尤鈺嫻，解文嫣，班宵逢，孔昊存，李才明，李兆豐,

1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122

2. 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122

瓊膠是由海洋藻類生物合成的一種天然高分子多糖[1-2]。瓊膠經(jīng)過水解后生成聚合度為2～20的瓊膠寡糖，不僅溶解性好、生物利用度高，還具有改善水產(chǎn)品儲藏性能[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗炎癥[6]、降血糖[7-8]、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[9-10]以及美白保濕[11]等多項(xiàng)理化和生理功能，在功能性食品、化妝品、藥品等多個領(lǐng)域均具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和廣泛的應(yīng)用前景[12]。

近年我國對瓊膠的開發(fā)存在規(guī)模較小、附加值低、易污染環(huán)境等不足，開發(fā)功能性瓊膠寡糖等高附加值的瓊脂衍生物對高效利用海洋資源、增加經(jīng)濟(jì)效益、減輕化學(xué)污染等意義重大。目前工業(yè)上主要利用酸水解[13]和酶解[14]兩種方式制備瓊膠寡糖，其中利用瓊膠酶生物催化水解具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、底物特異性強(qiáng)等優(yōu)勢[15]。瓊膠酶根據(jù)水解模式和產(chǎn)物的不同可分為α-瓊膠酶 (EC 3.2.1.158) 和 β-瓊膠酶 (EC 3.2.1.81)[16]。α-瓊膠酶可特異性水解α-1,3-糖苷鍵，生成以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖，β-瓊膠酶可特異性水解β-1,4-糖苷鍵，生成以β-D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖。β-瓊膠酶因來源豐富、穩(wěn)定性好得以廣泛應(yīng)用，但仍存在菌株產(chǎn)酶性狀不穩(wěn)定、產(chǎn)酶量和催化活性低、產(chǎn)物專一性差等問題，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此，尋找水解活力更高、性狀穩(wěn)定的瓊膠酶基因，并在基因工程菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，成為生產(chǎn)瓊膠酶最經(jīng)濟(jì)、高效的方法。

目前，已有部分細(xì)菌來源的瓊膠酶實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌 (Escherichia coli)[17-18]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[19]、短芽孢桿菌 (B. pumilus)[20]、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)[21]和畢赤酵母 (Pichia pastoris)[22]中的表達(dá)，其中大腸桿菌因具有生長與表達(dá)速度快、易于基因組修飾、表達(dá)量高等優(yōu)勢得到最廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)有β-瓊膠酶在大腸桿菌中的表達(dá)量大多高于原始菌株，但絕大多數(shù)是胞內(nèi)分泌表達(dá)，不利于后續(xù)的分離、純化和應(yīng)用，且表達(dá)系統(tǒng)的選擇多具有隨機(jī)性，尚未見有結(jié)合生物信息學(xué)分析等手段指導(dǎo)進(jìn)行異源表達(dá)的報道。本研究利用生物數(shù)據(jù)庫資源挖掘技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段，獲得一個來源于海洋細(xì)菌——淡黃色噬瓊膠菌(Agarivorans gilvus) WH0801的 β-瓊膠酶 (β-AGA酶) 基因。通過分子生物學(xué)手段和發(fā)酵調(diào)控策略實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效胞外表達(dá)，以期為新瓊寡糖資源的高效制備與充分利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-20b(+) 保藏于本實(shí)驗(yàn)室；pUCm-T simple質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ和 XhoⅠ、Primer STAR GXL DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、堿性磷酸酶均購自TaKaRa (大連)公司；瓊脂糖、質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素等試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；分子級酵母粉和胰蛋白胨均購自O(shè)xoid (英國)公司；大豆蛋白胨、酵母提取物 H07014、酵母提取物 H07002均購自上海統(tǒng)園食品技術(shù)有限公司；蛋白胨(魚粉)、牛肉浸膏、酵母浸膏及其他常規(guī)培養(yǎng)基均購自國藥集團(tuán)；所用化學(xué)試劑均為分析純[23]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-瓊膠酶的生物信息學(xué)分析

