煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

何明川，王志江，謝永輝，詹莜國，柯昌磊，李微杰，張 忠，吳國星*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051；3. 山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271016）

煙草黑脛病是煙草種植業(yè)危害最嚴(yán)重的毀滅性土傳病害[1,2]，多發(fā)生于煙草成株期，主要危害煙株的根莖部，由病原菌煙草寄生疫霉Phytophthora parasiticavar. nicotianae侵染煙株的根莖基部，以根莖部發(fā)病為主，向煙株的莖髓部蔓延擴(kuò)展，病株的莖節(jié)變黑且壞死，煙葉自下而上的依次變黃潰爛，煙株染病嚴(yán)重時整株枯死[3,4]。煙草黑脛病易傳染，難控制，病害一旦出現(xiàn)，迅速大面積擴(kuò)展，給煙草種植帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前在煙草種植上對于黑脛病的防治，主要依賴化學(xué)藥劑甲霜靈、代森錳鋅等殺菌劑，但由于長期且不規(guī)范使用化學(xué)農(nóng)藥，造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原菌的抗藥性不斷增強及對非靶標(biāo)生物的毒害作用等問題[6,7]。因此，利用環(huán)境友好型高效生防菌劑進(jìn)行生物防治，對煙葉的綠色生產(chǎn)具有重大意義。

目前，已報道防治黑脛病的生防菌主要是從煙株根際得到的真菌、細(xì)菌，根際細(xì)菌主要是芽胞桿菌屬，其主要通過競爭、抑制以及寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式來抑制病原菌[8,9]。馬冠華等[10]從健康煙株篩選得到內(nèi)生菌Itb57，其在溫室內(nèi)對黑脛病防治效果為69.28%，田間防治效果為72.49%。王進(jìn)等[11]篩選得到枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis21b對煙草黑脛病菌絲生長的抑制率達(dá)78.33%。有關(guān)防治煙草黑脛病的生防菌多來源于植株與根際土壤，從昆蟲腸道分離的生防菌相對較少[12]。而昆蟲尤其是食腐昆蟲腸道存在著豐富的微生物多樣性[13]。因此，這類昆蟲是潛在的拮抗菌庫，具有較廣的應(yīng)用前景。

為發(fā)掘可用于防治煙草黑脛病的生防菌，本研究以食腐昆蟲美洲大蠊腸道為樣本，從中分離純化得到對煙草黑脛病具有較好拮抗作用的菌株，利用16S rRNA基因序列分析及生理生化特征、形態(tài)特征確定其種類，同時明確了其最優(yōu)發(fā)酵條件及室內(nèi)防效。研究結(jié)果可為特基拉芽胞桿菌 D5-8生防菌劑的開發(fā)及其對煙草黑脛病的防治應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 拮抗菌株編號為 D5-8，煙草黑脛病病原菌煙草寄生疫霉Phytophthora parasiticavar.nicotiana現(xiàn)保存于本實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨酵母培養(yǎng)基LB：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基CM：葡萄糖5 g，(NH4)2SO42 g，檸檬酸鈉1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO44 g，KH2PO46 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基NYBD：牛肉浸膏8 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌30 min。蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基YSP：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌30 min。燕麥培養(yǎng)基OA：燕麥30 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉、NaCl等分析純試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（metalaxyl mancozeb），江蘇寶靈化工股份有限公司；Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit，杭州博日科技有限公司。PCR儀，Biometra公司；微生物培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司[12]。

1.2 拮抗菌的鑒定

1.2.1 拮抗菌的分離 美洲大蠊成蟲體表以75%酒精漂洗3次，每次2 min，用無菌水漂洗3次后解剖，獲得完整的美洲大蠊消化道。將美洲大蠊消化道放入滅菌離心管中，加入1 mL無菌水，用研磨棒充分研磨后進(jìn)行梯度稀釋。取10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的菌懸液100 μL分別涂布于NA平板上，再將其倒置，于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，每個梯度做3次重復(fù)。在無菌條件下用滅菌接種環(huán)將NA培養(yǎng)基上長出的單菌落挑取于LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)；純化3～4次可得純化后的單菌落，將純化好的菌株使用50%甘油保存于-80 ℃冰箱[14-17]。

