甘草GuWOX基因家族的鑒定與表達(dá)分析

葛甜甜，王 楠，高 靜*，張 崗，顏永剛，沈雨璇

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/陜西省中醫(yī)藥管理局秦藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究與開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，陜西咸陽(yáng) 712083)

WOX(WUSCHEL-related homeobox)轉(zhuǎn)錄因子基因家族屬于植物同源框(homeobox)轉(zhuǎn)錄因子超家族的一個(gè)亞進(jìn)化支[1]，其保守序列是由60個(gè)左右的氨基酸以“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-loop-helix-turn-helix)”構(gòu)成的同源異型結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)。WOX轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)HD與特定的DNA序列結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[2]，目前在擬南芥[3]、水稻[4]、烏拉爾圖小麥[5]、小桐子[6]和玉米[7]等植物中均有研究報(bào)道，廣泛參與干細(xì)胞分裂分化的調(diào)控、胚胎和器官的形成、花的發(fā)育等過(guò)程[8]。

擬南芥基因組中有15個(gè)WOX成員，分別是AtWUS和AtWOX1-AtWOX14[9]，其中，AtWOX13和AtWOX14對(duì)根和花器官的發(fā)育產(chǎn)生影響，AtWOX8和AtWOX9在受精卵發(fā)育成胚的過(guò)程中發(fā)揮作用，AtWOX11和AtWOX12共同參與影響外植體根的器官發(fā)育。WUS基因作為形成和維持莖頂端分生組織所必需的基因，其對(duì)莖尖分生組織中心區(qū)細(xì)胞的表達(dá)和子房、花藥的發(fā)育過(guò)程都具有一定的作用[10]。AtWOX5具有與WUS基因相似的功能，可以調(diào)控根尖分生組織的表達(dá)[11]。AtWOX1和AtWOX3共同調(diào)控葉片的橫向生長(zhǎng)，影響葉片的寬度[12]。在水稻中有13個(gè)WOX成員，OsWUS在腋芽的背面表達(dá)，OsWOX3是AtWOX3的同源基因，在葉片和花器官原基中表達(dá)，并且其表達(dá)是葉片發(fā)育所必需的。OsWOX9是AtWOX5的同源基因，參與根尖分生組織的維持，在根的靜止中心(QC)的細(xì)胞中特異性表達(dá)[4]。

