曾凡洲 劉志鈺 朱兵峰 王欽超 張貴民,* 魏榮省

(1 魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司，臨沂 273400；2 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，臨沂 273400；3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，臨沂 273400)

紐莫康定B0(pneumocandin B0)是由真菌Glarea lozoyensis產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是合成抗真菌藥物醋酸卡泊芬凈(caspofungin)的中間體[1-2]。Glarea lozoyensis除能產(chǎn)生B0外，還能產(chǎn)生A0、A1、A2、B0絲氨酸同系物、B1、B2、B5、B5絲氨酸同系物、B6、C0、D0、D2和E0等多種類(lèi)似物，不同氨基酸側(cè)鏈修飾或氨基酸連接順序的不同導(dǎo)致了紐莫康定化合物的結(jié)構(gòu)多樣性[3-4]。其中，紐莫康定C0是B0的同分異構(gòu)體，為紐莫康定B0生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵工藝雜質(zhì)。紐莫康定B0和C0結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。兩者結(jié)構(gòu)差別僅在于紅色標(biāo)注羥基位置的不同。

當(dāng)今，藥品申報(bào)在雜質(zhì)控制方面越來(lái)越嚴(yán)格。藥物中含有的雜質(zhì)會(huì)降低療效和影響穩(wěn)定性，有的甚至對(duì)人體健康有害或產(chǎn)生其他不良反應(yīng)[5]。所以在紐莫康定B0研制過(guò)程中，有必要對(duì)紐莫康定C0制備出高純度的樣品，為結(jié)構(gòu)鑒定、質(zhì)量研究及雜質(zhì)傳遞研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。制備型高效液相色譜法在藥物雜質(zhì)研究應(yīng)用中越來(lái)越廣泛[6-7]。本研究以紐莫康定B0中試生產(chǎn)過(guò)程中富集的雜質(zhì)物料為原料，通過(guò)高壓制備色譜、濃縮、干燥等處理過(guò)程，得到了C0干粉，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和確證，開(kāi)發(fā)出了一種操作方便、成品純度高、便于長(zhǎng)期保存的制備工藝。

1 主要儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司)；Csprep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng)(漢邦科技)；DN50制備色譜系統(tǒng)(北京澳諾科技有限公司)；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；DHJK-2020低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SCIENTZ-12ND冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；熱重分析儀，TG209F3(德國(guó)耐馳)；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu)；Scientific Nicolet iS 10紅外光譜儀(美國(guó)Thermo)；INOVA-600核磁共振波譜儀(Varian公司)；Agilent 1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-Tof質(zhì)譜儀(Agilent公司)。

紐莫康定發(fā)酵液(魯南制藥集團(tuán)股份有限公司)；工業(yè)級(jí)二氯甲烷(山東金嶺化工股份有限公司)；工業(yè)甲醇(兗礦國(guó)宏化工有限責(zé)任公司)；制備級(jí)乙腈(濰坊中匯化工有限公司)；改性硅膠(蘇州納微科技股份有限公司)；UniSil ? Hilic 2M硅膠色譜填料(蘇州納微科技有限公司)；紐莫康定C0對(duì)照品(大同市礦區(qū)風(fēng)華生物科技有限公司)，含量95.11%，批號(hào)16002；HPLC用乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定紐莫康定C0

線性洗脫程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱，4.6 mm×250 mm，3.5 μm；波長(zhǎng)220 nm，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40℃，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈。