1.2.2 拮抗菌抑菌效果測定 采用平板對峙法[18]篩選對煙草寄生疫霉具有抑制作用的細(xì)菌菌株。使用無菌6 mm打孔器在已活化的煙草寄生疫霉平板上進(jìn)行打孔，再用無菌鑷子將菌餅接入新的OA培養(yǎng)基中央，在距菌餅2 cm十字線對稱處用滅菌牙簽接種待測細(xì)菌，每組重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察并記錄抑菌圈的大小，并計算抑菌率，抑菌率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100，其中處理菌落直徑為對稱拮抗菌的兩點間距離減去兩點拮抗菌的抑菌圈半徑。

1.2.3 菌落菌體特征觀察及生理生化特征 在LB培養(yǎng)基上接種純化后的單菌落，28 ℃培養(yǎng)3 d，待長出單菌落觀察其形態(tài)。根據(jù)《微生物學(xué)實驗》[19]對菌株的生理生化特性進(jìn)行測定。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。反應(yīng)總體系為50 μL，擴(kuò)增條件為：94.8 ℃預(yù)變性2.5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；72 ℃補充延伸2 min。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，送昆明擎科生物公司測序。測序結(jié)果在 NCBI上進(jìn)行Blast比對，并選擇同源性較高的序列用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[2]。

1.3 拮抗菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 種子液的制備 挑取菌株D5-8單菌落于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h[12]。

1.3.2 最適培養(yǎng)基的篩選 分別接種100 μL 菌株D5-8種子液于100 mL的YSP、NYBD、NA、LB和CM液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，采用分光光度法[20]和平板對峙法[18]測定不同培養(yǎng)基中菌株OD600值和抑制率，每組設(shè)3個重復(fù)，下同。

1.3.3 最適碳源的篩選 以上述篩選出來的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉作為碳源，其他組分不變，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，測定菌株的OD600值和抑制率，篩選出最適的碳源[12]。

1.3.4 最適氮源的篩選 以上述篩選出來的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入氯化銨、酵母、硝酸銨、甘氨酸、蛋白胨作為氮源，其他組分不變，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后測定菌株OD600值和抑制率，篩選出最適的氮源[12]。

1.3.5 最適pH值的篩選 以上述篩選出來的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH分別為4、5、6、7、8、9和10，將100 μL菌株D5-8種子液分別接入不同pH培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后測定菌株OD600值和抑制率，篩選出最適的pH[21]。

1.3.6 最適溫度的篩選 以上述篩選出來的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種100 μL菌株D5-8種子液，設(shè)不同溫度20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，測定各溫度下的OD600值和抑制率，篩選出最適生長溫度[21]。

1.3.7 最適轉(zhuǎn)速篩選 采用上述篩選出來的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分別設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為120、150、180、210和240 r/min，測定不同轉(zhuǎn)速下菌株的OD600值和抑制率[21]。

1.3.8 最適光照時間篩選 采用上述篩選出來的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，設(shè)定光照時間分別為 0、4、8、12、16、20和24 h，測定不同光照下菌株的OD600值和抑制率[20]。

1.3.9 最適裝液量的篩選 采用上述篩選出來的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在250 mL的三角瓶中分別配置最適發(fā)酵培養(yǎng)基30、60、90、120和150 mL，在分別接種100 μL菌株D5-8種子液，在180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，測定不同裝液量下菌株的OD600值和抑制率，確定最佳的裝液量[21]。

1.3.10 最適初始接菌量優(yōu)化 采用上述篩選出來的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分別接種含量為 2%、4%、6%、8%和10%的種子液，測定在不同接菌量條件下菌株OD600值和抑制率，確定最佳接菌量[21]。

1.3.11 最適發(fā)酵時間的優(yōu)化 采用上述篩選出來的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分別發(fā)酵培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96和108 h，測定不同發(fā)酵時間下菌株的OD600值和抑制率，確定最佳發(fā)酵時間[21]。