此外，有研究表明，WOX基因在植物響應(yīng)干旱、低溫或鹽脅迫等非生物脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[13]。在HOS9-1擬南芥突變體中，AtWOX6可影響冷脅迫的應(yīng)答[14]。在水稻中，OsWOX11通過(guò)調(diào)節(jié)根毛發(fā)育來(lái)增強(qiáng)水稻的抗旱性[15]。同時(shí)，WOX基因受生長(zhǎng)素(IAA)、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)和細(xì)胞分裂素(CTK)等激素的調(diào)控[4]。王培杰等[16]在不同激素處理茶樹的研究中發(fā)現(xiàn)，CsWOX5、CsWOX3、CsWOX2和CsWOX6分別受到乙烯(ETH)、ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)和GA的顯著影響。Ohmori等[17]研究發(fā)現(xiàn)，OsWOX4通過(guò)參與CTK介導(dǎo)的水稻莖尖分生組織可維持未分化的狀態(tài)，促進(jìn)植物地上部分的生長(zhǎng)。OsWOX11可以直接抑制細(xì)胞分裂素A型響應(yīng)調(diào)節(jié)劑(RR2)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控IAA和CTK，影響水稻不定根的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是豆科甘草屬植物，以其根及根莖入藥，具有清熱解毒，緩急止痛，潤(rùn)肺止咳的功效，對(duì)糖尿病、哮喘等有一定治療作用[18]。干旱[19]、高溫[20]和鹽脅迫[21]等非生物脅迫會(huì)嚴(yán)重威脅甘草的生長(zhǎng)，降低甘草的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)GuWOX基因家族進(jìn)行分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)研究GuWOX基因在不同組織(莖、幼葉、成熟葉、主根根尖、主根、側(cè)根根尖和側(cè)根)和不同處理(無(wú)磷、干旱和鹽脅迫以及ABA和GA3)下的表達(dá)模式，成功克隆4個(gè)GuWOX基因，為進(jìn)一步探索GuWOX基因家族的功能和多樣化表達(dá)模式提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料為甘草種子，于2020年4月采自新疆烏魯木齊，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)黃文靜副教授鑒定為豆科植物甘草。挑選健康飽滿的種子以體積比為1∶3的30%過(guò)氧化氫：純凈水消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈后，放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加適量水后進(jìn)行催芽萌發(fā)，于人工氣候箱中(溫度25 ℃，相對(duì)濕度75%，光暗周期交替為12 h/12 h)進(jìn)行為期7 d的催芽育苗，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗植株移栽至塑料水培盆中，采用Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液水培1個(gè)月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取正常生長(zhǎng)條件下的甘草莖、幼葉、成熟葉、主根根尖、主根、側(cè)根根尖和側(cè)根用于組織特異性表達(dá)分析。以缺磷的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(WP)、15 g/L聚乙二醇6000(PEG)[19]、150 mmol/L氯化鈉(NaCl)[21]模擬無(wú)磷、干旱和鹽脅迫處理，以霍格蘭全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照組(CK)。用100 μmol/L ABA、100 μmol/L GA3[16]噴灑甘草葉片進(jìn)行激素處理，對(duì)照用純水進(jìn)行噴灑。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在處理3、6、12和24 h后取甘草的葉和根，蒸餾水洗凈后，用錫紙包裹標(biāo)記，液氮速凍后，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1GuWOX基因家族成員的鑒定利用http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/網(wǎng)站獲取甘草的全基因組序列數(shù)據(jù)[22]，從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中獲取擬南芥15個(gè)AtWOX家族成員的蛋白全長(zhǎng)序列。以AtWOX蛋白序列為查詢序列，進(jìn)行Blast同源序列比對(duì)以獲得GuWOX的所有成員，并運(yùn)用EBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)在線工具分析候選蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)合SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析工具進(jìn)行驗(yàn)證，使用DOG2.0軟件繪制蛋白結(jié)構(gòu)域圖。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用MEGA7.0軟件通過(guò)鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對(duì)GuWOX、AtWOX和OsWOX蛋白進(jìn)行比對(duì)建樹；bootstrap值設(shè)置為1 000，其他為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.3 GuWOX蛋白信息學(xué)分析利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析GuWOX蛋白的理化性質(zhì)，主要包括氨基酸殘基數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、總平均親水性等。

分別利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、Cell-PLOC2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線分析工具對(duì)GuWOX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成形式、亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用TBtools軟件提取GuWOX基因起始密碼子上游2 000 bp的序列，將其提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線工具分析啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.2.4GuWOX基因的表達(dá)分析利用甘草的全基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GuWOX基因家族的CDS序列，使用Primer Premier5.0軟件，隨機(jī)選取5條GuWOX基因家族的CDS序列設(shè)計(jì)引物，并交由生工生物工程股份有限公司(上海)合成引物，引物序列見表1，以Actin作為內(nèi)參基因[23]進(jìn)行特異性表達(dá)分析。按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的方法提取甘草根和葉RNA，并使用0.8%的凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。模板cDNA采用FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒的方法合成。qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑在qTOWER2.0實(shí)時(shí)PCR儀上完成，擴(kuò)增體系含20 μL，分別包含1 μL cDNA，上下游引物各0.6 μL，10 μL SYBR MIX，

表1 qRT-PCR和基因克隆的引物序列

7.8 μL ddH2O；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，試驗(yàn)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCT法[24]進(jìn)行分析，用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，并用GraphPad Prism 8.0繪圖。

1.2.5GuWOX基因克隆利用甘草的全基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GuWOX基因家族的CDS序列設(shè)計(jì)克隆引物(表1)，以甘草葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(20 μL)為cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，2×Hieff TM PCR Master Mix酶10 μL。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為94 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司(上海)測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 GuWOX基因家族蛋白結(jié)構(gòu)的鑒定

