持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉酚酸含量及其抗氧化活性的影響

周 正，白 玲，余 燕，楊在君，吳一超,2*，彭正松,3

(1 西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川南充 637009；2 西華師范大學(xué)組織修復(fù)材料工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 四川南充 637002；3 西昌學(xué)院, 四川西昌 615000)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)多年生草本植物，其根肥厚、肉質(zhì)，表皮朱紅色、內(nèi)白色[1]，其酚酸類(lèi)成分主要為單酚酸(原兒茶醛、咖啡酸、丹參素)和多酚酸(迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B)[2]，具有顯著的抗氧化、抗肝損傷、抗腫瘤和保護(hù)腦組織[3-6]等作用?！ǖ?號(hào)’(CDS-1)(川審藥2011002)是經(jīng)審定的第一個(gè)川丹參品種，有效成分含量高，生育期長(zhǎng)，株高60～75 cm，根粗短、肥厚，易折斷，在一定的區(qū)域內(nèi)抗逆性以及適應(yīng)性較強(qiáng)[7-8]。

全球氣候變化不斷加劇，干旱成為抑制植物生長(zhǎng)最嚴(yán)重的非生物脅迫[9]。干旱會(huì)引發(fā)藥用植物一系列形態(tài)、生理、生化和分子水平的變化，對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)和次生代謝物的積累造成嚴(yán)重影響[10]。藥用植物對(duì)干旱等逆境的響應(yīng)可以有效促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累，影響品質(zhì)的形成。有研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫早期黃芩苷含量在黃芩莖葉中不斷上升，而根系中則隨脅迫加重持續(xù)增加[11]；七葉一枝花根莖中總皂苷含量隨土壤水分含量的降低先增加后減少[12]；干旱脅迫會(huì)使丹參植株矮化，生物量降低，但促使葉片中酚酸含量增加[13]；輕度干旱可提高丹參生物量，對(duì)丹參酮和丹酚酸B積累有促進(jìn)作用[14]。對(duì)大多數(shù)藥用植物而言，適度干旱脅迫可增加次生代謝產(chǎn)物的積累，提高藥用植物的品質(zhì)，川丹參道地產(chǎn)區(qū)四川中江等地每年干旱頻發(fā)，春旱和伏旱尤甚，對(duì)丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)有顯著影響。

川丹參是川產(chǎn)大宗中藥材，近年來(lái)市場(chǎng)需求不斷增加，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)生大量非傳統(tǒng)藥用部位物質(zhì)(莖、葉)，未得到利用，造成巨大的資源浪費(fèi)。丹參地上部分占全株生物量的60%～70%，總酚酸含量可達(dá)干重5%～8%，川丹參冬季不倒苗，地上部分具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，本研究以CDS-1為材料，采用土壤水分脅迫法，研究丹參在持續(xù)水分脅迫下，不同月份莖葉酚酸含量和抗氧化活性的變化規(guī)律，初步明確丹參莖葉中酚酸及其抗氧化能力對(duì)土壤水分脅迫的響應(yīng)行為，為丹參莖葉的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的理論指導(dǎo)，也為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展丹參抗旱性和生態(tài)種植技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

材料為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)張利教授課題組提供的‘川丹參1號(hào)’(CDS-1)，采用土壤水分脅迫法對(duì)丹參進(jìn)行長(zhǎng)期水分脅迫。將土壤和營(yíng)養(yǎng)土按體積比4∶1拌勻，裝盆(直徑28 cm，高20 cm)，每盆8 kg左右。采用烘干法測(cè)定土壤絕對(duì)含水量，本次試驗(yàn)土壤最大持水量為22.9%，以此為基礎(chǔ)設(shè)定每個(gè)水分脅迫處理組的土壤相對(duì)含水量(SRWC)。