1.3.12 發(fā)酵條件正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對菌株菌體生長量影響較大的因素（發(fā)酵時間、溫度、轉(zhuǎn)速）進(jìn)行正交試驗（表2），從而確定最佳發(fā)酵條件。

1.4 煙草黑脛病室內(nèi)防效測定

采用拮抗菌菌液灌根處理煙苗測定其防效，刮取培養(yǎng)21 d煙草寄生疫霉菌絲，加入0.1% KNO3溶液浸泡，加無菌水?dāng)囁椋? ℃放置30 min，取出配置孢子濃度為1×104cfu/mL，并加入1%葡萄糖后備用；將原始發(fā)酵液與優(yōu)化發(fā)酵液培養(yǎng)48 h，稀釋調(diào)節(jié)濃度為1×108cfu/mL。保護(hù)試驗：試驗設(shè)4個處理，分別為菌株D5-8原始發(fā)酵菌液、D5-8優(yōu)化發(fā)酵菌液、陽性對照58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑500倍液和無菌水（CK），用量10 mL，分別在各處里的每株6葉期煙苗根際周圍施用，2 d后接濃度為1×104cfu/mL的煙草疫霉游動孢子懸浮液10 mL；治療試驗：先每株接濃度為1×104cfu/mL的煙草疫霉游動孢子懸浮液10 mL，2 d后在每株6葉期煙苗根際周圍分別施用菌株D5-8原始發(fā)酵菌液、D5-8優(yōu)化發(fā)酵菌液、陽性對照58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑500倍液和無菌水（CK）各10 mL。每個處理15株，3次重復(fù)。14 d后調(diào)查煙草植株發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，計算相對防治效果[3]。病害分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，全株無??；1級，莖部病斑不超過莖圍的 1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；9級，病株基本枯死。相關(guān)計算公式[12]：病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010、GraphPad、DPS處理數(shù)據(jù)及圖表的制作，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

自食腐昆蟲美洲大蠊腸道共分離得到200株形態(tài)不同菌株，以煙草寄生疫霉菌為指示菌，篩選得出6株具有拮抗作用的菌株，其中菌株D5-8的拮抗效果最好，對煙草寄生疫霉的抑菌圈半徑平均為10.00 mm，抑菌率為66.80%（圖1）。

圖1 拮抗菌株D5-8對煙草寄生疫霉的抑菌作用Fig. 1 Antibacterial effect of antagonistic strain D5-8 onP.nicotianaevar.nicotianae

2.2 菌株的形態(tài)特征及生理生化

菌落直徑1.55～2.39 mm，橢圓，乳白色，表面干燥且完整，有褶皺且中心褶皺拱起。菌體桿狀，產(chǎn)橢圓形芽胞（圖2）。從表1可以看出，菌株革蘭氏染色試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、檸檬酸試驗結(jié)果為陽性；油脂水解試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗等結(jié)果為陰性。根據(jù)形態(tài)觀察及生理生化結(jié)果，初步確定菌株D5-8為芽胞桿菌屬。

圖2 菌株D5-8菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig. 2 Colony morphology and gram staining of strain D5-8

2.3 16S rRNA鑒定

在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，菌株D5-8與特基拉芽胞桿菌的16S rRNA序列同源性高達(dá)99.97%；系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株D5-8與特基拉芽胞桿菌（NR 104919.1）處于同一分支，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化鑒定菌株D5-8為特基拉芽胞桿菌（圖3）。

表1 菌株D5-8生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain D5-8

圖3 菌株D5-8進(jìn)化樹Fig. 3 Evolutionary tree of strain D5-8

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 最適培養(yǎng)基的篩選 不同培養(yǎng)基對菌株 D5-8的 OD600值（F＝3.834，P＝0.0386）和抑制率（F＝86.720，P＝0.0001）均有顯著的影響（圖4），以NYBD為培養(yǎng)基時菌株的OD600值最大（2.15），對煙草寄生疫霉抑制率最高（66.67%）；其次為YSP、LB、NA；在CM培養(yǎng)基上菌株生長最慢（OD600＝1.57），對煙草寄生疫霉抑制率也最低（41.00%）。整體來看，菌株D5-8的最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NYBD培養(yǎng)基。