將AtWOX蛋白序列與甘草全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì)，共鑒定獲得16個(gè)GuWOX蛋白序列，為進(jìn)一步確定所獲得的GuWOX是否屬于WOX家族，使用EBL-EBI在線分析工具對(duì)所獲得的GuWOX進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，并結(jié)合SMART在線分析工具對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。如圖1所示，將最終所得GuWOX蛋白序列分別命名為GuWOX1～GuWOX16，這16個(gè)GuWOX蛋白均具有一個(gè)HD，屬于典型的WOX家族成員。

圖1 GuWOX蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.2 GuWOX基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為揭示GuWOX基因家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)鄰接法構(gòu)建GuWOX、AtWOX和OsWOX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2顯示，GuWOX家族蛋白分為3個(gè)亞家族，為現(xiàn)代支、中間支和遠(yuǎn)古支，其中現(xiàn)代支包括GuWOX1～GuWOX9，中間支包括GuWOX10、GuWOX11、GuWOX15、GuWOX16，遠(yuǎn)古支包括GuWOX12～GuWOX14。GuWOX12～GuWOX14和AtWOX13、AtWOX14聚在同一分支，預(yù)測(cè)GuWOX12～GuWOX14調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，可能與AtWOX13、AtWOX14有相同的功能。

圖2 GuWOX、AtWOX和OsWOX家族成員蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 GuWOX蛋白的生物信息學(xué)分析

對(duì)16個(gè)GuWOX蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表2)，其氨基酸殘基數(shù)在168～452 aa之間，分子量為19.39～50.11 kD。理論等電點(diǎn)(pI)值在5.28～8.97之間，說(shuō)明它們可能在不同的微環(huán)境中發(fā)揮功能。脂肪系數(shù)為50.83～68.56，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)在51.07～71.30左右，均大于40，為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性為-1.08～-0.51，均為負(fù)值。

表2 GuWOX蛋白的理化性質(zhì)

通過(guò)對(duì)GuWOX蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)(表3)，結(jié)果表明除GuWOX1和GuWOX2無(wú)規(guī)則卷曲的比例分別為45.11%和47.02%外，其余14個(gè)蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲比例都大于50%，GuWOX蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)形式。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GuWOX蛋白均定位在細(xì)胞核上。

表3 GuWOX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 GuWOX基因家族啟動(dòng)子的順式作用元件分析

利用PlantCARE分析GuWOX基因的啟動(dòng)子序列。結(jié)果顯示(表4)，GuWOX啟動(dòng)子中包含的元件按照功能主要分為5類，為應(yīng)答逆境順式調(diào)控元件、光響應(yīng)元件、組織特異性元件、蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和激素響應(yīng)元件。其中，63%的GuWOX家族成員具有TC-rich repeats、LTR、GC-motif等3個(gè)應(yīng)答逆境順式調(diào)控元件。光響應(yīng)元件，包括3-AF1bindingsite、AAAC-motif、GT1-motif，11個(gè)GuWOX家族成員均具有該元件。HD-Zip1元件僅存在于GuWOX14中，CAT-box元件存在于GuWOX1、GuWOX5、GuWOX7、GuWOX11、GuWOX13等5個(gè)成員中。此外，19%GuWOX家族成員具有IAA順式作用元件TGA-element、25%的成員具有響應(yīng)GA應(yīng)答的GARE-motif作用元件，31%的成員具有響應(yīng)水楊酸(SA)應(yīng)答的TCA-element作用元件，94%的成員具有ABA順式作用元件ABRE，因此GuWOX基因可能參與甘草的分生組織生長(zhǎng)、對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)以及激素調(diào)節(jié)甘草的發(fā)育。

