朱正亞，劉少喻

中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518107

韌帶和肌腱異位骨化（heterotopic ossification of the tendon and ligament，HOTL）是指韌帶或肌腱中形成異位骨，大多被認(rèn)為是纖維結(jié)締組織損傷再修復(fù)失敗的結(jié)果。HOTL 的病因尚不明確，遺傳、損傷刺激、異常機(jī)械應(yīng)激、年齡、基礎(chǔ)代謝疾病等是其危險(xiǎn)因素[1,2]。異常機(jī)械刺激如何加速HOTL 進(jìn)程不十分明確。一定負(fù)荷和頻率的反復(fù)運(yùn)動(dòng)能夠改變韌帶成纖維細(xì)胞生存微環(huán)境并誘導(dǎo)干/祖細(xì)胞向成軟骨/成骨方向分化，可能是韌帶異位骨化形成的重要因素之一[3,4]。HOTL 是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病理過程，包括損傷、炎癥反應(yīng)、干/祖細(xì)胞募集、干/祖細(xì)胞向軟骨、骨細(xì)胞分化，最后導(dǎo)致異位骨化形成。本文從人體解剖結(jié)構(gòu)、動(dòng)物模型及細(xì)胞反應(yīng)3 個(gè)層面綜述異常力學(xué)刺激引發(fā)HOTL 的病理機(jī)制，以期為更好地理解HOTL 的形成和進(jìn)一步研究厘清思路。

1 HOTL 形成的人體解剖基礎(chǔ)與病理機(jī)制

1.1 脊柱韌帶骨化及病理機(jī)制

脊柱韌帶骨化（ossification of the spinal ligament，OSL）多發(fā)生于后縱韌帶和黃韌帶。研究認(rèn)為，脊柱韌帶骨化分布特點(diǎn)與脊柱不同節(jié)段應(yīng)力變化有關(guān)[5]。OSL 多發(fā)生于應(yīng)力集中部位，后縱韌帶骨化（ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL）主要發(fā)生于頸椎（C5節(jié)段），其次是中、上胸椎；而黃韌帶骨化（ossification of the ligament flavum，OLF）則以下胸椎為主，頸椎或腰椎OLF 相對(duì)較少。解剖學(xué)上的不同導(dǎo)致韌帶活動(dòng)范圍、使用頻率有較大差異[6]。

一項(xiàng)OPLL 術(shù)后長(zhǎng)期臨床隨訪研究表明，頸椎穩(wěn)定性不佳致使椎間活動(dòng)異常，后縱韌帶局部應(yīng)力增加，從而促使混合型OPLL 向連續(xù)型發(fā)展[7]。影像學(xué)檢查顯示，OPLL 患者接受頸椎單開門手術(shù)后，由于后柱不穩(wěn)導(dǎo)致骨化韌帶肥厚，而椎板成形術(shù)聯(lián)合內(nèi)固定融合術(shù)對(duì)于脊柱穩(wěn)定性影響相對(duì)較小，能夠延緩OPLL 的進(jìn)展[8,9]。因此行脊柱手術(shù)治療時(shí)，生物力學(xué)因素應(yīng)當(dāng)被納入考慮范圍。一項(xiàng)針對(duì)頸椎OPLL 患者椎間盤應(yīng)力分布的生物力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OPLL 進(jìn)展速率與對(duì)應(yīng)節(jié)段椎間盤異常應(yīng)力強(qiáng)度呈正相關(guān)，提示椎體節(jié)段間應(yīng)力分布不均可加速OPLL 的自然病程[10,11]。盡管頸椎后縱韌帶和前縱韌帶相互協(xié)調(diào)、共同維持頸椎穩(wěn)定性，但頸部OPLL 的病例報(bào)道明顯多于前縱韌帶骨化（ossification of anterior longitudinal ligament，OALL）。日常生活中，頸椎PLL處于拉伸應(yīng)力狀態(tài)（頸部過曲）的時(shí)間明顯多于ALL。且二者解剖學(xué)存在一定差異，后縱韌帶沿椎體一直延續(xù)至骶骨，在頭頸交界處最粗、最寬，腰椎變細(xì)變窄。而前縱韌帶在頸椎較細(xì)，后續(xù)延伸逐漸變粗、變寬，這些解剖學(xué)差異導(dǎo)致頸椎OALL和OPLL發(fā)生率的不同[12]。