圖4 培養(yǎng)基對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 4 Effect of medium on the growth rate of strain D5-8

2.4.2 最適碳源篩選 以2.4.1中篩選的培養(yǎng)基NYBD為基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選碳源，如圖5所示，菌株D5-8在麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉上均能生長，且 OD600值（F＝4.202，P＝0.0299）和抑制率（F＝35.033，P＝0.0001）差異顯著，其中以麥芽糖為碳源時D5-8的OD600值最大（2.22），對煙草寄生疫霉抑制率也最高（62.67%）；以淀粉為碳源時菌株的 OD600值與對煙草寄生疫霉抑制率最低，分別為 0.99和41.00%。因此，選用麥芽糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源。

圖5 碳源對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 5 Effects of carbon source on the growth rate of strain D5-8

2.4.3 最適氮源篩選 以麥芽糖為碳源的NYBD基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選氮源，菌株D5-8在不同氮源中生長的OD600值（F＝10.321，P＝0.0014）和對煙草寄生疫霉的抑制率（F＝30.726，P＝0.0001）有顯著差異（圖6），酵母浸粉做氮源時，發(fā)酵液中的OD600值和抑制率均最大，分別為2.27和63.67%；當(dāng)以硝酸銨和甘氨酸為氮源時菌株的OD600值相當(dāng)，但硝酸銨的抑制率顯著高于甘氨酸。因此，選用酵母浸粉為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源。

圖6 氮源對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 6 Effect of nitrogen source on the growth rate of strain D5-8

2.4.4 最適pH的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選所得的最適培養(yǎng)基中，在不同pH下生長的OD600值（F＝8.257，P＝0.0006）和對煙草寄生疫霉的抑制率（F＝195.494，P＝0.0001）有顯著差異，菌株在 pH 5和pH 6時生長最好，OD600值均為2.65，但pH 6時抑制率最高為63.66%，在pH 4時菌株的生長受抑制，pH高于6時菌株的OD600值和抑制率則明顯降低，差異顯著（圖7）。綜合分析認(rèn)為，菌株D5-8最適pH為6。

圖7 pH對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 7 Effect of pH on the growth rate of strain D5-8

2.4.5 最適溫度的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選的最適培養(yǎng)條件中，不同溫度下的OD600值（F＝45.686，P＝0.0001）和抑制率（F＝24.528，P＝0.0001）有顯著差異，20 ℃菌株D5-8的OD600值和抑制率顯著低于24 ℃時；在24 ℃～40 ℃時OD600值沒有顯著差異，但菌株的抑制率差異顯著，28 ℃時對煙草寄生疫霉抑制率最高（61.67%）（圖8）。因此，菌株D5-8的最適溫度為28 ℃。

圖8 溫度對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 8 The influence of temperature on the growth rate of strain D5-8

2.4.6 最適轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選所得的最適培養(yǎng)條件中，不同轉(zhuǎn)速下的OD600值（F＝16.977，P＝0.0002）和對煙草寄生疫霉抑制率（F＝10.300，P＝0.0014）有顯著差異（圖9），在轉(zhuǎn)速120～180 r/min時，菌株的OD600值和抑制率隨轉(zhuǎn)速的升高不斷增加，180 r/min時菌株OD600值與抑制率最高分別為2.38和62.33%。因此，菌株D5-8的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖9 轉(zhuǎn)速對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 9 The influence ofrotating speed on the growth of the strain D5-8

2.4.7 最適光照時間的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選的最適培養(yǎng)條件中，不同光照時間下的OD600值（F＝16.272，P＝0.0001）和對煙草寄生疫霉抑制率（F＝14.570，P＝0.0001）差異顯著（圖10），當(dāng)光照時間為4 h時，菌株的OD600值最大（1.91），抑制率最高（58.67%）；光照時間為0時，OD600值最小（1.28），光照時間為20 h時，抑制率最低（47.33%）。因此，菌株D5-8的最適光照時間為4 h。

