馬奶營養(yǎng)品質(zhì)及功能特性的發(fā)酵動態(tài)分析

張萌萌,趙雪妮,雙全,張鳳梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010000)

馬是五畜之首,對蒙古族的生產(chǎn)、生活有重要影響。馬業(yè)發(fā)展歷史悠久,是內(nèi)蒙古地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè),尤其是錫林郭勒盟的阿巴嘎黑馬和烏珠穆沁馬品種優(yōu)良,以體大悍威、產(chǎn)奶量高和體型優(yōu)美、耐力較好等特性而聞名,其鮮馬奶、酸馬奶等系列乳產(chǎn)品也逐年迅速發(fā)展,深受少數(shù)民族地區(qū)居民的喜愛。馬奶的乳脂肪細(xì)膩,酪蛋白含量與乳清蛋白的比例與母乳接近,更易被人體吸收和利用[1]。馬奶能保護馬駒免受結(jié)核菌感染,拮抗致病微生物,克服抗生素應(yīng)用帶來的醫(yī)源性菌群失調(diào)癥。鮮馬奶經(jīng)微生物發(fā)酵可對馬奶的香氣、質(zhì)地和酸度等產(chǎn)生影響,使其具有更高的營養(yǎng)價值[2]。酸馬奶作為一種藥食同源的食品,具有一定的醫(yī)療保健價值[3],可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,進而調(diào)控血脂趨于正常水平,緩解高脂血癥[4]。

近年已有對馬奶的基本營養(yǎng)成分進行檢測的研究,但關(guān)于馬奶發(fā)酵過程中理化指標(biāo)與功能特性的變化過程研究甚少。因此,本研究以具有地區(qū)代表性的阿巴嘎黑馬和烏珠穆沁白馬鮮馬奶為原料,通過自然發(fā)酵的方法,分析2種鮮馬奶發(fā)酵過程及其發(fā)酵前后的營養(yǎng)價值和功能性指標(biāo)的變化,為開發(fā)、利用內(nèi)蒙古豐富的馬奶資源提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DPPH、ABTS上海源葉生物科技有限公司;鐵氰化鉀,天津福晨化學(xué)試劑有限公司;FeCl3,天津市雙船化學(xué)試劑廠;乙酸乙酯,天津新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)科貿(mào)化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛,成都艾科達化學(xué)試劑有限公司;膽固醇,日本半井化學(xué)藥品株式會社。H2SO4、CuSO4、K2SO4、異戊醇、鹽酸、甲醇、正庚烷等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDY-9860凱氏定氮儀,上海海能儀器有限公司;FG2便攜式pH計,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;LZKJ脂肪離心機,黑龍江龍澤科技發(fā)展有限公司;LA8080高速氨基酸分析儀,日立株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所;U-5100紫外分光光度計,日本東京日立高科技公司;CR-20色差儀,日本柯尼卡美能達。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬乳的發(fā)酵工藝流程

將新擠出的鮮馬奶倒入無菌無霉的器皿中,然后加入12.5%酸馬奶引子,立即進行攪拌混勻,在26 ℃下自然發(fā)酵并定時攪拌,發(fā)酵過程中的馬奶分別在pH為6.0、5.0、4.5、4.0及3.8時進行取樣,并檢測分析其營養(yǎng)成分、功能特性。

1.3.2 馬奶主要營養(yǎng)成分的測定

量取10 mL鮮馬奶及發(fā)酵過程中的乳樣置于50 mL錐形瓶中,用pH計測得其pH值。

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定-凱氏定氮法》對蛋白質(zhì)含量進行檢測。稱取10 mL乳樣,加入0.4 g CuSO4、6 g K2SO4及20 mL H2SO4于消化爐進行消化,取出冷卻后加入50 mL水于凱氏定氮儀測量。

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定-蓋勃法》對脂肪的含量進行測定。于蓋勃氏乳脂計中先加入10 mL H2SO4,再加入10.75 mL乳樣和1 mL異戊醇,置65 ℃水浴中5 min,取出后置于離心機中以1 100 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,水浴5 min,取出讀數(shù)。