于2020年3月10日，選擇粗細(xì)均勻的CDS-1種根，種植于花盆中，統(tǒng)一管理，種植過(guò)程中定量施肥2次。丹參植株30%以上開(kāi)始長(zhǎng)出花序時(shí)(2020年6月17日)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的25盆，隨機(jī)分為5個(gè)處理組，開(kāi)始水分脅迫，至12月底收獲。以田間最大持水量記為100%，設(shè)置土壤相對(duì)含水量75%(偏濕)、65%(適宜)、55%(輕度干旱)、45%(中度干旱)和35%(重度干旱)5個(gè)水分脅迫處理組，計(jì)算每一盆對(duì)應(yīng)水分脅迫處理的總質(zhì)量，每天下午6：00補(bǔ)足失水質(zhì)量。分別于9月1日、10月1日和11月1日每組隨機(jī)取樣3株莖葉進(jìn)行酚酸含量測(cè)定和抗氧化活性評(píng)價(jià)。

1.2 試劑與儀器

BR級(jí)1 mol/L福林酚購(gòu)自源葉生物；96% DPPH和98% ABTS購(gòu)自Macklin；98.38%丹參素(Batch No.19060920)、99.52%(+)-兒茶素(Batch No.19080110)、99.88%原兒茶醛(Batch No.19071608)、99.48%咖啡酸(Batch No.19032003)、99.02%迷迭香酸(Batch No.19053107)、98.95%丹酚酸A(Batch No.19072411)和99.79%丹酚酸B(Batch No.19062808)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)買(mǎi)于成都曼斯特生物科技有限公司。主要儀器包括22331 Hamburg離心機(jī)(Eppendorf AG)、酶標(biāo)儀(Gene Company Limited)、Agilent 1200-LC高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc.)、Dura12FV實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(澤拉布儀器科技上海有限公司)、PS-60A超聲波清洗機(jī)(東莞市浩康超聲波設(shè)備有限公司)。

1.3 丹參莖葉酚酸提取

分別于2020年9月1日、10月1日及11月1日，采集各脅迫處理的丹參莖葉，分別記為SL-8、SL-9、SL-10，-80 ℃保存。精密稱(chēng)取丹參莖葉1.00 g，用均質(zhì)器磨碎，置三角瓶中，加入80%乙醇100 mL，室溫超聲提取30 min，靜置。取上清液，0.22 μm的微孔濾頭濾過(guò)，取續(xù)濾液用于HPLC分析，另取1 mL提取液稀釋30倍，作為總酚酸(TPA)含量測(cè)定和抗氧化活性評(píng)價(jià)供試品溶液。

1.4 丹參莖葉TPA含量的測(cè)定

采用福林酚法參考Wang等[15]的方法優(yōu)化后測(cè)定SL-8、SL-9、SL-10的TPA含量。取0.3 mL樣品溶液，加入0.25 mol·L-1的福林酚溶液0.3 mL混勻，靜置3 min后加入15% Na2CO30.6 mL混勻靜置30 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，加入96孔板，每孔300 μL，以15% Na2CO3作空白對(duì)照，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，每次3孔，以丹酚酸B當(dāng)量計(jì)算TPA含量，結(jié)果取平均值。

1.5 丹參莖葉主要酚酸成分含量的HPLC測(cè)定

丹參莖葉8種酚酸成分含量采用HPLC同時(shí)測(cè)定，使用Agilent 1200-LC高效液相色譜儀在島津ODS-3(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱上完成。流動(dòng)相為0.1%磷酸-水(A)—乙腈(B)，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。梯度洗脫程序：0～10 min，15%～20% B；10～11 min，20%～25% B；11～20 min，25%～50% B；20～21 min，50%～90% B；后運(yùn)行6 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：分別取沒(méi)食子酸、丹參素、(+)-兒茶素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別制得濃度為0.092 0、0.123 0、0.093 3、0.095 0、0.084 0、0.095 0、0.079 8和0.038 5 mg/mL的混標(biāo)溶液，并稀釋為一系列濃度梯度。取不同濃度混標(biāo)進(jìn)樣，按上述色譜方法進(jìn)行HPLC分析，以濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(表1)。另取1.3中樣品溶液在相同條件下進(jìn)行HPLC分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算各樣品中酚酸含量，平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

