蛋白聚糖與小鼠牙周炎牙槽骨吸收的相關性

牙周炎作為口腔常見疾病，以牙齒松動，牙槽骨喪失為主要特征。牙槽骨吸收的主要原因為牙周炎時成骨細胞、活化的T 細胞、牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞高表達核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB li-gand，RANKL），RANKL 與破骨細胞前體表面的核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK）相互作用后，激活多個調控破骨細胞發(fā)生的轉錄因子，進而刺激破骨細胞的形成和分化。此外，蛋白酶如組織蛋白酶K（ca-thepsin K，CTSK），基質金屬蛋白酶-9（matrix metal-loprotein-9，MMP-9）以及浸潤型白細胞產(chǎn)生的炎癥介質如白介素-1（interleukin-1，IL-1）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）也可促進破骨細胞生成，加重牙周炎牙槽骨吸收

。

近年研究發(fā)現(xiàn)在炎癥性疾病中，蛋白聚糖也發(fā)揮調控作用

。蛋白聚糖是一類糖鏈與肽鏈以共價鍵結合的生物大分子，廣泛存在于細胞內(nèi)外及細胞表面

。蛋白聚糖中的糖鏈可分為半乳糖胺聚糖和葡萄糖胺聚糖，前者包括硫酸軟骨素、硫酸皮膚素，后者包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角質素以及透明質酸。以核心蛋白為基礎的蛋白聚糖包括聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、飾膠蛋白聚糖、雙鏈蛋白聚糖、纖調蛋白聚糖和凝膠蛋白聚糖。此外，近來發(fā)現(xiàn)牙本質細胞外基質中含有大量新型蛋白聚糖，例如牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）的糖基化形式DMP1-PG

。

牙周組織中含有多種蛋白聚糖，如神經(jīng)膠質抗原-2、血栓調節(jié)蛋白、小亮氨酸蛋白聚糖等，參與細胞增殖、遷移、黏附等多種生物學過程，影響牙周組織的發(fā)育和創(chuàng)傷應答

。研究表明，在炎癥期間，蛋白聚糖對長骨及關節(jié)軟骨有調控作用，如DMP1 的糖基化形式可以促進長骨缺損后的骨重建以及髁突骨關節(jié)炎中軟骨修復。多配體蛋白聚糖4（syndecan4, SDC4）可以促進骨折后長骨愈合

。然而，蛋白聚糖在牙周炎牙槽骨吸收中作用尚未報道，基于此筆者選取與破骨形成以及炎癥發(fā)展密切相關的細胞外蛋白聚集蛋白聚糖（ag-grecan，ACAN）、雙鏈蛋白聚糖（biglycan，BGN）、飾膠蛋白聚糖（decorin，DCN）和多能蛋白聚糖（versi-can，VCAN），通過建立小鼠牙周炎模型，觀察小鼠牙槽骨內(nèi)蛋白聚糖的變化，以及蛋白聚糖與破骨、炎癥之間的相關性，探討蛋白聚糖在牙周炎牙槽骨吸收中的作用。

師：細讀“勘測線路”部分，文中哪一處你最感動，你想對詹天佑說些什么？并把自己的體會用點評形式寫在書上。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗使用SPF 級C57BL/6J 小鼠（實驗動物合格證號：［2021］-DW-034，上海南方模式動物研究中心，中國），所有小鼠飼養(yǎng)于同濟大學附屬口腔醫(yī)院SPF 級動物房（12 h 光照/12 h 無光飼養(yǎng)環(huán)境，室內(nèi)溫度保持25 ℃，相對濕度55%），本實驗經(jīng)同濟大學倫理委員會批準（批準號：TJLAC-017-027）。

1.2 主要試劑和儀器

例1 (2018年四川達州)如圖1，二次函數(shù)y=ax2+bx+c的圖象與x軸交于點A(-1，0)，與y軸的交點B在(0，2)與(0，3)之間(不包括這兩點)，對稱軸為直線x=2．下列結論：①abc<0；②9a+3b+c>0；③若點點是函數(shù)圖象上的兩點，則y1

1.3 實驗方法

相較對照側，牙周炎側頰側牙槽骨吸收增多，吸收形成篩網(wǎng)狀，牙根暴露，牙槽嵴高度降低，釉牙骨質界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x增大（