表1 線性洗脫程序Tab.1 Linear elution procedure

2.2 紐莫康定C0的富集

2.2.1 粗品的制備

紐莫康定粗品以魯南制藥集團(tuán)股份有限公司專(zhuān)利方法制得[2]。具體如下：將經(jīng)真菌Glarea lozoyensis發(fā)酵得到的含有紐莫康定B0的中試發(fā)酵液3000 L(發(fā)酵效價(jià)為675 mg/L)在攪拌的狀態(tài)下，用磷酸調(diào)節(jié)pH值4.2，加入2%的助濾劑硅藻土，混勻，靜置0.5 h，過(guò)濾，得到固體菌渣。菌渣用2倍95%乙醇浸提，過(guò)濾去除菌絲，得浸提液；調(diào)整浸提液的醇濃度至20(V/V)。將其以0.5～1.0 BV/h的速度流經(jīng)D101柱，依次用純化水、30%(V/V)乙醇-水溶液沖洗樹(shù)脂柱，然后用80%(V/V)乙醇-水溶液洗脫樹(shù)脂柱，收集富含紐莫康定B0的洗脫液。在洗脫液中加入0.5%活性炭，在20℃條件下攪拌30 min，過(guò)濾脫色。脫色液經(jīng)過(guò)超濾過(guò)濾后，加水稀釋至30%(V/V)。以0.5～1.0 BV/h的速度流經(jīng)KB-SPE-HLB柱，用含乙醇30%(V/V)溶液沖洗樹(shù)脂柱，再用乙醇80%(V/V)溶液洗脫，收集富含紐莫康定B0的洗脫液。將收集到的紐莫康定B0洗脫液，在30℃條件下真空濃縮，得到紐莫康定B0粗品1.30 kg。經(jīng)HPLC檢測(cè)，粗品中C0的表觀含量為8.78%。

2.2.2 高壓液相色譜富集

在Cs-prep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng)中，以動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)裝柱3 kg改性硅膠。將紐莫康定B0粗品用甲醇、二氯甲烷混合溶液[V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:4]溶解，即為上樣液。流動(dòng)相為V[二氯甲烷(工業(yè))]:V(甲醇):V(水)=42:9:1；上樣量為11.4 g粗品；洗脫流量為480 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為276和210 nm。高壓液相色譜富集在線圖譜見(jiàn)圖2。對(duì)其分段進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，圖2方框標(biāo)注部分(RT 91.23～102.50 min)即為紐莫康定C0出峰位置。

對(duì)紐莫康定粗品連續(xù)上樣，收集紐莫康定C0富集液。將紐莫康定C0雜質(zhì)富集液進(jìn)行減壓濃縮，40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，蒸至無(wú)冷凝液流出時(shí)，加乙醇，繼續(xù)濃縮。直至濃縮液變成干粉，小心刮出雜質(zhì)干粉。經(jīng)HPLC檢測(cè)，其紐莫康定C0色譜純度為78.53 %。

2.3 紐莫康定C0的高壓液相色譜制備

參考楊淵等[8]在親水作用色譜法測(cè)定紐莫康定B0及其雜質(zhì)的研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在DN50制備色譜系統(tǒng)中，以動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)裝柱UniSil?Hilic 2M硅膠色譜填料300 g。在親水作用色譜(HILIC)模式進(jìn)行色譜制備。上樣液配制：每1.0 g雜質(zhì)干粉溶至70 mL甲醇中，0.45 μm尼龍66有機(jī)膜過(guò)濾。進(jìn)樣量：5 mL。流速：120 mL/min。波長(zhǎng)：278 nm。制備洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 紐莫康定C0的制備洗脫程序Tab.2 Elution procedure for the preparation of pneumocandin C0

在線圖譜見(jiàn)圖3。根據(jù)出峰分段收集。結(jié)合HPLC檢測(cè)，確定下圖所示方框標(biāo)注部分(tR為41.41～44.26 min)為紐莫康定C0。

連續(xù)進(jìn)樣，合并收集液。然后對(duì)合并液在40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，進(jìn)行減壓濃縮。對(duì)濃縮液按照表3程序進(jìn)行冷凍干燥。得到雜質(zhì)紐莫康定C0干粉1.7395 g。經(jīng)檢測(cè)，紐莫康定C0色譜純度99.19 %，峰純度999.4(DAD檢測(cè)器)，熱重3.05 %。HPLC圖譜見(jiàn)圖4。

表3 紐莫康定C0的凍干程序Tab.3 Feeze-drying procedure for pneumocandin C0

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定[9-12]

為進(jìn)一步確定本研究制備所得凍干粉為紐莫康定C0，對(duì)其分別進(jìn)行了質(zhì)譜(MS)、紫外吸收光譜(UV)、紅外吸收光譜(IS)、核磁共振譜(1H-NMR、13C-NMR)分析。

