJ-1) 及以上二者聯(lián)用模型。PD模型在一定程度上再現(xiàn)了其主要病理生理特征，包括黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta，SNc) DA能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失、路易小體 (Lewy body，LB)形成和運動缺陷等[6]。6-OHDA模型可單雙側(cè)造模，但不能透過血-腦屏障，一般適用于藥理學(xué)篩選藥物。魚藤酮模型中毒素直接進(jìn)入 DA 能神經(jīng)元，高劑量造模會導(dǎo)致毒性作用大、副作用大、后遺癥多，主要用于研究 DA 能通路中的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎性反應(yīng)[7]。百草枯模型符合環(huán)境因素誘發(fā)的 PD 研究，雖然PD模型行為學(xué)改變更顯著，但是模型制備成功率較低。遺傳基因動物模型的制備時間長、過程復(fù)雜、副作用多，從研究 PD的病理變化以及從基因分子水平為PD發(fā)病機制提供研究基礎(chǔ)。MPTP模型呈現(xiàn) PD 急性或亞急性過程，可造成 DA 能神經(jīng)元損傷或壞死而導(dǎo)致PD的部分臨床癥狀發(fā)生，經(jīng)小劑量持續(xù)MPTP給藥制備的慢性動物模型不僅出現(xiàn)急性模型的PD病理改變，還能觀察到 α-突觸核蛋白的聚集，甚至有研究發(fā)現(xiàn)了LB 樣包涵體[8]。

2 MPTP的發(fā)現(xiàn)及毒性作用機制

MPTP是一種人工化學(xué)合成的中間產(chǎn)物，具有海洛因樣作用，美國國家心理健康研究所最早發(fā)現(xiàn)它的神經(jīng)毒性和其他哌替啶衍生物[9]。1983 年美國加州少數(shù)披頭士服用了被 MPTP 污染的毒品后，出現(xiàn)了類似 PD 的臨床癥狀，繼而發(fā)展成為不可逆的亞急性帕金森綜合征[10]。

MPTP 作為一種鎮(zhèn)痛劑的脫羧雜質(zhì)，是一種本身沒有毒性的脂溶性有機化合物，非常容易通過血-腦屏障。MPTP 選擇性地經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體外膜的單胺氧化酶-B (monoamine oxidase-B, MAO-B) 催化為中間代謝產(chǎn)物1-甲基-4苯基-2，3-二氫呲啶離子 (MP-DP+) ，然后該中間體再經(jīng)過進(jìn)一步自發(fā)氧化生成有毒代謝物 MPP+[11]。因化學(xué)結(jié)構(gòu)與 DA 相似，MPP+可與多巴胺能轉(zhuǎn)運體 (dopamine transporter, DAT) 高度親和[12-13]?；钚孕问?MPP+通過 DAT 進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元后加速積聚，隨著濃度梯度積累，該物質(zhì)能夠抑制線粒體復(fù)合物 I活性，干擾并阻斷線粒體電子傳遞鏈，最終導(dǎo)致 ATP 的消耗，氧自由基生成增加，細(xì)胞內(nèi)一氧化氮 (NO) 含量增加，從而導(dǎo)致 DA 能神經(jīng)元變性和死亡[14-16]。MPTP 動物模型因其在線粒體中具有獨特的拮抗活性而被推薦用于研究 PD 線粒體功能障礙。

3 MPTP 誘導(dǎo)的 PD 動物模型

PD 動物模型使用的動物種類廣泛多樣，可大致分為四類，包括嚙齒類、靈長類、哺乳動物(小型豬、狗、貓)和其他動物(果蠅、斑馬魚)。其中，嚙齒類動物最常用于神經(jīng)毒素模型中細(xì)胞和分子水平上的機制研究[17]。用藥量和方法不同均對 MPTP 模型的造模結(jié)果有較大影響[18]，MPTP 可以通過腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥，模擬其他肌肉注射的功能障礙以及產(chǎn)生雙側(cè)損傷的能力，雙側(cè)病變對于人類疾病影響在有限的適當(dāng)區(qū)域特別有用[19-20]。在注射毒素后，行為測試中可以看到運動障礙，但在急性中不易察覺[21]。