= 20.09，

＜0.001），骨體積分數(shù)下降（

= 4.295，

= 0.013），骨小梁厚度下降（

= 3.839，

= 0.019），差異具有統(tǒng)計學意義，見圖1。

1.3.1 Micro-CT 分析 Micro-CT 掃描小鼠上頜骨。Mimics 13.0 軟件分析圖像，選取上頜骨第二磨牙頰側牙槽骨面3D 重建。Image 軟件計算上頜第二磨牙釉牙骨質界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。

1.3.3 RT-qPCR 提取小鼠上頜第一磨牙與第二磨牙牙槽骨，放入Trizol 震碎，使用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，RT-qPCR 檢查蛋白聚糖合成相關基因（ACAN、BGN、VCAN、DCN）以及破骨相關基因（CTSK、MMP-9、RANKL）與炎癥相關基因白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白介素-6（inter-leukin-6，IL-6），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis fac-tor α，TNF-α）的變化。以GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列見表1。10 μL 反應體系：2 倍Master mix 5 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，PCR 級水3.5 μL。擴增程序：50 ℃120 s，95 ℃600 s；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，60 個循環(huán)；95 ℃10 s；65 ℃60 s；97 ℃1 s。2

法計算目的基因相對表達量。

1.3.2 組織學染色 14 d 收樣后用4%多聚甲醛灌流固定，4%多聚甲醛4 ℃浸泡上頜骨24 ～ 48 h 后取出，放入10%EDTA 室溫脫鈣2 ～ 4 周，脫鈣液每1 ～ 2 d 更換一次。脫鈣完成之后，脫水浸蠟，包埋，石蠟切片（厚度：4 μm），進行HE 和TRAP 染色。直立顯微鏡下觀察并拍照。

2.融入EOP后原高職公共英語教學生態(tài)失調現(xiàn)象引發(fā)的影響研究。高職公共英語融入EOP后，由于教學內(nèi)容的改變，勢必會引起其教學生態(tài)中的各因子不再平衡，這種失調現(xiàn)象會引發(fā)各種不良影響，分析其不良影響可能帶來的后果，提出消除不良影響的必要性。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0 與GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，兩組間比較采用獨立樣本

檢驗，

＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。通過Pearson 相關系數(shù)分析檢驗相關性，

＜0.05 認為具有相關性。

90°，進而得△FMK∽△DFA，則由于DA=4，AF=2，所以問題轉化為求即的值．而所以得故M點的坐標為至于求點N的坐標又體現(xiàn)了建立平面直角坐標系的優(yōu)越性了，若仿照點E、M的坐標求法，向坐標軸作垂線，坐標相當難求．但注意到點F、D的坐標分別為(2，0)，(0，4)，根據(jù)待定系數(shù)法易求直線EF、DM的解析式分別為y=3x-6和y=-x+4，聯(lián)立解方程組便可輕而易舉地求得點N的坐標為再由兩點之間的距離公式，得問題迎刃而解．

6-0 無菌縫線（上海元象生物公司，中國）；HE染色試劑盒（上海生工生物公司，中國）；TRAP 染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；逆轉錄試劑盒（Taka-ra 公司，日本）；TRIZOL 試劑（Thermo Fish，美國）；QPCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物公司，中國）；PCR 引物（上海生工生物公司，中國）；Micro-CT 系統(tǒng)（μCT50，Scanco Medical 公司，瑞士）；直立顯微鏡（尼康公司，日本）。

2 結 果

2.1 牙周炎模型構建

選取12 只8 周齡雄性小鼠，采用絲線結扎法構建小鼠牙周炎模型

：1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥位固定于手術臺，暴露口腔，選用6-0 無菌縫線建模，繞右側第二磨牙頸部一圈，在頰側打三重結，左側不建模作為對照。術后密切觀察小鼠生存率以及絲線是否滑脫，建模后14 d收樣。

SPWM是調制波與載波在交點時刻產(chǎn)生的控制信號，控制功率器件的通斷，得到一系列等幅不等寬的脈沖序列[6]。調制波在微控制器中是正弦函數(shù)，載波是通用定時器的寄存器加減產(chǎn)生虛擬三角波[7]，SPWM波形的算法采用規(guī)則采樣法[4]，如圖6所示。