圖10 光照時間對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 10 The influence of lighting time on the growth of the strain D5-8

2.4.8 最適裝液量的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選的最適培養(yǎng)條件中，不同裝液量下的菌體量（F＝669.199，P＝0.0001）和對煙草寄生疫霉抑制率（F＝6.374，P＝0.0081）差異顯著（圖11），當(dāng)菌株的裝液量為30 mL時，菌株OD600值最大（2.70），菌株的抑制率最高（66.33%）；隨裝液量的不斷增加，菌株的OD600值和抑制率不斷下降。因此，菌株D5-8的最適裝液量為30 mL。

圖11 裝液量對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 11 The influence of liquid loading amoun on the growth of the strain D5-8

2.4.9 最適接菌量的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選所得的最適培養(yǎng)條件中，不同初始接種量下的菌體量（F＝0.666，P＝0.6299）和抑制率（F＝2.867，P＝0.0805）差異不明顯（圖12）；接種2%和接種8%的OD600值最高（2.40），接種2%的抑制率最高（61.67%）。因此，菌株D5-8的最適接種量為2%。

圖12 初始接菌量對菌株D5-8生長速度的影響Fig. 12 The influence of initial inoculation quantity on the growth of the strain D5-8

2.4.10 最適發(fā)酵時間的優(yōu)化 菌株D5-8在上述篩選的最適培養(yǎng)條件中，發(fā)酵10 h，菌株的OD600值及抑制率基本無變化，此時處于細(xì)菌的遲緩期；發(fā)酵10～48 h，菌株的OD600值與抑制率隨時間的增加而增加，此階段是菌株的對數(shù)生長期；48～72 h屬于細(xì)菌的平穩(wěn)期；在60 h 時，OD600值與抑制率達(dá)到最大值，分別為2.61和63%；72 h之后菌體量與抑制率隨時間的增加緩慢下降，此時細(xì)菌處于衰亡期（圖13）。因此，選擇60 h為最適發(fā)酵時間。

圖13 菌株D5-8的生長曲線圖Fig. 13 The growth curve of strain D5-8

2.4.11 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗 根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，各因素對D5-8菌體量都有影響，但影響較為顯著的因素有發(fā)酵時間（A）、培養(yǎng)溫度（B）和轉(zhuǎn)速（C）。采用L9(33)正交表，設(shè)計3因素3水平的正交試驗，進(jìn)一步確定影響菌株D5-8菌體最佳發(fā)酵條件組合（表2），由極差R值可知，3 種因素對D5-8菌株菌體量影響力的強弱順序為B（溫度）＞C（轉(zhuǎn)速）＞A（培養(yǎng)時間）。結(jié)合K值，最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B2C3，即溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速210 r/min、培養(yǎng)時間60 h。

表2 菌株D5-8培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment about fermentation conditions of D5-8

2.5 拮抗菌株對煙草黑脛病盆栽試驗防治效果

盆栽試驗結(jié)果表明，發(fā)酵條件優(yōu)化前、后的菌株D5-8發(fā)酵液對煙草黑脛病的保護(hù)防效分別為61.84%和66.89%，治療防效分別為51.83%和53.72%，對煙草黑脛病均能夠起到較好的防治效果，可以發(fā)現(xiàn)D5-8菌株優(yōu)化后發(fā)酵液的防效高于優(yōu)化前發(fā)酵液，但差異不顯著（表3）。