表1 8種酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.6 丹參莖葉抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.6.1 DPPH·清除率的測(cè)定將Wu等的方法[16]改進(jìn)，測(cè)定DPPH·清除率。在96孔板中加入0.1 mg·mL-1的DPPH-乙醇溶液200 μL，然后依次加入1.3節(jié)稀釋30倍的樣品溶液0、10、20、30、40、50、60和70 μL，用80%乙醇補(bǔ)足300 μL，室溫避光反應(yīng)30 min，并在517 nm處測(cè)定溶液吸光度。VC作陽(yáng)性對(duì)照，所有試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。按下式計(jì)算DPPH·清除率：

式中，A1為樣品+DPPH·溶液的吸光度；A2為樣品+80%乙醇的吸光度；A0為80%乙醇+DPPH·溶液的吸光度。

1.6.2 ABTS·+清除率將Wu等的方法[16]改進(jìn)后進(jìn)行ABTS·+清除率測(cè)定。在96孔板中加入ABTS·+工作液(734 nm處吸光度A734在0.700左右)200 μL，然后依次加入1.3節(jié)稀釋30倍的樣品溶液0、10、20、30、40、50、60和70 μL，用80%乙醇補(bǔ)足300 μL，避光室溫靜置10 min，在734 nm處測(cè)定吸光度。以VC作陽(yáng)性對(duì)照，所有試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。按下式計(jì)算ABTS·+清除率：

式中，A1為樣品+ABTS·+的吸光度；A2為樣品+80%乙醇的吸光度；A0為80%乙醇+ABTS·+的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總、整理，采用SPSS statistics 20進(jìn)行單因素方差分析(Duncan’s multiple range tests，P<0.05)、計(jì)算抗氧化的IC50值和進(jìn)行相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)為平均值±SD(n = 3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉TPA含量的影響

從圖1可知，在持續(xù)水分脅迫條件下，丹參8月份莖葉(SL-8)中總酚酸(TPA)的含量隨著土壤相對(duì)含水量(SRWC)降低而逐漸增加，在SRWC為35%時(shí)(重度干旱)達(dá)到最高(11.86 mg·g-1)，并顯著高于SRWC為75%(偏濕)和65%(適宜)水分脅迫處理，而與SRWC為55%(輕度干旱)和45%(中度干旱)時(shí)無(wú)顯著差異。丹參9月份莖葉(SL-9)TPA含量則隨著SRWC降低先升后降，并在輕度干旱時(shí)達(dá)到最高(9.59 mg·g-1)，此時(shí)顯著高于其他4個(gè)水分處理組。丹參10月份莖葉(SL-10)的TPA含量隨著SRWC的降低呈增加的趨勢(shì)，并在中度干旱時(shí)達(dá)到最高(22.64 mg·g-1)，但與輕度和重度干旱處理均無(wú)顯著差異，而輕度到重度干旱脅迫處理均顯著高于偏濕和適宜水分處理組。

SL-8、SL-9和SL-10分別表示8、9、10月份的樣品；小寫(xiě)字母表示相同月份內(nèi)水分處理組間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；大寫(xiě)字母表示相同處理組內(nèi)不同月份在0.05水平差異顯著(P<0.05)

同時(shí)，在相同水分處理?xiàng)l件下，各月份丹參莖葉樣品TPA含量均以SL-9最低，僅為SL-8的41.4%～91.1%和SL-10的24.0%～79.9%；在偏濕處理組以SL-8最高，而在適宜水分和干旱脅迫下(SRWC為35%～65%時(shí))均以SL-10最高。以上結(jié)果表明，丹參莖葉TPA含量對(duì)土壤水分響應(yīng)敏感，不同月份樣品TPA含量隨著SRWC降低總體呈相似的增加趨勢(shì)，但不同月份間差異顯著，均以10月份樣品含量較高。

2.2 持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉主要酚酸含量的影響

土壤水分脅迫處理丹參莖葉樣品中8種酚酸的含量測(cè)定結(jié)果(圖2、表2)顯示，迷迭香酸、丹酚酸B、咖啡酸和原兒茶醛在各月份和各處理組均有顯著積累，而丹參素和丹酚酸A主要在SL-9的適宜水分和重度干旱處理組積累，(+)-兒茶素僅在SL-9的偏濕處理組有檢出(0.005 mg·g-1)，沒(méi)食子酸在所有樣品中均未檢出。同時(shí)，通過(guò)不同月份樣品對(duì)比發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸、丹參素在SL-9中積累顯著高于SL-8和SL-10，原兒茶醛在SL-8中積累較多，丹酚酸B在所有月份樣品中均有積累。另外，隨著SRWC降低，丹參莖葉迷迭香酸含量呈現(xiàn)V形變化，而丹參素含量卻顯著增加。