胸椎、腰椎部位OPLL 發(fā)生率明顯低于頸椎，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因是頸椎活動(dòng)度相對(duì)較大，而胸椎有胸廓保護(hù)限制了其在屈伸、側(cè)屈及旋轉(zhuǎn)等方向的活動(dòng)。胸椎OLF 導(dǎo)致胸椎椎管狹窄具有明顯的節(jié)段分布特點(diǎn)，絕大多數(shù)發(fā)生于下胸椎[13]。研究表明，OLF 的發(fā)生部位與下胸椎黃韌帶的應(yīng)力分布密切相關(guān)。下胸椎由于缺乏胸廓的有效支撐且位于胸椎生理性后彎及腰椎前彎的移行區(qū)域，此階段韌帶活動(dòng)度相對(duì)較大，容易在后柱形成應(yīng)力集中區(qū)，導(dǎo)致OLF 的發(fā)生[5,14,15]。有學(xué)者認(rèn)為OLF 的進(jìn)展速率和發(fā)生部位與胸椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的方向以及旋轉(zhuǎn)應(yīng)力有關(guān)。由于胸椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)呈近似矢狀位排列，且在下胸椎無肋骨限制其活動(dòng)，在T11、T12區(qū)域黃韌帶承受更大的旋轉(zhuǎn)應(yīng)力刺激，因而更容易發(fā)生骨化[16]。

1.2 牙周韌帶骨化及病理機(jī)制

施加在牙上的正畸力會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的機(jī)械加載模式，包括壓縮、拉伸和剪切應(yīng)力，進(jìn)而在牙周組織中引起復(fù)雜的生物反應(yīng)[17]。牙齒-牙周韌帶-牙槽骨復(fù)合體共同作用，用于對(duì)抗消除咀嚼或正畸牙移動(dòng)過程中產(chǎn)生的機(jī)械載荷。牙周韌帶（periodontal ligament，PDL）是一種纖維關(guān)節(jié)，可通過調(diào)節(jié)骨組織形成與重塑來響應(yīng)機(jī)械應(yīng)變。PDL 應(yīng)力側(cè)與張力側(cè)不均時(shí)，局部韌帶組織出現(xiàn)血管化表現(xiàn)，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)機(jī)械應(yīng)力表現(xiàn)出適應(yīng)性重組反應(yīng)。當(dāng)PDL 持續(xù)性受壓時(shí)，局部血流紊亂，細(xì)胞凋亡，隨后玻璃化組織被移除，臨床表現(xiàn)為牙槽骨骨質(zhì)破壞。而當(dāng)PDL 持續(xù)拉伸時(shí)，細(xì)胞有絲分裂速率加快、局部纖維出現(xiàn)軟骨化生，隨后出現(xiàn)異位骨化[18]。總之，在牙周組織的局部微環(huán)境中，PDL 的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生變化，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的構(gòu)型改變及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，通過成骨與破骨之間的協(xié)同作用，最終導(dǎo)致異位骨化形成[17,19]。

1.3 肌腱異位骨化及病理機(jī)制

肌腱與韌帶在解剖學(xué)與生理功能稍有區(qū)別，韌帶多是骨與骨之間的連接，主要維持身體的靜態(tài)穩(wěn)定性，而肌腱連接骨與肌組織，是骨骼肌帶動(dòng)骨運(yùn)動(dòng)的橋梁，需傳導(dǎo)更強(qiáng)的機(jī)械力。