分別以來源于嗜瓊膠菌Agarivorans sp. QM38(NCBI登錄號：ABM90422.1)[24]、弧菌Vibrio sp.PO-303 (NCBI登錄號：BAG71428.1)[25]和火色桿菌Flammeovirga sp. OC4 (NCBI登錄號：AJW82061.1)[26]的β-瓊膠酶氨基酸序列為探針，利用美國國家生物信息中心(NCBI) 的BLASTp功能 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，設(shè)置E值為1.0×10-10，長度覆蓋率90%以上且同一性大于30%，進(jìn)行同源性蛋白分子篩選[27]，利用MEGA軟件中的鄰接 (Neighbor-Joining) 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[28]。

利用在線生物信息學(xué)預(yù)測工具分別對β-瓊膠酶的基本理化性質(zhì)、分泌特性、結(jié)構(gòu)特征、功能潛力等進(jìn)行預(yù)測分析[29]，利用RobeTTAFold在線服務(wù)器 (https://robetta.bakerlab.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測。

1.2.2 β-AGA 酶基因的克隆

以淡黃色噬瓊膠菌WH0801基因組DNA為模板，根據(jù)其中的β-AGA酶序列分別設(shè)計(jì)含Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的兩端引物，通過PCR擴(kuò)增得到β-aga基因片段[23]。引物設(shè)計(jì)如下，正向 (P1)：5'GCGATGGCCATGGCCACATTTACTAAAAGCAA AATCGCAACCGTTCTT 3' (下劃線為Nco I酶切位點(diǎn)))；反向 (P2)：5'GGTGGTGCTCGAGTTTTT TGTAACGCAGATTATATAGATCACGGTTGAA 3'(下劃線為Xho I酶切位點(diǎn))。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照李兆豐[30]進(jìn)行。將得到的β-aga基因克隆到質(zhì)粒pUCm-T simple，獲得克隆載體pUCm-T simple/β-aga，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。提取含100 μg·mL-1氨芐青霉素平板篩選所得陽性菌株的質(zhì)粒進(jìn)行酶切電泳和測序驗(yàn)證，序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.3 表達(dá)載體 pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

采用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I對克隆載體pUCm-T simple/β-aga雙酶切，經(jīng)堿性磷酸酶消化后回收目的片段，再用T4 DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-20b(+)質(zhì)粒片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒并測序鑒定，獲得含正確序列的表達(dá)載體pET-20b(+)/β-aga，將其轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)，獲得基因工程菌E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/β-aga)。

1.2.4 重組 β-AGA 酶的生產(chǎn)

種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)參照李兆豐[30]的方法進(jìn)行，發(fā)酵結(jié)束后收集上清液即為重組β-AGA酶粗酶液。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

以體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量將種子培養(yǎng)液接至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同的發(fā)酵初始培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑添加量及添加時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH、碳源和氮源條件下進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵上清液中重組β-AGA酶活力，以確定最佳的發(fā)酵條件，每次優(yōu)化的結(jié)果用于之后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇3個影響最大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定發(fā)酵液中重組β-AGA酶活力，獲得發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。

1.2.7 β-AGA 酶水解活力的測定

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的瓊脂糖溶液為底物，β-AGA酶的水解活力參照Liu等[31]和Dong等[32]采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 β-瓊膠酶的生物信息學(xué)分析

2.1.1 β-瓊膠酶系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

來源于嗜瓊膠菌Agarivorans sp. QM38、弧菌Vibrio sp. PO-303和火色桿菌Flammeovirga sp.OC4的β-瓊膠酶已被報道具有優(yōu)良的環(huán)境適應(yīng)力和水解活力，因此以這3個氨基酸序列為探針，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp功能進(jìn)行搜索，保留同源性大于30%的序列，共得到1 039條序列。對篩選出的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖1)，可根據(jù)其菌屬來源分為11大類，考慮到可獲得性和潛在工業(yè)價值，最終選取其中與模板序列親緣關(guān)系較近的來源于淡黃色噬瓊膠菌的β-瓊膠酶(β-AGA酶，NCBI登錄號：AQT38174.1) 作為后續(xù)研究對象。