2.4.1 質(zhì)譜

測(cè)試條件為ESI(+)。分子離子峰及歸屬見(jiàn)表4。結(jié)果表明：質(zhì)譜測(cè)得本品的加合離子峰[M+H]+，其質(zhì)荷比為m/z1065.6，推定其相對(duì)分子質(zhì)量為1064.6，與紐莫康定C0的相對(duì)分子質(zhì)量一致。

表4 紐莫康定C0凍干粉的加合離子峰及歸屬Tab.4 Molecular ion peaks and attribution of freeze-dried powder for pneumocandin C0

2.4.2 紅外吸收光譜

測(cè)試條件：KBr壓片。紐莫康定C0凍干粉樣品的IR譜見(jiàn)圖5，各吸收峰歸屬見(jiàn)表5。對(duì)紅外吸收光譜的解析如下：

表5 紐莫康定C0凍干粉的IR譜各吸收峰歸屬Tab.5 Assignment of IR absorption peaks of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)3349 cm-1為羥基中O-H的伸縮振動(dòng)吸收，1082 cm-1為羥基中的C-O伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明化合物中含有羥基結(jié)構(gòu)；

(2)3349 cm-1為羥基中N-H的伸縮振動(dòng)吸收，1237 cm-1為羥基中的C-N伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明化合物中含有氨基結(jié)構(gòu)；

(3)2955 cm-1為甲基的C-H伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明化合物中含有甲基結(jié)構(gòu)；

(4)1655 cm-1為羰基的C=O伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明化合物中含有羰基結(jié)構(gòu)；

(5)1536 cm-1，1517 cm-1，1439 cm-1為苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)吸收，842 cm-1為苯環(huán)=C-H的彎曲振動(dòng)吸收，說(shuō)明化合物中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。

解析結(jié)果表明：該樣品的紅外光譜圖特征與目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本相符合。

2.4.3 核磁共振譜

測(cè)試條件：溶劑CD3OD。內(nèi)標(biāo)：δTMS0。分析序號(hào)見(jiàn)圖6。

(1)1H核磁共振譜(1H-NMR)

本研究對(duì)紐莫康定C0凍干粉樣品進(jìn)行了1H譜和1H-1H相關(guān)譜(gCOSY)測(cè)試。測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。根據(jù)gCOSY譜，結(jié)合gHMQC譜和DEPT譜，可對(duì)紐莫康定C0凍干粉的1H譜進(jìn)行歸屬：

表6 紐莫康定C0凍干粉在CD3OD中的1H-NMR數(shù)據(jù)Tab.6 1H-NMR data in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0

①1H譜顯示有43組氫，由低場(chǎng)到高場(chǎng)氫的積分比例分別為2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，與紐莫康定C0凍干粉的結(jié)構(gòu)相符。比較典型的有化學(xué)位移位于δ7左右的4個(gè)芳香氫信號(hào)，其中δ7.136處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為2；gCOSY譜顯示，該氫與δ6.755氫相關(guān)，歸屬為15/19位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ129.690)相關(guān)，證實(shí)為15/19位氫。

②δ6.755處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為2；gCOSY譜顯示，該氫與δ7.136氫相關(guān)，歸屬為16/18位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ116.219)相關(guān)，證實(shí)為16/18位氫。

③化學(xué)位移位于δ5至δ4左右的有8個(gè)連氧氫信號(hào)，其中δ5.297處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.020氫相關(guān)，歸屬為9位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ75.747)相關(guān)，證實(shí)為9位氫。

④δ4.555處氫為一組多重峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.993氫相關(guān)，歸屬為3位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ68.247)相關(guān)，證實(shí)為3位氫。

⑤δ4.500處氫為一組多重峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ2.187，δ3.791氫相關(guān)，歸屬為33位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ71.359)相關(guān)，證實(shí)為33位氫。

⑥δ4.431處氫為一組單峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ2.058，δ3.491氫相關(guān)，歸屬為28位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ71.024)相關(guān)，證實(shí)為28位氫。

⑦δ4.370處氫為一組多重峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ5.082，δ2.853氫相關(guān)，歸屬為22位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ70.902)相關(guān)，證實(shí)為22位氫。