表3 菌株D5-8對煙草黑脛病的防治效果Table 3 Control effect of strain D5-8 on tobacco black shank

3 討論

細(xì)菌在自然界中種類多、數(shù)量大、生理特性豐富多樣，分布極其廣泛。現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬生防細(xì)菌對煙草寄生疫霉具有較好的防治效果[22]。生防類芽胞桿菌的主要作用機(jī)制為競爭、溶菌、誘導(dǎo)抗性、拮抗作用等[23-25]。同時對病原菌能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、抗菌蛋白、多肽類物質(zhì)、表面活性物質(zhì)等[26-28]。周瑚等[29]從水稻感病品種分離獲得特基拉芽胞桿菌JN-369，并發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質(zhì)（VOCs）、蛋白質(zhì)類粗提物、脂肽類粗提物對稻瘟病具有抑制作用。楊藝煒[30]研究發(fā)現(xiàn)，生防菌株XF10能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)纖維素酶和蛋白酶。在目前已有的研究中，具有生防作用的有益細(xì)菌多來源于植株與根際土壤，其他來源特別是從昆蟲腸道分離的相關(guān)報道較少[12]。本研究通過平板對峙法從美洲大蠊腸道分離篩選出一株對煙草疫霉具有較好抑菌作用的拮抗菌D5-8，通過形態(tài)觀察，生理生化特征及16S rRNA基因序列分析初步鑒定為特基拉芽胞桿菌。通過對比發(fā)現(xiàn)，本研究的 D5-8菌株所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能是抗菌蛋白、胞外酶等，具體的抑菌活性物質(zhì)種類、機(jī)理等需后續(xù)進(jìn)行深入的研究。

拮抗菌的生長繁殖和抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量不僅與菌株本身的特性息息相關(guān)，還和發(fā)酵條件（發(fā)酵培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件）密不可分[21]。本研究將D5-8的菌體量與抑菌率作為試驗指標(biāo)，結(jié)果表明菌株D5-8的最優(yōu)培養(yǎng)基為NYBD培養(yǎng)基，最優(yōu)的碳源10.0 g/L麥芽糖，氮源為5.0 g/L的酵母浸粉；采用單因素試驗及正交設(shè)計對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最優(yōu)的培養(yǎng)條件為溫度28 ℃、pH值為6、轉(zhuǎn)速210 r/min、裝液量30 mL、接種量2%、時間60 h、光照4 h。不同的拮抗菌株，最適的生長條件不同，將影響其菌體量及對病原菌的抑制效果[2]。將菌株 D5-8的最優(yōu)發(fā)酵條件與蘭明先等[31]從澤蘭實蠅幼蟲消化道分離得到的特基拉芽胞桿菌ZLSY5和孫露等[32]使用實驗室保存的特基拉芽胞桿菌WRN032的最優(yōu)發(fā)酵條件相比，三者在最佳裝液量的選擇上相似，均在30%～40%；pH均為6，呈弱酸性；菌株D5-8的最佳接菌量高于菌株ZLSY5的1%和菌株WRN032的2%；D5-8與ZLSY5的最適培養(yǎng)溫度均為28 ℃；三者的最佳培養(yǎng)時間也各不相同[31,32]。通過對比發(fā)現(xiàn)，3株菌均為特基拉芽胞桿菌，但其最佳發(fā)酵條件均不相同，可能菌株的來源與生存環(huán)境的差異，致使菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力及最適發(fā)酵條件和生理特性各不相同。

特基拉芽胞桿菌不僅能夠產(chǎn)生多種不同的抗菌物質(zhì)，抑制植物病原菌的生長，而且能夠促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[33]。本研究篩選的拮抗菌株特基拉芽胞桿菌D5-8對煙草寄生疫霉具有較好的抑菌活性，溫室盆栽試驗中菌株發(fā)酵液對煙草寄生疫霉的保護(hù)防效達(dá)60%以上，治療防效達(dá)50%以上。防治效果與程睿君[21]篩選的拮抗菌相當(dāng)。李輝[23]研究表明，特基拉芽胞桿菌對稻瘟病的預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。而且，不同來源的特基拉芽胞桿菌對其他作物病害也有較好的防治作用，但防治效果存在差異[29,34]。

綜上所述，本研究初步明確了 D5-8菌株的分類地位，篩選并優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件，證明了該菌株對煙草寄生疫霉具有較好的抑菌效果，為其菌劑開發(fā)及對煙草黑脛病的防治應(yīng)用提供了理論依據(jù)。在下一步的研究中，應(yīng)加強對該菌的抑菌物質(zhì)、生防機(jī)理以及對防治其他植物病害的篩選等方面的探究。