部分學(xué)者認(rèn)為，高頻率、超負(fù)荷的力學(xué)機(jī)械刺激是引起肌腱發(fā)生局部損傷的始動(dòng)因素，組織損傷后，損傷部位募集大量炎性因子，引發(fā)后續(xù)損傷、修復(fù)、成骨一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20,21]。因此肌腱異位骨化部位往往發(fā)生于反復(fù)摩擦、活動(dòng)范圍較大的部位，如肩袖肌腱群、跟腱、屈肌腱等[1,20,22]。組織學(xué)上，反復(fù)機(jī)械刺激的肌腱呈現(xiàn)出損傷后難以自愈的狀態(tài)，其特征為成纖維細(xì)胞受損、細(xì)胞增生、大量蛋白多糖沉積和膠原基質(zhì)降解，修復(fù)部位出現(xiàn)纖維軟骨化生[23]。

2 力學(xué)誘導(dǎo)韌帶異位骨化的動(dòng)物模型

動(dòng)物模型是研究疾病在體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的合理化替代物，由于機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)于細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)需要較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)才可以觀察到病理表型變化，因此目前建立的單純力學(xué)加載誘導(dǎo)HOTL 的動(dòng)物模型較少。

Tsukamoto 等[24]設(shè)計(jì)一種循環(huán)拉伸大鼠尾部脊椎韌帶的裝置，選取14～16 周齡Wistar 大鼠，將大鼠骨盆綁在移動(dòng)床邊緣，用鋼釘插入第8 尾椎將其固定在遠(yuǎn)端固定器上。大鼠體部在移動(dòng)床的牽引下以1 Hz 頻率前后運(yùn)動(dòng)，每次牽引運(yùn)動(dòng)可以將兩倍于大鼠體重的拉伸力集中于鼠尾前部節(jié)段（2～5 尾椎）。影像學(xué)結(jié)果顯示，應(yīng)力集中區(qū)的脊柱韌帶發(fā)生HO，組織學(xué)染色表明拉伸部位有大量成熟軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，拉伸時(shí)間越長(zhǎng)，這些病理改變?cè)矫黠@。

Petri 等[25]構(gòu)建一種體內(nèi)肌腱拉伸動(dòng)物模型用于評(píng)估成骨分化傾向，將綿羊股四頭肌肌腱取出后兩端固定于小型固定艙內(nèi)，機(jī)械刺激組的肌腱兩端分別與股四頭肌和髕骨上端縫合，非機(jī)械刺激組僅與股四頭肌端縫合。股四頭肌端固定艙內(nèi)有預(yù)先留置的髂骨松質(zhì)骨與股四頭肌腱連接，當(dāng)股四頭肌發(fā)生收縮時(shí)，機(jī)械刺激組肌腱會(huì)受到縱向牽引力。術(shù)后6 周肌腱Safranin O/von Kossa 染色結(jié)果表明，機(jī)械刺激組成骨范圍更廣并且礦化基質(zhì)沉積更多。

以上動(dòng)物研究能夠較真實(shí)地反映外界刺激對(duì)于生物體的整體影響，但直接將力學(xué)刺激加載于動(dòng)物肢體來建立HOTL模型具有耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜和失敗率高等缺點(diǎn)。因此，更加合理的動(dòng)物模型有待設(shè)計(jì)。

3 機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞成骨分化的調(diào)控

3.1 拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨分化

韌帶組織主要由成纖維細(xì)胞構(gòu)成，目前已有多項(xiàng)關(guān)于韌帶成纖維細(xì)胞的成骨特性的研究，包括拉伸、壓縮、流體剪切力、機(jī)械振動(dòng)等多種應(yīng)力方式對(duì)細(xì)胞成骨分化的作用，但具體機(jī)制仍不完全清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）和連接蛋白43（Cx43）是力學(xué)刺激引起成纖維細(xì)胞成骨分化的研究熱點(diǎn)。ERS 在骨骼發(fā)育和成骨細(xì)胞增殖分化過程中起著重要作用[26,27]。多項(xiàng)報(bào)道表明，力學(xué)刺激誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成骨方向分化可能與ERS 有關(guān)[28,29]，當(dāng)拉伸應(yīng)力或流體剪切力作用于成纖維細(xì)胞時(shí)，ERS 的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）得到活化，MAPK／PERK 通路被異常激活，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞向成骨方向分化[27,30]。Yang 等[31]研究發(fā)現(xiàn)牙周韌帶細(xì)胞的反復(fù)壓縮應(yīng)力可以上調(diào)PERKeIF2α-ATF4 途徑介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在牙周膜骨化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。此外，當(dāng)OPLL 患者后縱韌帶成纖維細(xì)胞接受拉伸刺激時(shí)，Cx43 相關(guān)的NF-κβ炎癥信號(hào)通路被激活[32]，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，用Cx43 siRNA 或NF-κβ抑制劑可顯著對(duì)抗拉伸應(yīng)力刺激誘發(fā)的成骨分化作用[33,34]。