圖1 β-瓊膠酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of β-agarase

2.1.2 β-AGA 酶理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam預(yù)測了β-AGA酶的理化性質(zhì)。β-AGA酶的氨基酸數(shù)量為955個，氨基酸組成見表1，其中含量較多的是丙氨酸(82個，8.6%)、天冬氨酸(81個，8.5%)；其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有135個，帶正電荷的氨基酸殘基有84個；僅含有1個半胱氨酸，推測可能具有較少的二硫鍵結(jié)構(gòu)。β-AGA 酶的分子式為 C4 767H7 184N1 238O1 484S21，相對分子量為106.254 kD，理論等電點(diǎn)為 4.66，不穩(wěn)定指數(shù)為24.45，總親水性平均值為-0.428，表明β-AGA酶為酸性、穩(wěn)定的親水性蛋白。

表1 β-AGA酶的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of β-AGAase

2.1.3 β-AGA 酶二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA預(yù)測了β-AGA酶可能包含的二級結(jié)構(gòu) (圖2)，其中303個氨基酸參與構(gòu)成α-螺旋，30個氨基酸參與構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，170個氨基酸參與構(gòu)成延伸鏈，452個氨基酸參與構(gòu)成無規(guī)則卷曲。

圖2 β-AGA酶二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Secondary structure prediction of β-AGAase

2.1.4 β-AGA 酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用RobeTTAFold對β-AGA酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測，得到5個預(yù)測結(jié)構(gòu) (圖3)，置信度均為0.8(滿分為1)，比對各模型的誤差估算圖，其中模型2具有相對較小的誤差，可以作為基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)解析。

圖3 β-AGA酶三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Tertiary structure prediction of β-AGAase

2.1.5 β-AGA 酶親水性/疏水性分析

利用Prot Scale分析了β-AGA酶的親水性/疏水性 (圖4)。β-AGA酶蛋白的最低分值(-3.100)峰區(qū)位于第537位脯氨酸，代表其親水性最強(qiáng)；最高分值(2.422)峰區(qū)位于第16位苯丙氨酸，代表其疏水性最強(qiáng)。分析可得，β-AGA酶蛋白的親水區(qū)多于疏水區(qū)，總親水平均值為-0.400，是一種親水性蛋白。

圖4 β-AGA酶親水性/疏水性預(yù)測Fig. 4 Hydropathicity/hydrophobicity prediction of β-AGAase

2.1.6 β-AGA 酶亞細(xì)胞定位分析

利用PSORTb version 3.0分析了β-AGA酶的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示無法準(zhǔn)確預(yù)測其亞細(xì)胞定位。同時利用Loc Tree3分析其亞細(xì)胞定位 (圖5)，結(jié)果表明β-AGA酶有一定可能定位在細(xì)胞周質(zhì)中，亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)為36，精確度為89%。

圖5 β-AGA酶亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig. 5 Subcellular localization prediction of β-AGAase

2.1.7 β-AGA 酶信號肽分析

利用Signal P 5.0 Server分析了β-AGA酶的信號肽 (圖6)，可知β-AGA酶的S-mean和Y-max的平均值 (D) 小于臨界值，代表不具有信號肽序列，推測β-AGA酶為非分泌性蛋白。

圖6 β-AGA酶信號肽分析Fig. 6 Signal peptide prediction of β-AGAase

2.1.8 β-AGA 酶功能結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫 (CDD) 進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析 (圖7)。β-AGA酶在N端48—211、240—424位氨基酸處含有2個Agarase_CBM結(jié)構(gòu)域，該CBM樣域在結(jié)構(gòu)上與某些CBM家族非常相似，其中的一個Loop參與了催化位點(diǎn)通道頂部的形成，在β-瓊膠酶的外切水解模式中起到了識別底物的作用。這些結(jié)構(gòu)域與瓊脂糖鏈的非還原末端特異性結(jié)合，并將附加的催化模塊引導(dǎo)至受瓊膠酶水解的區(qū)域，幫助β-AGA酶捕捉底物，促進(jìn)參與1,4-β-D-半乳糖苷鍵水解的催化模塊活性。

圖7 β-AGA酶功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 7 Conserved domain prediction of β-AGAase

2.2 β-AGA酶大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

β-AGA酶在大腸桿菌中表達(dá)載體pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建見圖8。通過雙酶切法構(gòu)建獲得分泌型表達(dá)載體pET-20b(+)/β-aga。測序驗(yàn)證序列正確性后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21(DE3)，獲得 E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/β-aga)，實(shí)現(xiàn)了β-AGA酶在大腸桿菌中的胞外分泌表達(dá)。經(jīng)測定，發(fā)酵所得重組β-AGA酶的初始酶活為2.79 U·mL-1，比酶活為 121.30 U·mg-1。