參照GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定 萊因-埃農(nóng)氏法》對乳糖含量進行測定,乳糖為乳制品中的主要碳水化合物。稱取預(yù)先在烘箱中干燥2 h的乳糖標(biāo)樣約0.75 g,定容至250 mL后滴定。然后取10 mL費林氏液,再加入20 mL蒸餾水,維持沸騰狀態(tài)2 min,滴入3滴次甲基藍溶液,溶液藍色完全褪盡即為終點,根據(jù)樣液消耗的體積計算乳糖含量。

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定-直接干燥法》對水分含量進行測定。于稱量瓶內(nèi)加10 mL乳樣,105 ℃干燥1 h左右,冷卻0.5 h后再稱量,并重復(fù)以上操作至前后2次質(zhì)量差不超過2 mg為恒重。

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》對灰分含量進行測定。稱取10 mL乳樣后,加入1 mL乙酸鎂溶液,在(550±25)℃灼燒4 h,放入干燥器中冷卻30 min。重復(fù)灼燒至前后2次稱量相差不超過0.5 mg為恒重。

吸取0.5 mL乳樣滴于數(shù)字折光儀棱鏡上對可溶性固形物含量進行測定;食物營養(yǎng)能量按公式(1)計算：

能量/[kJ·(100 mL)-1]=17×蛋白質(zhì)含量+37×脂肪含量+17×碳水化合物含量

(1)

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》進行氨基酸組成及含量測定。取10 mL乳樣,加入10 mL的鹽酸混勻后,繼續(xù)向水解管內(nèi)加入苯酚4滴,重復(fù)抽真空、充入N23次后,水解22 h。加入1 mL的pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液到干燥后試管內(nèi)溶解,通過0.22 μm濾膜后轉(zhuǎn)移至氨基酸自動分析儀測定。

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》進行脂肪酸種類及含量測定。稱取10 mL乳樣,加入約100 mg焦性沒食子酸,再加入2 mL的95%乙醇和4 mL的水,混勻后加入氨水5 mL于80 ℃水浴中水解20 min,再加入10 mL 95%乙醇,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,殘留物為脂肪提取物。向脂肪提取物中加入2% NaOH 8 mL質(zhì)量濃度為20 g/L NaOH-甲醇溶液,水浴回流直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7 mL的15%三氟化硼甲醇溶液、10 mL正庚烷和飽和NaCl水溶液,靜置分層。吸取5 mL上層溶液,加入3 g無水Na2SO4,靜置5 min,吸取上層溶液并測定。

1.3.3 馬奶功能特性的測定

將發(fā)酵過程中的馬奶樣品振蕩混勻,用1 mol/L的NaOH溶液、1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)樣品pH為4.6(酪蛋白等電點),經(jīng)6 000 r/min離心15 min,取上清液備用。

參照王卉[5]的方法測定發(fā)酵過程中的馬奶樣品對DPPH自由基清除能力并加以優(yōu)化。以無水乙醇作為對照組,取1.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液與1.5 mL的乳樣在試管中,加入蒸餾水3 mL,混勻后測定其吸光值。

參照王琪[6]的方法測定·OH清除能力并加以優(yōu)化。以蒸餾水作為對照組,吸取1 mL的樣品,與9 mmol/L的FeSO4溶液、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液,振蕩混勻,8 000 r/min離心10 min,取上清液測定吸光值。

參照NIE等[7]的方法測定ABTS陽離子自由基清除能力。用0.05 mol/L的PBS(pH 5.5)稀釋ABTS工作液,取4 mL ABTS工作液與200 μL樣品于試管中,混勻后靜置6 min,于734 nm處測其吸光值。

參考王卉[5]的方法采用鐵氰化鉀法測定還原活性。取1 mL樣品加入2 mL的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)以及質(zhì)量濃度10 g/L的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴反應(yīng)20 min。再加入2 mL質(zhì)量濃度100 g/L 三氯乙酸,搖勻,6 000 r/min離心20 min,取上清液2.0 mL,加入去離子水2.0 mL和0.4 mL的質(zhì)量濃度1 g/L 三氯化鐵,50 ℃水浴反應(yīng)10 min,于700 nm處測定吸光值。