⑧δ4.273處氫為一組單峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.273，δ4.305氫相關(guān)，歸屬為12位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ76.989)相關(guān)，證實(shí)為12位氫。

⑨δ4.273處氫為一組單峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.273氫相關(guān)，歸屬為13位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ75.806)相關(guān)，證實(shí)為13位氫。

⑩δ4.020處氫為一組多重峰，質(zhì)子數(shù)為1；gCOSY譜顯示，該氫與δ5.297氫相關(guān)，歸屬為8位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與次甲基碳(δ70.551)相關(guān)，證實(shí)為8位氫。

?化學(xué)位移位于δ1左右的有4個(gè)甲基氫信號(hào)，其中δ1.163處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.334氫相關(guān)，歸屬為49位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ20.214)相關(guān)，證實(shí)為49位氫。

?δ0.873處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ4.555氫相關(guān)，歸屬為4位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ19.749)相關(guān)，證實(shí)為4位氫。

?δ0.860處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.070氫相關(guān)，歸屬為48位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ11.610)相關(guān)，證實(shí)為48位氫。

?δ0.849處氫為一組雙重峰，質(zhì)子數(shù)為3；gCOSY譜顯示，該氫與δ1.483氫相關(guān)，歸屬為50位氫；gHMQC譜和DEPT譜顯示，該氫與甲基碳(δ20.748)相關(guān)，證實(shí)為50位氫。

上述數(shù)據(jù)與紐莫康定C0的結(jié)構(gòu)相符。

(2)13C核磁共振譜

本研究對(duì)紐莫康定C0凍干粉樣品的13C-NMR譜、DEPT譜、13C-1H相關(guān)譜(gHMQC)、遠(yuǎn)程13C-1H相關(guān)譜(gHMBC)進(jìn)行了測(cè)試。測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表7，13C-NMR譜圖解析如下：

表7 紐莫康定C0凍干粉在CD3OD中的13C-NMR數(shù)據(jù)(ppm)Tab.7 13C-NMR data (ppm)in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0(ppm)

①13C 譜顯示5 0 組碳峰。結(jié)合DEPT 譜、gHMQC譜及gHMBC譜，可得出碳的類(lèi)型包括：3×CH3CH，1×CH3CH2，15×CH2，3×CH，1 4×C H X，4×C H=，1×C=，1×X C=和8×XC=O，這與紐莫康定C0凍干粉的結(jié)構(gòu)相符。比較典型的有化學(xué)位移位于δ170左右的8個(gè)氨基酸羧基碳信號(hào)，其中δ177.426處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ2.853，δ2.548H23遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為24位的季碳。

②δ175.671處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ2.241H36遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為35位的季碳。

③δ174.596處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.993H2，δ4.610氫31遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為1位的季碳。

④δ174.527處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.993H2，δ4.520氫6遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為5位的季碳。

⑤δ173.360處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.610H31遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為30位的季碳。

⑥δ172.944處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.583H26遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為25位的季碳。

⑦δ172.536處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ4.305H11遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為10位的季碳。

⑧δ169.172處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ5.082H21，δ4.583H26遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為20位的季碳。

⑨化學(xué)位移于δ158至δ116處的6個(gè)碳峰是酪氨酸對(duì)位取代苯上的碳信號(hào)，其中δ158.493處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H15/19，δ6.755H16/18遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為17位的季碳。

⑩δ132.970處季碳峰，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ6.755H16/18遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為14位的季碳。

?δ129.690 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ7.136H15相關(guān)，歸屬為15位的次甲基碳， gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H19遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為15位的次甲基碳。

?δ129.690 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ7.136H19相關(guān)，歸屬為19位的次甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H15遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為19位的次甲基碳。

?δ112.219 處碳峰，在gHMQC 譜中與δ6.755H16相關(guān)，歸屬為16位的甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H18遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為16位的次甲基碳。

?δ112.219處碳峰，在gHMQC譜中與δ6.755氫18相關(guān)，歸屬為18位的甲基碳，gHMBC譜顯示，該碳峰與δ7.136H16遠(yuǎn)程相關(guān)，歸屬為18位的次甲基碳。