3.1 MPTP 猴模型

在研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的過程中，非人類靈長動物 (non-human primates NHP) 模型在對疾病機制方面研究起關(guān)鍵作用，因為 NHP 與人類的遺傳和生理密切相關(guān)[22]，人與猴基因組相似度95%，NHPs中的MPTP模型癥狀、病理生化指標(biāo)及神經(jīng)病理學(xué)方面的改變與人類 PD 臨床表現(xiàn)相似并且癥狀穩(wěn)定，對 PD 治療藥物的反應(yīng)也與人類相似[23]，廣泛用于測試抗 PD 藥物和潛在的疾病改善干預(yù)措施[24]，例如，獼猴的 SNc 中多巴胺能神經(jīng)元顯著損失，并誘導(dǎo)出 PD 的主要軸向運動和姿勢的異常[25]，表現(xiàn)出類似人類舞蹈肌張力障礙的左旋多巴引起的運動障礙[6]。

MPTP 毒性作用存在種屬差異，不同給藥方式和給藥時間會表現(xiàn)出不同的病理特征。如食蟹猴和恒河猴同屬于獼猴，但是食蟹猴對 MPTP 的敏感性更強[26]。MPTP 暴露引起的神經(jīng)毒性很快，不能模擬 PD 慢性發(fā)生的過程[26]。在此基礎(chǔ)上建立了一個穩(wěn)定的慢性 NHP 帕金森模型[27]，一周兩次肌肉注射小劑量給藥(0.2 mg/kg)。采用慢性 MPTP 給藥方案[28](肌肉注射0.2～0.5 mg/kg，1 次/周，持續(xù)21 周)，模型中重現(xiàn) PD 患者大腦中多巴胺能神經(jīng)元退變過程。連續(xù)3 d對狨猴進(jìn)行皮下注射給藥，第0、1和2天的劑量分別為2、2和1 mg/kg，MPTP總積累劑量為5 mg/kg，模型猴的左右兩側(cè)大腦損傷程度不一致，行為學(xué)特征持續(xù)了1年以上[29]。老年猴通常比青年猴更易感[30]，5～9 歲恒河猴所需要的MPTP 劑量是20～23 歲恒河猴的3倍[31]。有研究[32]發(fā)現(xiàn)老年恒河猴肌肉注射制備模型時模型猴病情變化不可控，采用肌注+靜脈注射給予 MPTP 的青年恒河猴呈現(xiàn)了穩(wěn)定的運動和非運動癥狀[33]。

靈長類動物在 PD 研究中使用較早，MPTP 猴模型獲得了與 PD 神經(jīng)退行性變、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激相關(guān)的重要信息，但是非人靈長類動物模型優(yōu)缺點明顯[34]。雖然該類動物與人類進(jìn)化親緣性最高，實驗結(jié)果最為接近，但該類動物在每次實驗中使用數(shù)量較少，飼養(yǎng)、操作復(fù)雜，成本較高，且使用數(shù)量局限。

3.2 MPTP 鼠模型

受經(jīng)濟(jì)、倫理道德等的原因限制，只有少數(shù)的實驗室能夠使用靈長類模型[35]，與靈長類動物相比較，嚙齒類動物價格更便宜、更易于控制，又因大鼠對 MPTP 毒性具有較強抵抗性[36]，所以 MPTP 小鼠模型成了最普遍應(yīng)用的 PD 動物模型[37]，其中最敏感的小鼠系是C57BL/6 品系的小鼠，己被廣泛用于研究 PD 的發(fā)病機制、診斷和治療[38-41]。