2.2 牙周炎牙槽骨吸收活躍，破骨與炎癥相關基因上調

通過對牙周炎牙槽骨組織中的蛋白聚糖合成相關基因ACAN、BGN、VCAN、DCN 及炎癥相關基因IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達水平分別進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)ACAN 與IL-1β（

= 0.094）、IL-6（

= 0.227）、TNF-α（

= 0.137）、BGN 與IL-1β（

=0.129）、IL-6（

= 0.209）、TNF-α（

= 0.540）、VCAN與IL-1β（

= 0.056）、IL-6（

= 0.162）、TNF-α（

= 0.069）的表達均無相關性。而DCN 與IL-1β（

=-0.911，

=0.031）、IL-6（

=-0.1000，

=0.001）、TNF-α（

=-0.901，

= 0.036）的表達具有負相關性，見圖5。

隨著“二孩兒”政策的落地，許多家庭都增加了新的成員，然而問題來了,原本已經(jīng)可以安享晚年的老人，有可能需要再次“上崗”……

2.3 牙周炎牙槽骨組織中的蛋白聚糖含量改變

通過提取上頜骨RNA 檢測多種與蛋白聚糖合成相關基因，發(fā)現(xiàn)相較對照側，牙周炎側ACAN（

= 5.984，

＜0.001）、BGN（

= 5.984，

＜0.001）、DCN（

= 14.73，

＜0.001）表達下調，而VCAN（

=6.233，

＜0.001）的表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖3。

牙周炎側CTSK（

= 4.507，

= 0.011）、MMP-9（

= 6.652，

＜0.001）、RANKL（

= 6.730，

＜0.001）等破骨細胞相關基因表達明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義（圖2c）。牙周炎側炎癥相關基因IL-1β（

= 7.874，

＜0.001）、IL-6（

= 5.996，

=0.04）、TNF-α（

= 4.642，

= 0.002）表達也明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（圖2d），說明牙周炎模型構建成功。

2.4 牙周炎牙槽骨組織中的蛋白聚糖與破骨相關基因的表達具有負相關性

通過對牙周炎牙槽骨組織中的蛋白聚糖合成相關基因ACAN、BGN、VCAN、DCN 及破骨相關基因CTSK、MMP-9、RANKL 的表達水平分別進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)ACAN 與RANKL（

=-0.982，

= 0.003）的表達具有負相關性，與CTSK（

=0.179）、MMP-9（

= 0.677）的表達無相關性。BGN與CTSK（

=-0.100，

=0.017）、MMP-9（

=-0.897，

= 0.039）、RANKL（

= 0.004）的表達均具有負相關性。VCAN 與CTSK（

= 0.173）、MMP-9（

=0.164）、RANKL（

= 0.432）的表達均無相關性。DCN 與MMP-9（

=-0.975，

=0.005)的表達具有負相關性，與CTSK（

=0.085）、RANKL（

=0.106）的表達無相關性，見圖4。

2.5 牙周炎牙槽骨組織中的蛋白聚糖與炎癥相關基因的表達具有負相關性

HE 染色結果顯示，相較對照側，牙周炎側牙齦乳頭形態(tài)破壞、退縮，牙周韌帶排列紊亂，纖維組織腔隙增多。第一磨牙遠中根與第二磨牙近中根之間炎癥細胞浸潤增多，牙槽骨高度下降，吸收增多（圖2a）。通過TRAP 染色，發(fā)現(xiàn)牙周炎側牙槽骨中TRAP 陽性的破骨細胞數(shù)目明顯增加（圖2b）。

3 討 論

牙周炎是一種不可逆的非特異性炎性疾病，起因為牙菌斑入侵牙周組織，其代謝產(chǎn)物刺激機體免疫應答并引起牙周組織破壞

。通過絲線結扎法在7 d 后可引發(fā)急性牙槽骨丟失，是研究牙周炎的重要模型

。在牙周炎中，牙周組織的破壞與大分子蛋白例如細胞外基質蛋白、蛋白聚糖等的表達變化密切相關

。蛋白聚糖作為可以介導炎癥過程的大分子蛋白，參與炎癥介質的濃度梯度形成、白細胞募集和細胞外基質重塑，進而調節(jié)牙周炎的病理進程

。

其中，細胞外基質蛋白聚糖在骨代謝或炎癥發(fā)展中至關重要。研究表明，ACAN 可以激活關節(jié)傷害感受器中的Toll 樣受體-2（Toll-like receptors-2，TLR-2），從而調控骨關節(jié)炎發(fā)展

