邱科先 劉曉芬

感冒作為一種常見的呼吸道疾病，其主要臨床表現(xiàn)為頭疼、發(fā)熱、咳嗽、鼻塞、流鼻涕、過敏等。通常用于治療這些癥狀的藥物包括解熱鎮(zhèn)痛藥（對乙酰氨基酚）、鎮(zhèn)咳藥（氫溴酸右美沙芬）、抗組胺藥（琥珀酸多西拉敏）[1-4]。美國Vicks的感冒藥有DayQuil和NyQuil兩種，其中NyQuil的主成分是對乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氫溴酸右美沙芬。據(jù)此，采用明膠制成一種含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊的復(fù)方口服固體制劑，其制備方法如中國專利201310359375.2所述[5]，目前對于該產(chǎn)品的研究仍有待改進(jìn)。

美國藥典43版中，琥珀酸多西拉敏的有關(guān)物質(zhì)測定采用高效液相色譜法（HPLC）[6]；《中華人民共和國藥典》2020年二部中，對乙酰氨基酚和氫溴酸右美沙芬的有關(guān)物質(zhì)測定采用HPLC[7-8]，但色譜條件不同?，F(xiàn)有技術(shù)中還沒有能夠同時測定含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊有關(guān)物質(zhì)的方法[6-10]。為節(jié)約時間和人力，方便生產(chǎn)檢驗，將上述3種物質(zhì)的有關(guān)物質(zhì)測定方法進(jìn)行統(tǒng)一，本研究采用同一種色譜條件測定含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊有關(guān)物質(zhì)，并進(jìn)行方法驗證。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

一種含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊（規(guī)格對乙酰氨基酚325 mg；琥珀酸多西拉敏6.25 mg；氫溴酸右美沙芬15 mg）；對乙酰氨基酚內(nèi)部對照品（批號RS-18099，純度99.0%）購自安丘市魯安藥業(yè)有限責(zé)任公司；氫溴酸右美沙芬（批號100201-201204，純度94.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；琥珀酸多西拉敏（批號R08200，純度99.9%，USP對照品）購自赫淳生物科技（上海）有限公司；右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ（批號38400，純度99.7%）、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ（批號145192，純度98.7%）、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ（批號35952，純度99.7%）、右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ（批號32441，純度98.1%）購自英國LGC公司。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent-Technologies公司）和Thermo Fisher Ultimate3000型高效液相色譜儀（賽默飛世尓科技有限公司），包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器；電子天平Secura255D、酸度計（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；超聲波清洗儀（深圳德瑞超聲波設(shè)備有限公司）；多功能振蕩器（常州國華電器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；藥品強(qiáng)光穩(wěn)定性試驗箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司）

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備 1）稀釋液：0.01 mol/L鹽酸-甲醇（8∶2）。2）雜質(zhì)對照品溶液：取右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ對照品各適量，精密稱定，用稀釋液溶解并稀釋，制成含各已知雜質(zhì)為40 μg/ml的混合溶液，作為雜質(zhì)對照儲備溶液；取上述雜質(zhì)對照儲備溶液2 ml，用稀釋液稀釋至20 ml，作為雜質(zhì)對照品溶液。3）工作對照溶液：取對乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氫溴酸右美沙芬對照品適量，精密稱定，用稀釋液溶解并稀釋，制成含對乙酰氨基酚91 μg/ml、琥珀酸多西拉敏1.75 μg/ml和氫溴酸右美沙芬4.2 μg/ml的溶液，作為工作對照溶液。4）供試品溶液：取含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊，置于250 ml量瓶中，加約120 ml稀釋液，加熱使囊殼崩解，震搖使混合均勻，用稀釋液稀釋，制成含對乙酰氨基酚9 100 μg/ml、琥珀酸多西拉敏175 μg/ml和氫溴酸右美沙芬420 μg/ml的溶液，濾過，作為供試品溶液。5）自身對照溶液：取“4）”項下供試品溶液1 ml，置于100 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液。6）系統(tǒng)適用性溶液：取“2）”項下雜質(zhì)對照儲備溶液1 ml，置于10 ml量瓶中，用“3）”項下工作對照溶液稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相A：多庫酯鈉和乙酸銨的水溶液（取多庫酯鈉4.45 g和乙酸銨1.54 g，加水2 000 ml，溶解，調(diào)節(jié)pH至4.5）；流動相B：乙腈-冰醋酸（2∶1），梯度洗脫見表1；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：50 μl。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 系統(tǒng)適用性試驗 取系統(tǒng)適用性溶液50 μl，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