基于上述結(jié)果，Cx43 與ERS 共同響應(yīng)拉伸應(yīng)力引起HOTL 的交互作用機(jī)制被進(jìn)一步研究，Cx43 部分地通過激活MAPK／PERK 信號(hào)通路來促進(jìn)韌帶成纖維細(xì)胞的成骨分化，對(duì)Cx43 表達(dá)的操控可相應(yīng)改變ERS[30]。因此，通過敲除Cx43影響MAPK／PERK 通路，可能是逆轉(zhuǎn)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化的有效方法之一。

3.2 拉伸、壓縮應(yīng)力刺激誘導(dǎo)MSCs 成骨分化

軟骨內(nèi)異位骨化過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）錯(cuò)誤分化是十分關(guān)鍵一步，多條信號(hào)通路參與了干細(xì)胞的成骨分化[1,4]。當(dāng)韌帶發(fā)生損傷或過度拉伸應(yīng)力刺激時(shí)，駐留的或招募的MSCs 向損傷部位趨附，發(fā)生一系列復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起軟骨內(nèi)成骨。目前已檢測(cè)到HOTL 有多種干細(xì)胞來源，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞等[35～37]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在沒有任何成骨誘導(dǎo)因子作用下，單獨(dú)對(duì)MSCs 施加拉伸或壓縮刺激足以誘導(dǎo)其向軟骨/骨方向分 化[38～40]。Huang 等[41]將MSCs 種植于3D 水凝膠支架中，對(duì)支架施加正弦性拉伸-壓縮循環(huán)刺激，MSCs 接受間接力學(xué)刺激，RNA 測(cè)序表明TGF-β1 基因過表達(dá)。纖維蛋白水凝膠支架能夠誘導(dǎo)負(fù)載的干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞方向分化，在該支架上加入適量的外源性TGF-β3，MSCs 會(huì)沿著肌源性途徑分化[42,43]。而當(dāng)拉伸力-壓縮力正弦性循環(huán)作用于纖維蛋白水凝膠后，MSCs 接收間接傳導(dǎo)的力學(xué)刺激并表現(xiàn)出對(duì)外源性TGF-β3 的高響應(yīng)，MSCs 呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的成骨方向分化[44]。因此循環(huán)拉伸-壓縮刺激誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化可能與TGF-β通路有關(guān)[41]。

3.3 力學(xué)機(jī)械刺激加速基因缺陷突變細(xì)胞成骨分化

TTW（tiptoe walking）小鼠異位骨化模型是一種自然發(fā)生的突變體，其病理表型與人類OPLL 非常相似[45]。據(jù)報(bào)道，TTW 小鼠異位骨化表型是由編碼核苷酸焦磷酸酶（ENPP1）基因無義突變引起（甘氨酸568 終止）。ENPP1 作為一種胞外酶，在調(diào)節(jié)磷酸鹽（Pi）和焦磷酸鹽（PPi）平衡具有重要作用。PPi 是一種強(qiáng)骨化抑制劑，能夠有效抑制異位骨形成，當(dāng)Pi 與PPi 代謝異常時(shí)，小鼠會(huì)表現(xiàn)出全身多處軟骨內(nèi)骨化，包括OPLL 形成。Nakajima 團(tuán)隊(duì)[45]以TTW 小鼠為研究對(duì)象，將其后縱韌帶細(xì)胞種植于Flexcell 細(xì)胞拉伸儀，以特定參數(shù)對(duì)細(xì)胞施加拉伸應(yīng)力和靜息休息交替作用，結(jié)果表明OPLL 細(xì)胞接受循環(huán)拉伸應(yīng)變后RSPO2、HAO1 和CCDC91 等OPLL 易感基因上調(diào)，而同樣的力學(xué)刺激作用于正常后縱韌帶細(xì)胞并未引起上述基因改變。