圖8 表達(dá)載體pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建Fig. 8 Construction of expression plasmid pET-20b(+)/β-aga

2.3 重組β-AGA酶的發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1 種子生長曲線與種齡的確定

重組β-AGA酶的種子生長曲線見圖9-a，菌體在培養(yǎng)前3 h處于延滯期，3～10 h處于對數(shù)生長期，10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。選擇種齡4～9 h的β-AGA酶種子按體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量接種，以發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度25 ℃的條件進(jìn)行培養(yǎng)，離心后測定上清液中的胞外酶活力。對數(shù)中期 (≥5 h) 的種齡對重組β-AGA酶活力影響不顯著，綜合考慮時間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇種齡5 h的種子培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)酵 (圖9-b)。

圖9 重組β-AGA酶的種子生長曲線 (a) 和接種時間對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響 (b)Fig. 9 Seed growth curve of β-AGAase (a) and effect of inoculation time on fermentation (b) of recombinant β-AGAase

2.3.2 發(fā)酵初始培養(yǎng)基的選擇

發(fā)酵初始培養(yǎng)基對酶活的影響結(jié)果見圖10。TB培養(yǎng)基對重組β-AGA酶的胞外發(fā)酵生產(chǎn)效果最好，胞外酶活力最高，達(dá)到3.20 U·mL-1。分析其原因主要為TB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，更適合菌體生長，且酵母粉含量更高，能夠促進(jìn)重組酶釋放到大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)空間并形成高滲透壓便于胞外產(chǎn)酶；同時，TB培養(yǎng)基的pH緩沖能力較強(qiáng)，能夠有效維護(hù)重組菌的生長。

圖10 發(fā)酵培養(yǎng)基類型對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 10 Effect of culture medium on fermentation of recombinant β-AGAase

2.3.3 誘導(dǎo)劑對重組 β-AGA 酶生產(chǎn)的影響

誘導(dǎo)劑濃度和添加時間也會在一定程度上影響重組β-AGA酶的生產(chǎn)(圖11-a)。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度介于0.005～0.050 mmol·L-1時酶活較穩(wěn)定，IPTG濃度為0.025 mmol·L-1時酶活最高 (2.589 U·mL-1)。誘導(dǎo)劑添加時間對重組β-AGA酶生產(chǎn)的影響見圖11-b，添加誘導(dǎo)劑前培養(yǎng)時間超過0.5 h，酶活均較穩(wěn)定，培養(yǎng)時間為1 h時酶活最高 (3.96 U·mL-1)。

圖11 IPTG濃度和添加時間對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 11 Effects of IPTG concentration and additive time on fermentation of recombinant β-AGAase

2.3.4 發(fā)酵時間、溫度和 pH 的選擇

發(fā)酵時間對重組β-AGA酶生產(chǎn)的影響見圖12-a，發(fā)酵32～64 h其胞外酶活均較穩(wěn)定，發(fā)酵第48小時時酶活達(dá)到最高。

發(fā)酵溫度優(yōu)化結(jié)果見圖12-b，重組β-AGA酶活力在20～30 ℃處于較高水平，25 ℃下發(fā)酵48 h酶活最高，達(dá)到4.37 U·mL-1；超過30 ℃時酶活顯著下降。

發(fā)酵初始培養(yǎng)基的pH會影響微生物的代謝、發(fā)酵及分泌，在pH 7～8.5酶活保持穩(wěn)定 (圖12-c)，綜合考慮環(huán)境和經(jīng)濟(jì)因素，選擇7.0作為重組β-AGA酶發(fā)酵初始pH。

圖12 時間、溫度和pH對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 12 Effects of time, temperature and initial pH on fermentation of recombinant β-AGAase