1.3.4 強(qiáng)降解試驗 取含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊適量，置于一次性塑料培養(yǎng)皿，分別置于高溫（60 ℃烘箱12 d），光照（4 500 Lux和400 μW/cm2，12 d）條件下進(jìn)行強(qiáng)制破壞，破壞結(jié)束后按照供試品溶液的配制方式配制溶液；取含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊適量，置于100 ml量瓶中，分別酸降解（加0.5 mol/L鹽酸溶液5 ml，60 ℃水浴中放置2 h）、堿降解（加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，60 ℃水浴中放置2 h）、氧化降解（加入20 ml稀釋液置于50 ℃水浴中加熱使囊殼崩解，加30%過氧化氫溶液室溫放置2 h），破壞后取出溶液，冷卻至室溫，堿降解溶液通過加0.5 mol/L鹽酸溶液5 ml中和溶液，酸降解溶液通過加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml中和溶液，再分別用稀釋液稀釋至刻度，濾過，取濾液按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

1.3.5 線性研究 取對乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏、氫溴酸右美沙芬和各已知雜質(zhì)對照品適量，精密稱定，加稀釋液稀釋，制成各成分濃度相對于樣品中主成分濃度0.05%、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%水平的溶液，作為線性溶液。取上述溶液按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，獲得相關(guān)系數(shù)和計算相對響應(yīng)因子。

1.3.6 檢測限和定量限 取各雜質(zhì)線性溶液的最低濃度溶液，用稀釋液稀釋成一系列溶液，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以能檢測的最低濃度作為檢測限濃度，以能定量的最低濃度作為定量限濃度。

1.3.7 精密度試驗 1）重復(fù)性 取含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊，置于250 ml量瓶中，加入相對于樣品溶液的0.28%水平的雜質(zhì)，加約150 ml稀釋液，加熱使囊殼崩解，震搖使混合均勻，用稀釋液稀釋，濾過，配制6份，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)的含量（未知雜質(zhì)校正因子按1.0計算），采用不加校正因子的主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量。2）中間精密度 由另一試驗員于不同測試日期按重復(fù)性項下配制6份溶液，用不同的HPLC系統(tǒng)，不同的對照溶液和不同批號的柱子，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并按重復(fù)性項下計算各雜質(zhì)的含量。

1.3.8 加樣回收率試驗 取含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊，置于250 ml量瓶中，分別加入相對于樣品溶液的0.05%、0.24%、0.95%和1.43%水平的雜質(zhì)，加約150 ml稀釋液，加熱使囊殼崩解，震搖使混合均勻，用稀釋液稀釋，濾過，每個水平配制3份，按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用加校正因子的主成分自身對照法計算各已知雜質(zhì)的測得濃度，再計算回收率。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗 將“1.3.7”項下重復(fù)性樣品溶液分別放置室溫條件和冰箱（2～8 ℃）條件下儲存4 d，4 d后按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

1.3.10 耐用性試驗 1）改變流動相初始比例 按“1.3.7”項下重復(fù)性樣品溶液的配制方式配制一份樣品溶液，按“1.3.2”項下條件以不同流動相初始比例（46∶54、48∶52）進(jìn)樣，記錄峰面積，并按“1.3.7”項下計算各雜質(zhì)的含量。2）改變流動相A的pH“1.3.7”項下重復(fù)性樣品溶液的配制方式配制一份樣品溶液，按“1.3.2”項下條件以不同流動相A pH（4.45、4.55）進(jìn)樣，記錄峰面積，并按“1.3.7”項下計算各雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

結(jié)果表明系統(tǒng)適用性溶液中，各已知雜質(zhì)間的分離度均大于1.5。見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液的高效液相色譜

2.2 強(qiáng)降解試驗

結(jié)果表明，在上述破壞條件下，各主成分的純度角均小于純度閾值，對乙酰氨基酚與最近的峰的分離度在1.0～1.4，氫溴酸右美沙芬與最近的峰的分離度均為2.4，琥珀酸多西拉敏與最近的峰的分離度在8.2～8.5。各已知雜質(zhì)、未知雜質(zhì)與主成分的分離度均大于1.0，均能較好分離。

2.3 線性研究

結(jié)果顯示各待測成分的相關(guān)系數(shù)均為1.00，右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ和右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ相對于右美沙芬的相對響應(yīng)因子分別為1.22、0.79、4.99和1.05。

2.4 檢測限和定量限

結(jié)果表明主成分和各雜質(zhì)的檢測限在0.000 2%～0.024%范圍內(nèi)，定量限在0.000 4%～0.043%范圍內(nèi)，低于0.05%。

2.5 精密度試驗

結(jié)果表明，重復(fù)性和中間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0%～8%范圍內(nèi)，均小于10%。