根據(jù)不同的間隔時間、注射劑量、方式以及時間來建立不同研究目的的模型，主要有急性、亞急性和慢性模型。急性 MPTP 給藥主要引起 DA 能神經(jīng)細(xì)胞非凋亡性死亡[42]，而長期施用低、中等劑量的神經(jīng)毒素導(dǎo)致由凋亡性細(xì)胞死亡引起的進(jìn)行性的神經(jīng)變性，可以反映 PD 患者大腦中的細(xì)胞分子生物學(xué)變化[43]。MPTP 小鼠模型根據(jù)不同的研究目的其制備方式可以大致分為4種[44-45]：(1)前 PD 模型：一次小劑量 MPTP 腹腔注射(10～20 mg/kg) ，適用于代償機制研究；(2)急性 PD 模型：間斷 MPTP腹腔注射 (20 mg/kg) ，4 次/d，每2 h一次，連續(xù)1～2 d，大劑量時引起急性神經(jīng)元變性壞死，常用于晚期 PD 的神經(jīng)解剖、生化等研究；(3)亞急性 PD 模型：MPTP 腹腔注射 (20～30 mg/kg) ，1 次/d，連續(xù)5 d，神經(jīng)損傷呈進(jìn)行性加重，常研究反應(yīng)較慢的代償機制，如受體表達(dá)等[46-47]；(4)慢性 PD 模型：MPTP 腹腔注射(4 mg/kg) ，1 次/d，連續(xù)20 d。模型小鼠在急性中毒期會有癥狀表現(xiàn)，如瞳孔散大、豎毛、唾液過多及陣攣性癲癇發(fā)作等癥狀，一般注射后的15～30 min出現(xiàn)，但是能夠很快恢復(fù)正常狀態(tài)。當(dāng)然，也有的實驗沒有觀察到造模后小鼠的行為改變，原因可能與小鼠種屬、年齡、藥量或者 MPTP 敏感性的不同有關(guān)。所以，盡管模型小鼠有明顯的類似自主活動減少之類的運動障礙癥狀，但很少能見到長時間典型的 PD 運動障礙。

研究[44]發(fā)現(xiàn)，慢性模型中小鼠中腦黑質(zhì)部冠狀切片的 TH 免疫組化染色更能表現(xiàn)出PD病理上的變化；通過觀察 HE 染色切片，慢性模型組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)改變，核仁染色較淺甚至消失，慢性模型更符合 PD DA 神經(jīng)元凋亡的特性；爬桿和懸掛實驗測試小鼠運動能力指標(biāo)，慢性組比亞急性組小鼠爬桿時間更長，懸掛支撐時間也短，更能表現(xiàn)出 PD 在行為上的改變。綜上所述，MPTP 制備的慢性 PD 小鼠模型更有代表性，更有利于進(jìn)行 PD 動物實驗研究。

4 結(jié)語

PD 動物模型中使用更多、應(yīng)用范圍更廣的是神經(jīng)毒性模型，此模型主要優(yōu)勢在于操作簡單，成本較低，結(jié)果重復(fù)性較好。MPTP 模型在探討 PD 發(fā)病原因和發(fā)病機制方面具有很大潛力，MPTP 模型被證明能成功的用于測試新型神經(jīng)保護(hù)策略逆轉(zhuǎn)或減緩疾病的進(jìn)展。雖然研究者能夠通過動物模型從不同的作用機制、不同的角度，全方面地模擬 PD 的發(fā)生，但是動物模型所反映的病理變化與 PD 患者現(xiàn)實表現(xiàn)出的病理病變與臨床癥狀仍存在很大差異，因此，我們應(yīng)更著眼于PD 動物模型的有效性與結(jié)果可重復(fù)性，不斷完善 PD 模型制備方法，利用新興科技技術(shù)盡早構(gòu)建出可重復(fù)性高、成功率高、穩(wěn)定且高度契合臨床PD患者的動物模型。