進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良（fibrodysplasia ossificans progressiva，F(xiàn)OP）是一種罕見的韌帶軟骨內(nèi)異位骨化性疾病，該疾病由骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）1型受體Acvr1 基因突變引起，導(dǎo)致BMP 傳導(dǎo)通路過度激活，最終引起全身多處纖維結(jié)締組織異位骨形成，F(xiàn)OP 患者或動(dòng)物模型即便遭受輕微的皮膚、韌帶損傷即會(huì)呈現(xiàn)出較為強(qiáng)烈的成骨分化傾向[46]。流行病學(xué)顯示，幾乎所有典型的FOP 病例發(fā)生了Acvr1 功能獲得性突變（R206H；c.617G＞A）。Stanley團(tuán)隊(duì)[47,48]將Acvr1R206H/+細(xì)胞種植于水凝膠材料，對(duì)細(xì)胞間接施加壓縮應(yīng)變。機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)至Acvr1R206H/+細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)因子RhoA/ROCK 和YAP1 活性增加，Acvr1R206H/+細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)BMP 成骨信號(hào)高響應(yīng)，與靜息Acvr1R206H/+細(xì)胞相比，接受間接力學(xué)刺激的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨分化能力。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，越來越多基因編輯動(dòng)物模型被應(yīng)用。既往研究表明，適當(dāng)?shù)耐饨缌W(xué)刺激可以增加Mkx（+/+）大鼠腱細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生，促進(jìn)MSC 向腱細(xì)胞分化。而Suzuki 等[49]應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)將大鼠Mkx 基因敲除，獲取Mkx（?/?）基因缺陷大鼠腱細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在接受同樣力學(xué)刺激的Mkx（?/?）大鼠腱細(xì)胞中軟骨形成標(biāo)記物高表達(dá)，Micro-CT 證實(shí)機(jī)械刺激的Mkx（?/?）大鼠早期即出現(xiàn)跟腱HO，這一機(jī)械信號(hào)促骨化作用可能與Hedgehog 信號(hào)異常響應(yīng)有關(guān)[50]。

4 總結(jié)

HOTL 作為一種常見致殘性疾病備受臨床醫(yī)師的關(guān)注，目前普遍認(rèn)為，局部力學(xué)刺激引起HOTL 是軟骨內(nèi)成骨過程。該病理過程包括局部炎性因子募集、干/祖細(xì)胞向軟骨/骨分化等（圖1）。力學(xué)刺激在HOTL 形成過程中的機(jī)制被廣泛研究，但許多問題鮮有報(bào)道，如：不同類型機(jī)械應(yīng)力引起HOTL 的病理機(jī)制是否相同？機(jī)械應(yīng)力是通過何種途徑傳遞至韌帶細(xì)胞和腱細(xì)胞內(nèi)引起基因改變？總之，HOTL 是一個(gè)多因素調(diào)控、多種細(xì)胞參與的復(fù)雜的病理過程，很難通過單一理論去解釋，需探尋出各病因之間的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)而設(shè)計(jì)合理的治療策略。

圖1 機(jī)械刺激誘導(dǎo)肌腱、韌帶異位骨化形成示意圖（軟骨內(nèi)成骨模式圖）當(dāng)力學(xué)刺激／損傷因素加載至肌腱、韌帶組織時(shí)，局部引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)大量駐留多能干細(xì)胞（祖細(xì)胞）和募集的多能干細(xì)胞（祖細(xì)胞）集中到應(yīng)力集中區(qū)。在力學(xué)刺激下多能干細(xì)胞（祖細(xì)胞）表現(xiàn)出向軟骨的錯(cuò)誤分化，最終形成軟骨內(nèi)異位骨化