參照MONTGOMERY等[8]的方法測定降膽固醇能力。分別吸取1 mL乳樣和5 mL無水乙醇,混勻,經(jīng)3 000 r/min離心20 min,取上清液0.5 mL,加入1 mL濃硫酸、2 mL的1 g/L鄰苯二甲醛,以蒸餾水替代樣品為對照組,漩渦振蕩搖勻,靜置顯色10 min,于波長550 nm處測吸光值。

參照寶冠媛[9]的方法,采用牛津杯法對發(fā)酵過程中的馬奶樣品進行抑菌實驗。選擇大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌作為指示菌,用無菌生理鹽水配制106CFU/mL的指示菌懸液。首先在滅菌平板中倒入15 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后放入已滅菌的牛津杯(直徑為8 mm),倒入15 mL含有150 μL指示菌懸液的半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,吸取150 μL樣品加入孔內(nèi),室溫擴散3 h后,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示(n=3),組間均值比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s 功能進行顯著性分析(P<0.05),采用Excel 2019和Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種馬奶發(fā)酵過程中pH值的變化

如圖1所示,白馬鮮馬奶和黑馬鮮馬奶的初始pH分別為6.90和6.98,加入酸馬奶引子后馬奶的pH值迅速降至6.05和5.83,馬奶發(fā)酵16 h后pH下降至4.44和4.41,發(fā)酵24 h后pH下降至4.0左右,到32 h時pH降至4.0以下,二者發(fā)酵終點pH均在3.8～3.9。pH下降可能是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝生成乳酸、有機酸等酸性物質(zhì)。

2.2 兩種鮮馬奶常規(guī)營養(yǎng)特性及其發(fā)酵過程中的變化

2.2.1 馬奶主要營養(yǎng)成分的變化

馬奶不同pH下的營養(yǎng)成分如表1所示,黑馬鮮馬奶的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量顯著高于白馬鮮馬奶,白馬鮮馬奶的乳糖含量、可溶性固形物含量高于黑馬鮮馬奶,二者水分、灰分含量之間的差異不顯著。在馬奶發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)被水解成多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)作為乳酸菌的“氮營養(yǎng)源”,理論上有所減少,但是消耗量甚小,因此從宏觀看,蛋白質(zhì)含量變化不顯著。馬奶發(fā)酵過程中脂肪稍有變化,可能是微生物將脂肪分解為小分子的脂肪酸,且脂肪酸與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng),造成脂肪含量下降。發(fā)酵過程所測得的脂肪平均含量高于孫天松[10]所研究的新疆地區(qū)酸馬奶的脂肪含量,說明不同地區(qū)馬乳的基本營養(yǎng)成分存在差異。

表1 馬奶不同pH下的營養(yǎng)成分Table 1 Conventional nutrients of different varieties of fresh and koumiss

結(jié)果表明,黑馬馬奶中蛋白質(zhì)、脂肪、水分、灰分含量在發(fā)酵過程中各時間點的差異均不顯著(P>0.05)。2種馬奶發(fā)酵后乳糖含量均呈下降趨勢,且各時間點的乳糖含量差異顯著(P<0.05)。在馬奶發(fā)酵過程中乳糖被微生物分解為半乳糖和葡萄糖,適宜乳糖不耐受人群的飲用且單糖更易于人體吸收。2種馬奶發(fā)酵過程中各時間點的可溶性固形物含量具有顯著差異(P<0.05),可溶性固形物含量的下降趨勢與乳糖含量的下降趨勢較為接近,白馬、黑馬鮮馬奶能量也隨之呈下降趨勢。