。BGN 與纖調蛋白聚糖由成骨細胞生成并分泌，以劑量依賴性的方式直接結合TNF-α，抑制其激活RANK，從而抑制破骨細胞形成

。VCAN 間接通過透明質酸或者直接通過CD44，P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectinglycoproteinligand-1，PSGL-1）以及TLR 受體與炎癥因子相互作用，激活炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB

。DCN 通過調節(jié)干擾素影響淋巴細胞進入炎癥組織，從而調控免疫過程中的遲發(fā)性超敏反應，并且DCN 的過表達會抑制小鼠血管的炎癥性病變

。本實驗發(fā)現(xiàn)在小鼠牙周炎牙槽骨中ACAN、BGN、DCN 表達下調，而VCAN 的表達上調，提示上述4 種蛋白聚糖與牙周炎的發(fā)展可能相關。

雖然前期研究發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖可調控炎癥時牙周組織的代謝，但其在牙周炎牙槽骨吸收中的作用尚不明確?；罨腡 細胞表達的MMP-9、RANKL 以及破骨細胞表達的CTSK 促進骨吸收。筆者發(fā)現(xiàn)牙周炎中ACAN 與RANKL 的表達具有負相關性，BGN 與CTSK、MMP-9、RANKL 的表達具有負相關性，DCN 與MMP-9 的表達具有負相關性，提示牙周炎中蛋白聚糖ACAN、BGN 與DCN 與牙周炎牙槽骨吸收可能相關，以及BGN 對CTSK、MMP-9、RANKL 可能潛在的負調控作用。

IL-1 和IL-6 促進多型核白細胞和單核細胞/巨噬細胞黏附內(nèi)皮細胞，刺激前列腺素E2 的產(chǎn)生和溶酶體酶的釋放，進而促進牙周組織破壞

。TNF-α 通過上調可以降解基底膜的金屬蛋白酶，加速牙周炎進展或者通過激活RANK，參與骨代謝和破骨細胞分化

。此外，研究表明炎癥因子白介素會下調DCN 在成纖維細胞中的表達

。本實驗結果顯示，DCN 與IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達具有負相關性，提示牙周炎中DCN 的表達與牙槽骨吸收及牙周組織破壞有相關性，以及IL-1β、IL-6、TNF-α對DCN 可能潛在的負調控作用。

綜上，本實驗結果表明蛋白聚糖在小鼠牙周炎牙槽骨內(nèi)的表達量改變，并且與破骨相關因子、炎癥相關因子的表達量具有負相關性。為從蛋白聚糖的角度了解牙周炎的致病機制提供實驗基礎，以及對控制牙周炎牙槽骨吸收的臨床問題給予新思路。然而本實驗對蛋白聚糖ACAN，DCN 的下降與牙周炎牙槽骨吸收的作用機制尚無具體論證，以及蛋白聚糖ACAN、BGN、ACAN 和DCN 在牙周炎側牙槽骨吸收，牙周組織破壞中的作用機制和關鍵信號通路還需進一步探究。

Wang SY performed the experiment and wrote the article. Zhang F peformed the experiment and revised the arti-cle. Wang XK and Sun Y designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

[1] Tsukasaki M. RANKL and osteoimmunology in periodontitis[J]. J Bone Miner Metab,2021,39(1):82-90.doi:10.1007/s00774-020-01165-3.

[2] Schaefer L, Tredup C, Gubbiotti MA, et al. Proteoglycan neofunc-tions: regulation of inflammation and autophagy in cancer biology[J].FEBS J,2017,284(1):10-26.doi:10.1111/febs.13963.

[3] Schwartz NB, Domowicz MS. Proteoglycans in brain development and pathogenesis[J]. FEBS Lett, 2018, 592(23): 3791-3805. doi:10.1002/1873-3468.13026.

[4] Iozzo RV, Schaefer L. Proteoglycan form and function: a compre-hensive nomenclature of proteoglycans[J]. Matrix Biol, 2015, 42:11-55.doi:10.1016/j.matbio.2015.02.003.