?此外，化學(xué)位移于δ76至δ68左右的8個(gè)碳峰均為羥基碳信號(hào)，化學(xué)位移于δ62至δ51左右的8個(gè)碳峰均為與氮相連的碳信號(hào)，化學(xué)位移于δ30至δ20左右的碳峰是脂肪酸鏈上末端甲基和亞甲基的碳信號(hào)。

上述數(shù)據(jù)與紐莫康定C0的結(jié)構(gòu)相符。

2.4.4 紫外吸收光譜(UV)

測(cè)定條件：試劑見(jiàn)表8。

表8 紫外吸收光譜測(cè)定條件Tab.8 Determination conditions of UV absorption spectrum

紐莫康定C0凍干粉樣品的紫外吸收光譜測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。解析如下。

表9 紐莫康定C0凍干粉的UV譜測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.9 UV spectrum measurement data of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)在水溶液中，λmax=218 nm 的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環(huán)K帶躍遷吸收峰。

(2)在0.1mol/L NaOH溶液中，λmax=216 nm 的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環(huán)K帶躍遷吸收峰，λmax=289 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環(huán)B帶躍遷吸收峰。

(3)在甲醇溶液中，λmax=224 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環(huán)K帶躍遷吸收峰，λmax=310 nm的吸收峰為紐莫康定C0凍干粉樣品中取代苯環(huán)B帶躍遷吸收峰。

以上紫外吸收光譜表明：本品中可能含有苯環(huán)等官能團(tuán)。

2.4.5 綜合解析

對(duì)制備所得凍干粉綜合解析如下。

(1)紫外吸收光譜表明，本品含苯基等結(jié)構(gòu)，與紐莫康定C0凍干粉結(jié)構(gòu)相符。

(2)紅外光譜顯示，本樣品中存在甲基、羥基、氨基、羰基、苯環(huán)等結(jié)構(gòu)，該樣品的紅外光譜圖特征與紐莫康定C0凍干粉結(jié)構(gòu)相符。

(3)1H譜顯示有43組氫，由低場(chǎng)到高場(chǎng)氫的積分比例分別為2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，與紐莫康定C0凍干粉的結(jié)構(gòu)相符。

(4)本品的13C譜顯示50組碳峰，這與紐莫康定C0凍干粉的結(jié)構(gòu)相符。

(5)質(zhì)譜測(cè)得本品的加合離子峰[M+H]+，其質(zhì)荷比為m/z1065.6，與紐莫康定C0凍干粉的加合離子峰(分子量為1064.5)一致。

綜上，將該樣品同時(shí)進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示樣品與紐莫康定C0結(jié)構(gòu)相符。本研究制備所得的C0凍干粉即為紐莫康定C0。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外在紐莫康定分離純化的研究中，多集中于紐莫康定B0，對(duì)其同分異構(gòu)體C0的制備鮮有報(bào)道。王欣榮等[13]給出了一種高效分離純化紐莫康定的方法，將紐莫康定A0和C0進(jìn)行了有效分離和去除，但是并沒(méi)有提供能夠提純紐莫康定C0的具體措施。孟慧云等[14]在絲狀真菌SIIA-F1108產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的研究中，能夠得到純度在95%以上的組分，并進(jìn)行了相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定，但是并未制備出色譜純度高于99.00%、且量在克級(jí)水平的樣品。本研究通過(guò)提取工藝富集、高壓液相色譜制備、濃縮、干燥，能夠制備出色譜純度99.19%，1.7395g紐莫康定C0。凍干粉經(jīng)檢測(cè)，峰純度為999.4，熱重為3.05%，在C0含量上提供了有力保證，并且經(jīng)過(guò)了紫外吸收光譜、紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜等4大譜結(jié)構(gòu)分析，確證了其結(jié)構(gòu)，為質(zhì)量研究及下游卡泊芬凈合成雜質(zhì)傳遞研究提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以為紐莫康定其他雜質(zhì)的制備提供思路。另外，本研究制備出的紐莫康定C0色譜純度高，峰純度合格，通過(guò)熱重法檢測(cè)水分含量少，可以作為該雜質(zhì)的對(duì)照品使用。