表2 不同月份水分脅迫對(duì)8種酚酸含量影響

1.沒(méi)食子酸；2.丹參素；3.(+)-兒茶素；4.原兒茶醛；5.咖啡酸；6.迷迭香酸；7.丹酚酸B；8.丹酚酸A

2.3 持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉抗氧化活性的影響

圖3顯示，不同SRWC處理下各月份丹參莖葉提取物都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且其DPPH·和ABTS·+清除率具有顯著的濃度依耐性。其中，SL-8的抗氧化活性從強(qiáng)到弱的依次是SRWC為45%、55%、65%、75%、35%水分處理組，表明SL-8在輕度和中度干旱脅迫下抗氧化活性最強(qiáng)，但在重度干旱脅迫下抗氧化活性最弱；不同SRWC處理的SL-9的ABTS·+、DPPH·清除能力差異不大，SL-9樣品在偏濕或者適宜水分下的抗氧化活性強(qiáng)于干旱脅迫；SL-10的ABTS·+清除率隨SRWC的降低逐漸增強(qiáng)，而對(duì)DPPH·的清除率從強(qiáng)到弱依次是SRWC為 45%、35%、65%、55%、75%水分處理組，表明在10月份丹參莖葉酚酸在中度和重度干旱下具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

圖3 不同月份水分脅迫樣品的DPPH·和ABTS·+清除率

3 討 論

3.1 持續(xù)水分脅迫與丹參莖葉酚酸含量的關(guān)系

干旱脅迫會(huì)在植物中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量活性氧(ROS)[17-18]。酚類(lèi)(酚酸)是植物中適應(yīng)性最強(qiáng)、分布最廣泛的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，參與植物抵御外部環(huán)境壓力，能夠清除多余ROS[19]。酚酸在植物體內(nèi)的生物合成通常是由逆境脅迫所引起，其中最重要的是干旱(水分)脅迫，干旱脅迫下卡琪花蒂瑪(Labisiapumila)[20]、撒爾維亞(Salviaofficinalis)[21]和錫那羅亞鼠尾草(Salviasinaloensis)[22]中酚類(lèi)化合物的生物合成有所增加。丹參的酚酸類(lèi)化合物主要由苯丙烷類(lèi)代謝途徑產(chǎn)生，除丹參素和咖啡酸可由氨基酸直接氧化脫氨基生成外，其余均可看作二者的衍生物[23]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷類(lèi)途徑的關(guān)鍵限速酶，催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚酸合成主要中間體反式肉桂酸[24]。酚酸類(lèi)化合物的積累可能與水分脅迫下PAL的活化有關(guān)，PAL的活性增加了對(duì)脅迫的反應(yīng)，通過(guò)增加酚酸的含量來(lái)增強(qiáng)抗氧化能力，在植物對(duì)非生物脅迫的耐受性方面發(fā)揮重要作用[25-26]。

本研究結(jié)果表明丹參對(duì)干旱的耐受性可能與葉片中豐富的酚酸有關(guān)，當(dāng)土壤的相對(duì)含水量降低到一定程度達(dá)到干旱水平時(shí)，丹參會(huì)啟動(dòng)酚酸相關(guān)代謝途徑關(guān)鍵酶系統(tǒng)，激活其中的關(guān)鍵酶，從而影響酚酸類(lèi)物質(zhì)的合成與積累[27]。可能是由于適當(dāng)干旱脅迫提高了酚酸合成相關(guān)酶的活性，而偏濕或適宜水分下的酶活性不如中、重度干旱時(shí)的酶活性；但是嚴(yán)重干旱反而會(huì)降低酶活性，不利于酚酸的合成與積累[28]。干旱下丹參通過(guò)增加具有抗氧化活性的酚酸類(lèi)物質(zhì)含量而適應(yīng)環(huán)境變化[29]。