表4 GuWOX基因順式作用元件分析

2.5 GuWOX基因家族在不同組織中的表達(dá)分析

組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)(圖3),5個(gè)GuWOX在不同組織的表達(dá)量存在著一定的差異。其中，GuWOX1在側(cè)根中的表達(dá)量顯著高于其他基因(P<0.05)，為2.29。在成熟葉中GuWOX1的表達(dá)量相較于其他基因最低，為0.45，并且，相較于其余6種組織，GuWOX1在側(cè)根中的表達(dá)量最高。GuWOX15在莖中的表達(dá)顯著高于其他基因(P<0.05)，但其在不同組織間的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05),同時(shí)，GuWOX15在幼葉、成熟葉、主根根尖、側(cè)根根尖和側(cè)根的表達(dá)均顯著高于GuWOX12(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明了GuWOX基因可能參與甘草的不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

不同大寫字母表示同一基因不同組織的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。不同小寫字母表示同一組織不同基因的表達(dá)差異顯著(P<0.05)

2.6 GuWOX基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

甘草葉中基因表達(dá)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照相比，干旱處理3 h時(shí)GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，GuWOX15還在干旱處理12 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高，為19.63。GuWOX12在3～24 h內(nèi)的表達(dá)量持續(xù)上調(diào)。在鹽處理中，GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間增加呈下調(diào)趨勢(shì)。在無(wú)磷處理中，GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15在3 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，在6 h時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)。激素ABA處理后GuWOX6、GuWOX12、GuWOX15在3和6 h時(shí)均顯著上調(diào)(P<0.05)。GuWOX1的表達(dá)在3～12 h顯著上調(diào)(P<0.05)，在12～24 h顯著下調(diào)(P<0.05)。激素GA3處理6 h時(shí)后，與對(duì)照相比，5個(gè)GuWOX基因均呈上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

不同大寫字母表示同一處理不同時(shí)間下同一基因的表達(dá)差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一處理同一時(shí)間下不同基因的表達(dá)差異顯著(P<0.05)，下同

甘草根中基因表達(dá)結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照相比，干旱、鹽和無(wú)磷處理6和12 h時(shí)GuWOX15顯著上調(diào)(P<0.05)。GuWOX5在3種處理3和24 h時(shí)均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，并且在3～12 h下調(diào)，12～24 h上調(diào)。ABA處理6 h時(shí)這5個(gè)基因均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。GuWOX1和GuWOX15在12～24 h均顯著下降(P<0.05)，GuWOX12的表達(dá)量在3～24 h先上升后下降(P<0.05)。GA3處理下，3 h時(shí)GuWOX12和GuWOX15顯著上調(diào)(P<0.05)，GuWOX5和GuWOX6分別在6和24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

圖5 不同處理下甘草根中GuWOX基因的表達(dá)水平

2.7 GuWOX基因的全長(zhǎng)克隆

以甘草葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6和GuWOX12的cDNA序列，其cDNA全長(zhǎng)分別為557、707、716、578 bp，且分別編碼184、237、237、191個(gè)氨基酸(圖 6)。

M. DL3000；1. GuWOX1；2. GuWOX5；3. GuWOX6；4. GuWOX12

3 討 論

WOX轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和應(yīng)答非生物脅迫[25]。本研究利用生物信息學(xué)的方法在甘草基因組中共鑒定出16個(gè)GuWOX基因家族成員，其均含有HD[26]。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，GuWOX基因編碼的蛋白被分為3個(gè)進(jìn)化支，分別有3、4和9個(gè)成員分布于遠(yuǎn)古支、中間支和現(xiàn)代支中，這與在擬南芥中的研究一致[3]，每一個(gè)進(jìn)化支都包含了單子葉植物水稻OsWOX基因家族和雙子葉植物甘草GuWOX、擬南芥AtWOX基因家族成員，推測(cè)WOX基因的分化早于單雙子葉植物的分化。GuWOX家族蛋白均為親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，相似的理化性質(zhì)預(yù)示各個(gè)成員間可能具有某些相似的功能。GuWOX家族蛋白亞細(xì)胞定位均在細(xì)胞核上，說(shuō)明GuWOX基因家族在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，這與擬南芥中AtWUS、AtWOX3、AtWOX4、AtWOX6和水稻中OsWOX3、OsWOX9和OsWOX11的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[27-29]。