2.2.2 馬奶氨基酸的組成和含量

酸馬奶是優(yōu)質(zhì)的氨基酸食物來源,氨基酸含量在發(fā)酵過程中受乳酸菌降解蛋白質(zhì)的影響而發(fā)生變化。不同種類氨基酸能協(xié)調(diào)影響發(fā)酵乳的營養(yǎng)、功能等[11],參與體內(nèi)主要代謝途徑的調(diào)控。鮮馬奶和酸馬奶的氨基酸組成及含量如表2所示,本研究中酸馬奶的氨基酸總量(total amino acid,TAA)和必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量均高于鮮馬奶,黑馬馬奶在發(fā)酵前后的氨基酸總量和必需氨基酸含量均高于白馬馬奶。

2種鮮馬奶的必需氨基酸中,均是亮氨酸含量最高,亮氨酸可與異亮氨酸和纈氨酸協(xié)同修復(fù)肌肉,控制血糖,為身體組織提供能量[12]。而在2種酸馬奶的總氨基酸組成中谷氨酸含量最高,分別為0.32和0.45 g/100 g。谷氨酸可為腸上皮細(xì)胞提供能源物質(zhì),增強腸道抗氧化能力[13]。必需氨基酸中亮氨酸含量最高。在發(fā)酵結(jié)束后,黑馬酸馬奶的氨基酸含量高于白馬酸馬奶,且檢測出的氨基酸含量在2種馬奶中均有所提高。必需氨基酸和總氨基酸含量均有提高。

表2 鮮馬奶和酸馬奶的氨基酸組成及含量 單位g/100 g

2.2.3 馬奶脂肪酸的組成和含量

2種鮮馬奶和酸馬奶的脂肪酸組成及含量如表3所示,2種發(fā)酵前后馬奶中棕櫚酸、亞麻酸含量較高,亞麻酸是維持機體功能不可缺少的必需脂肪酸,具有調(diào)節(jié)血脂、護肝等功效[14]。與黑馬鮮馬奶相比,白馬鮮馬奶中棕櫚酸和亞麻酸的含量較高,亞油酸含量較低,與李枝[15]研究一致。黑馬鮮馬奶的月桂酸含量也高于白馬,月桂酸具有抗菌特性[16]。白馬鮮馬奶的不飽和脂肪酸含量較黑馬更高,為50.55%,故白馬鮮馬奶的脂肪酸營養(yǎng)價值高于黑馬鮮馬奶。

表3 鮮馬奶和酸馬奶的脂肪酸組成及含量 單位：%

發(fā)酵結(jié)束后,白馬酸馬奶的飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量較鮮馬奶有所提高,而不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量降低。黑馬酸馬奶與鮮馬奶相比飽和脂肪酸含量降低,不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量均提高。黑馬酸馬奶的油酸相對比例高于鮮馬奶,曹永強等[16]研究發(fā)現(xiàn)油酸在調(diào)節(jié)血脂、降膽固醇中起重要作用。SFA∶MUFA∶PUFA是評價脂肪酸營養(yǎng)價值的重要指標(biāo),黑馬酸馬奶的比例為36.78∶32.50∶30.73,與世界衛(wèi)生組織推薦的比例1∶1∶1較為接近[17],故認(rèn)為黑馬酸馬奶的脂肪酸組成及相對含量更接近推薦比例。

2.3 馬奶功能特性的變化

2.3.1 馬奶發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

如圖2所示,2種馬奶發(fā)酵后對3種自由基的清除能力均增強,在發(fā)酵過程中呈上升趨勢(P<0.05)并略有起伏變化。黑馬馬奶發(fā)酵后的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力高于白馬馬奶,白馬馬奶發(fā)酵后的·OH清除能力高于黑馬馬奶。隨著pH逐漸降低,可能是由于乳酸菌在生長過程中可清除部分自由基基團[18]。兩種酸馬奶經(jīng)發(fā)酵完成后的還原力較發(fā)酵前的鮮馬奶均為顯著增強(P<0.05)。白馬和黑馬酸馬奶的還原力分別為(0.256±0.01)和(0.309±0.02)，黑馬馬奶在發(fā)酵過程中的還原力較同時期的白馬馬奶更強。