3.2 持續(xù)水分脅迫與丹參莖葉抗氧化活性的關(guān)系

干旱會(huì)在植物中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量ROS，打破植物體內(nèi)氧化還原平衡，影響植物正常生長(zhǎng)，酚酸類(lèi)化合物能夠有效清除ROS，對(duì)植物起到保護(hù)作用[26]。本研究通過(guò)不同程度持續(xù)水分脅迫下丹參莖葉酚酸的抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)，它們都具有較強(qiáng)清除DPPH·和ABTS·+的能力，與VC活性接近。其中，SL-8中度干旱處理組的DPPH·清除活性較偏濕處理組顯著提高40.5%，ABTS·+清除活性提高了39.3%；SL-10中度干旱處理組的DPPH·和ABTS·+的清除活性較偏濕處理組分別顯著提高了58.7%和53.8%。在輕、中度干旱脅迫下，丹參莖葉酚酸的抗氧化活性大于偏濕或重度干旱處理，表明適度干旱有利于提高丹參莖葉抗氧化活性，但過(guò)度干旱或偏濕反而會(huì)降低抗氧化活性。

同時(shí)，在持續(xù)水分脅迫下，丹參莖葉總酚酸(TPA)含量變化的趨勢(shì)與其抗氧化活性變化的趨勢(shì)一致，酚酸積累多的丹參處理組其抗氧化活性也較高。李晶等[30]研究發(fā)現(xiàn)南丹參的抗氧化活性是其多個(gè)化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，其研究結(jié)果表明丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、咖啡酸等與抗氧化活性的相關(guān)性較大，且均與抗氧化活性呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉抗氧化活性的影響可能表現(xiàn)在水分脅迫影響了丹參莖葉酚酸的含量的積累，從而影響其抗氧化活性能力。

此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)SL-8和SL-10的中度和重度干旱脅迫更利于丹參莖葉TPA的積累和抗氧化活性的提高，而SL-9中輕度干旱脅迫更利于TPA的積累和抗氧化活性的提高。對(duì)于相同土壤相對(duì)含水量處理組，丹參莖葉TPA含量和抗氧化活性時(shí)空(月份間)變化顯著。就抗氧化活性而言，除重度干旱處理組外，其他處理組整體趨勢(shì)為SL-8抗氧化活性最強(qiáng)，SL-9次之，SL-10最弱。引起相同處理的不同月份樣品之間差異的原因可能是由于8月、9月、10月3個(gè)月的氣候變化，可能是由于高溫和低溫脅迫與水分脅迫共同導(dǎo)致。有研究表明，溫度的逐漸降低、日照時(shí)間減少等可能會(huì)影響到丹參植株的生長(zhǎng)、酶的活性、代謝物的積累等[31]。后續(xù)還需要進(jìn)一步研究溫度等氣候因子對(duì)丹參莖葉酚酸含量的影響，以期能充分利用丹參植物資源，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究表明，持續(xù)水分脅迫對(duì)丹參莖葉酚酸含量和抗氧化活性有顯著影響。但水分脅迫壓力程度和時(shí)間段(8月、9月和10月)的不同，丹參莖葉總酚酸、主要酚酸含量及其抗氧化能力都存在差異。中度和重度干旱脅迫下丹參莖葉酚酸含量最高，10月份莖葉總酚酸含量最高，8月份莖葉的總體抗氧化活性最強(qiáng)。土壤相對(duì)含水量為45%時(shí)(中度干旱)8月份和9月份莖葉中主要酚酸含量最高，在9月份莖葉中不同處理組差異不大。本研究丹參莖葉酚酸含量的增加與文獻(xiàn)中其他植物和丹參品種的數(shù)據(jù)基本一致，表明這可能是丹參對(duì)干旱誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的一種應(yīng)激反應(yīng)。這些結(jié)果還表明，干旱可以成功地用于增強(qiáng)丹參莖葉中酚酸等抗氧化物質(zhì)的合成和積累，并可以通過(guò)科學(xué)的灌溉技術(shù)來(lái)增加丹參莖葉中酚酸的含量，促進(jìn)丹參的綜合利用。