WOX基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等起著重要的調(diào)控作用[13]。水稻中OsWOX11參與側(cè)根原基萌生、不定根伸長(zhǎng)和根表皮細(xì)胞分化為根毛，最終增加根系生物量，促進(jìn)吸水，幫助抵御干旱脅迫[30]。干旱處理6和12 h時(shí)GuWOX15在甘草根中被誘導(dǎo)上調(diào)，推測(cè)GuWOX15可能通過(guò)調(diào)控根的發(fā)育以抵御干旱脅迫。蔡璐羽等[31]研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著增加WOX5在大豆側(cè)根尖和主根尖的表達(dá)。GuWOX1在側(cè)根的表達(dá)量最高，并且在缺磷處理12 h時(shí)，在根中被上調(diào)表達(dá)，推測(cè)GuWOX1可能與其同源基因AtWOX5有相似的功能，在根尖分生組織發(fā)育中起作用，參與根的形成，在缺磷條件下增加根系表面積，提高對(duì)養(yǎng)分吸收。此外，GuWOX1在幼葉內(nèi)有較高的表達(dá)，說(shuō)明了GuWOX1可能在其他組織部位發(fā)揮作用。本研究結(jié)果中，甘草的葉和根中的WOX基因在脅迫條件下整體表達(dá)水平較高，說(shuō)明GuWOX在甘草響應(yīng)干旱、鹽和缺磷脅迫中發(fā)揮積極作用。

有研究表明，WOX基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受IAA、ABA和GA等激素的調(diào)節(jié)[15]。本實(shí)驗(yàn)中，在GuWOX啟動(dòng)子區(qū)域觀察到大量激素響應(yīng)元件，包括分別參與ABA、IAA、SA、GA反應(yīng)中的順式作用元件ABRE、TGA-element、TCA-element、GARE-motif，因此，WOX基因參與ABA、GA等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在擬南芥中，外源施加GA后，AtWOX14過(guò)表達(dá)會(huì)刺激GA3-氧化酶(GA3ox)合成代謝基因的表達(dá)并抑制GA2-氧化酶(GA2ox)分解代謝基因，促進(jìn)生物活性GA的積累[32]。本研究中，與AtWOX14親緣關(guān)系較近的GuWOX12在GA3處理下，3 h時(shí)在甘草根中被誘導(dǎo)上調(diào)，推測(cè)外源施加GA3可能通過(guò)增加植物體內(nèi)GA含量，調(diào)節(jié)甘草生長(zhǎng)發(fā)育。在ABA處理下，甘草根中5個(gè)GuWOX基因在處理6 h時(shí)均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，此外，順式作用元件分析表明這5個(gè)GuWOX基因均具有ABA響應(yīng)元素。ABA在植物抵御干旱脅迫的機(jī)制中作為一種化學(xué)信號(hào)，通過(guò)誘導(dǎo)植物氣孔關(guān)閉，減少蒸騰作用導(dǎo)致的水分散失，從而有助于植物保存水分[33-34]。GuWOX15應(yīng)答干旱脅迫及外源ABA處理的表達(dá)模式相近，干旱和ABA處理12 h時(shí)均上調(diào)表達(dá)，這與桑樹中BpWOX8被這兩種處理誘導(dǎo)上調(diào)的結(jié)果一致[35]。因此，GuWOX基因家族可能通過(guò)介導(dǎo)植物激素調(diào)節(jié)途徑，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和抵御逆境脅迫中發(fā)揮作用。

本研究獲得了16個(gè)GuWOX基因分為3個(gè)分支，熒光定量結(jié)果表明，GuWOX1在側(cè)根中的表達(dá)量較高，GuWOX15在莖中的表達(dá)量較高。GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6、GuWOX12和GuWOX15在非生物脅迫和激素處理的不同時(shí)間被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明了GuWOX參與甘草生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫的應(yīng)答以及植物激素調(diào)節(jié)，并且克隆得到GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6、GuWOX12共4個(gè)基因，分別編碼184、237、237、191個(gè)氨基酸。后續(xù)將對(duì)其功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，為甘草抗逆新品種選育提供參考。