2.6 加樣回收率試驗

結(jié)果表明，右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ和右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ的平均回收率在91%～114%范圍內(nèi)，RSD均小于10%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

結(jié)果表明，各已知雜質(zhì)的差值在0.01%～0.08%范圍內(nèi)，對乙酰氨基酚總雜質(zhì)的差值均為0.01%，均未檢出琥珀酸多西拉敏雜質(zhì)，氫溴酸右美沙芬總雜質(zhì)的差值在0.1%～0.2%范圍內(nèi)。

2.8 耐用性試驗

結(jié)果表明，在色譜條件輕微變動情況下，各已知雜質(zhì)的差值在0.01%～0.02%范圍內(nèi)，對乙酰氨基酚總雜質(zhì)的差值為0.00%～0.01%，均未檢出琥珀酸多西拉敏雜質(zhì)，氫溴酸右美沙芬總雜質(zhì)的差值在0.02%～0.03%范圍內(nèi)。

3 討論

本研究所建方法擬檢測的是含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊中對乙酰氨基酚有關(guān)物質(zhì)、氫溴酸右美沙芬有關(guān)物質(zhì)（右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ和未知雜質(zhì)）、琥珀酸多西拉敏有關(guān)物質(zhì)。通過驗證試驗，結(jié)果表明該色譜條件下能有效分離各已知雜質(zhì)和主成分，上述色譜條件對雜質(zhì)的測定無影響，同時本方法能滿足雜質(zhì)檢測靈敏度的要求，精密度和準(zhǔn)確度均良好。此外，樣品溶液在室溫條件和冰箱（2～8 ℃）條件可穩(wěn)定儲存至少4 d，本方法在改變一定流動相初始比例、流動相A的pH變動情況下耐用性良好。

通過原輔料和成品的強(qiáng)降解研究，確認(rèn)未知雜質(zhì)是輔料峰或是來源于各主成分的有關(guān)物質(zhì)，進(jìn)而采用HPLC峰保留時間對比法進(jìn)行各個主成分的有關(guān)物質(zhì)的定性歸屬[11]。

對乙酰氨基酚降解會產(chǎn)生雜質(zhì)——對氨基酚，因帶有苯胺結(jié)構(gòu)，具有潛在的基因毒性。本研究色譜采集時間長，而對氨基酚需避光，且穩(wěn)定性較其他雜質(zhì)差，因此不采用本研究方法進(jìn)行對氨基酚的測定。

3.1 測定波長的選擇

對乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏、氫溴酸右美沙芬和右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅱ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅲ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ對照品，以“1.3.1”項下稀釋液作為溶劑進(jìn)行紫外光譜掃描，氫溴酸右美沙芬、右美沙芬雜質(zhì)Ⅰ、右美沙芬雜質(zhì)Ⅳ結(jié)果在280 nm的波長處有1個較強(qiáng)的吸收峰，其他雜質(zhì)和主成分也有較大吸收，因此選用280 nm作為有關(guān)物質(zhì)的測定波長。

3.2 流動相水相的選擇

在本研究中，以不同pH的多庫酯鈉和乙酸銨的水溶液（pH為4.3～4.7）分別作為流動相水相，按照一定比例組成流動相梯度洗脫，從各主成分及其有關(guān)物質(zhì)的分離度、拖尾因子和信噪比綜合考慮，選擇pH 4.5的多庫酯鈉和乙酸銨的水溶液作為流動相水相[12]。

3.3 洗脫方式的選擇

在本研究中，以“1.3.2”項下色譜條件中流動相A∶流動相B不同比例的流動相進(jìn)行梯度洗脫，從洗脫時間、各雜質(zhì)的分離情況、各主成分和各雜質(zhì)的信噪比、基線平穩(wěn)情況等方面綜合考慮，最終確定了有關(guān)物質(zhì)的梯度洗脫方式[12]。

3.4 進(jìn)樣體積的選擇

在本研究中，以25 μl和50 μl分別作為進(jìn)樣體積，從各雜質(zhì)的分離情況、各主成分和各雜質(zhì)的信噪比等方面綜合考慮，最終確定了50 μl作為進(jìn)樣體積[12]。

3.5 柱溫箱溫度的選擇

在本研究中，以25 ℃、30℃、35℃分別作為柱溫，從各雜質(zhì)的分離情況、主成分的拖尾因子和運(yùn)行時間等綜合考慮，最終確定了30 ℃作為柱溫箱的溫度[12]。

綜上所述，本研究所建方法能同時測定對乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氫溴酸右美沙芬有關(guān)物質(zhì)，簡便高效，靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性良好。各已知雜質(zhì)、未知雜質(zhì)能與主成分和輔料峰有效分離，可用于含對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的軟膠囊有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。