綜上,2種馬奶經(jīng)發(fā)酵作用后抗氧化活性顯著增強(P<0.05),其中黑馬馬奶對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力及還原力較強,白馬馬奶對·OH的清除能力較強。因此,與白馬酸馬奶相比,黑馬酸馬奶的抗氧化活性較強。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率;c-·OH清除率;d-還原力圖2 馬奶發(fā)酵過程中自由基清除能力的變化Fig.2 Changes of free radical scavenging ability during mare milk fermentation

2.3.2 馬奶發(fā)酵過程中膽固醇活性的變化

測定不同膽固醇的質(zhì)量與OD550值之間的對應(yīng)關(guān)系見公式(2)：

y=1.002 3x+0.004 3

(2)

其相關(guān)系數(shù)R2為0.995 8,2種馬奶發(fā)酵至酸馬奶后膽固醇降解率均顯著上升(P<0.05)。如圖3所示,黑馬馬奶發(fā)酵后的膽固醇降解率顯著增加,增加了8.45%,其降解率為(13.60±0.01)%。白馬馬奶發(fā)酵后膽固醇降解率增加了4.36%,提升至(10.95±0.20)%。這可能是由于發(fā)酵后馬奶的不飽和脂肪酸、乳清酸和乳酸菌等益生物質(zhì)的增加[19],乳清酸能夠抑制膽固醇的生成,可以降低血液中總膽固醇含量,防止動脈粥樣硬化;不飽和脂肪酸可促進膽固醇酯生成并使其轉(zhuǎn)化為高密度脂蛋白[20]。而黑馬酸馬奶的不飽和脂肪酸含量較高,因此其膽固醇降解率相對較高。

圖3 馬奶發(fā)酵過程中降膽固醇能力的變化Fig.3 Changes of cholesterol removal ability during mare’s milk fermentation

2.3.3 馬奶發(fā)酵過程中抑菌能力的變化

表4所示,2種馬奶發(fā)酵后對3株指示菌的抑制能力均有不同程度的顯著提升(P<0.05)。黑馬酸馬奶在發(fā)酵完成時,大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌上的抑菌圈直徑分別為(15.29±0.95)、(16.60±1.06)、(15.86±0.25)mm,白馬酸馬奶在3株指示菌上的抑菌圈直徑分別為(14.80±0.33)、(15.63±0.42)、(15.43±0.62) mm。結(jié)果表明,黑馬酸馬奶、白馬酸馬奶對3株指示菌有抑制效果,且隨著pH下降,抑菌圈直徑逐漸增大,抑菌效果逐漸增強。食品中的抑菌成分主要為有機酸[21]、短肽[22]、乳酸菌等[23],發(fā)酵可使馬奶中的乳酸菌競爭抑制病原菌的生長,代謝生成有機酸和乳酸,有機酸和乳酸也可抑制病原菌的生長,故發(fā)酵后的馬奶對3株指示菌的抑制能力隨pH降低而增強。

表4 馬奶發(fā)酵過程中抑制致病菌能力的變化Table 4 Changes of inhibitory ability of during mare milk fermentation

3 結(jié)論

阿巴嘎黑馬與烏珠穆沁白馬的鮮馬奶的主要營養(yǎng)成分、抗氧化特性和膽固醇脫除力具有顯著差異。在發(fā)酵過程中,2個品種酸馬奶的營養(yǎng)品質(zhì)、功能特性的變化趨勢一致并呈上升趨勢。發(fā)酵降低了乳糖含量,適于乳糖不耐受人群飲用;發(fā)酵還提高了氨基酸和脂肪酸等微量元素的含量,提升了馬乳的抗氧化活性、抑菌特性和膽固醇脫除力,證明酸馬奶可以用于輔助增強免疫力、促進胃腸道消化、預(yù)防高膽固醇血癥和動脈硬化等。因此,本研究為更好地開發(fā)、利用內(nèi)蒙古豐富的馬奶資源提供了新的方向與應(yīng)用前景,為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)和下一步研究提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。