[5] Chen Y,Guan Q,Han X,et al.Proteoglycans in the periodontium:a review with emphasis on specific distributions,functions,and po-tential applications[J]. J Periodontal Res, 2021, 56(4): 617-632.doi:10.1111/jre.12847.

[6] Bertrand J, Stange R, Hidding H, et al. Syndecan 4 supports bone fracture repair, but not fetal skeletal development, in mice[J]. Ar-thritis Rheum,2013,65(3):743-752.doi:10.1002/art.37817.

[7] Weng Y, Liu Y, Du H, et al. Glycosylation of DMP1 is essential for chondrogenesis of condylar cartilage[J]. J Dent Res, 2017, 96(13):1535-1545.doi:10.1177/0022034517717485.

[8] Xue H, Niu P, Liu Y, et al. Glycosylation of DMP1 promotes bone reconstruction in long bone defects[J].Biochem Biophys Res Com-mun,2020,526(4):1125-1130.doi:10.1016/j.bbrc.2020.04.020.

[9] Li J, Jin F, Cai M, et al. LncRNA nron inhibits bone resorption in periodontitis[J].J Dent Res,2021.doi:10.1177/00220345211019689.

[10] Hajishengallis G. Periodontitis: from microbial immune subver-sion to systemic inflammation[J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(1):30-44.doi:10.1038/nri3785.

[11] Lin P, Niimi H, Ohsugi Y, et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of peri-odontal disease[J].Int J Mol Sci,2021,22(16):8900.doi:10.3390/ijms22168900.

[12] Zhang Z, Yang X, Zhang H, et al. The role of extracellular matrix metalloproteinase inducer glycosylation in regulating matrix metal-loproteinases in periodontitis[J]. J Periodontal Res, 2018, 53(3):391-402.doi:10.1111/jre.12524.

[13] Gopal S. Syndecans in inflammation at a glance[J]. Front Immu-nol,2020,11:227.doi:10.3389/fimmu.2020.00227.

[14] Miller RE,Ishihara S,Tran PB,et al.An aggrecan fragment drives osteoarthritis pain through Toll-like receptor 2[J]. JCI Insight,2018,3(6):e95704.doi:10.1172/jci.insight.95704.

[15] Kram V, Kilts TM, Bhattacharyya N, et al. Small leucine rich pro-teoglycans, a novel link to osteoclastogenesis[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):12627.doi:10.1038/s41598-017-12651-6.

[16] Wight TN,Kang I,Evanko SP,et al.Versican-a critical extracellu-lar matrix regulator of immunity and inflammation[J].Front Immu-nol,2020,11:512.doi:10.3389/fimmu.2020.00512.

[17] Neill T,Sharpe C,Owens RT,et al.Decorin-evoked paternally ex-pressed gene 3 (PEG3) is an upstream regulator of the transcrip-tion factor EB (TFEB) in endothelial cell autophagy[J]. J Biol Chem, 2017, 292(39): 16211 - 16220. doi: 10.1074/jbc.M116.769950.

[18] Oh E, Choi IK, Hong J, et al. Oncolytic adenovirus coexpressing interleukin-12 and decorin overcomes Treg-mediated immunosup-pression inducing potent antitumor effects in a weakly immunogen-ic tumor model[J]. Oncotarget, 2017, 8(3): 4730 - 4746. doi:10.18632/oncotarget.13972.

[19] Binderman I,Gadban N,Yaffe A.Extracellular ATP is a key mod-ulator of alveolar bone loss in periodontitis[J]. Arch Oral Biol,2017,81:131-135.doi:10.1016/j.archoralbio.2017.05.002.

[20] Plemmenos G,Evangeliou E,Polizogopoulos N,et al.Central regu-latory role of cytokines in periodontitis and targeting options[J].Curr Med Chem, 2021, 28(15): 3032 - 3058. doi: 10.2174/0929867327666200824112732.

[21] Hashimoto-Uoshima M, Noguchi K, Suzuki M, et al. Effects of in-terleukin-4 on proteoglycan accumulation in human gingival fibro-blasts[J]. J Periodontal Res, 2002, 37(1): 42-49. doi: 10.1034/j.1600-0765.2002.00642.x.