2.3.5 碳源和氮源對重組 β-AGA 酶生產(chǎn)的影響

發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果表明，在9種常見的培養(yǎng)基中，TB培養(yǎng)基最有利于重組β-AGA酶的分泌。以此為基礎(chǔ)，對其碳源組成進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到降低成本、提高效率的目的。以去除TB培養(yǎng)基中的碳源為空白，選取并添加與該培養(yǎng)基碳含量相等的果糖、麥芽糖、蔗糖等9種不同的碳源，結(jié)果表明碳源的種類和添加量對重組β-AGA酶表達(dá)分泌存在較大影響 (圖13)。除了葡萄糖，其他碳源在重組β-AGA酶發(fā)酵中均能取得比甘油更好的效果，其中果糖作為碳源酶活達(dá)到最高 (6.28 U·mL-1)。進(jìn)一步優(yōu)化果糖的添加量，當(dāng)果糖添加量為6 g·L-1時，胞外產(chǎn)酶活力最高 (7.45 U·mL-1)。

圖13 碳源種類和添加量對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 13 Effect of carbon sources and their additive amount on fermentation of recombinant β-AGAase

氮源是微生物合成核酸、蛋白質(zhì)等的重要原料。氮源分為無機(jī)氮和有機(jī)氮，有機(jī)氮更適合大腸桿菌重組菌的發(fā)酵生產(chǎn)。以去除TB培養(yǎng)基中的氮源為空白，選取并添加與TB發(fā)酵培養(yǎng)基氮含量相等的不同種類的蛋白胨、酵母提取物，發(fā)現(xiàn)氮源的種類和添加量對重組β-AGA酶發(fā)酵產(chǎn)酶的影響存在明顯差異 (表2)。酵母提取物作為氮源時的表達(dá)量整體明顯優(yōu)于蛋白胨。其中，使β-AGA酶發(fā)酵量達(dá)到最高的氮源種類和濃度為添加量30 g·L-1的酵母提取物H07014，此時胞外產(chǎn)酶活力達(dá)到15.33 U·mL-1。

表2 有機(jī)氮源對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Table 2 Effect of organic nitrogen source on fermentation of recombinant β-AGAaseU·mL-1

2.3.6 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵溫度、碳源添加量、IPTG添加時間3個因素對重組菌株產(chǎn)酶影響最大，選擇這3個因素做三因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3，試驗(yàn)結(jié)果見表4。最佳組合為A2B2C3，即碳源添加量為6 g·L-1，發(fā)酵溫度為25 ℃，IPTG添加時間為2.0 h，在此條件下發(fā)酵48 h后所得粗酶液酶活為16.72 U·mL-1。

表3 正交試驗(yàn)因素和水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design layout and experimental results

3 討論

對瓊膠酶進(jìn)行異源表達(dá)可以突破天然酶的分泌限制，利用基因工程菌大幅提高其產(chǎn)量，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)良酶制劑的高效制備。目前國內(nèi)外對瓊膠酶在大腸桿菌中的克隆表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)空間，存在酶產(chǎn)量有限、制備工藝復(fù)雜、分離純化困難等瓶頸[33]，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。本研究通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)來源于淡黃色噬瓊膠菌的β-AGA酶氨基酸序列中不包含信號肽，因此引入pET-20b(+)質(zhì)粒中的信號肽進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，成功實(shí)現(xiàn)了重組β-AGA酶的胞外分泌表達(dá)。

發(fā)酵過程中菌體的生長狀態(tài)和產(chǎn)酶量可通過多種因素進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)控。菌體在生長的不同階段具備不同的生理特征，處于對數(shù)生長期的種子因其活性高、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)，更適合用于接種發(fā)酵。由于宿主菌E.coliBL21(DE3)中存在由lac I基因調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因激活機(jī)制[34]，因此在發(fā)酵過程中通常需要添加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IPTG濃度為0.025 mmol·L-1時重組β-AGA酶的水解活力最高，隨著誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)一步升高，酶活逐漸降低。這可能是由于IPTG具有一定的細(xì)胞毒性，濃度過高時會抑制菌體生長[35]，且經(jīng)高濃度IPTG誘導(dǎo)后重組β-AGA酶的前體蛋白合成速率會大大提高[30,36]，容易造成細(xì)胞質(zhì)中無活性包涵體的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致正常折疊的蛋白質(zhì)分泌量顯著降低。同時，誘導(dǎo)劑的添加時間也會對重組β-AGA酶的表達(dá)量和酶活造成影響，先培養(yǎng)一段時間再添加誘導(dǎo)劑，有利于使菌體增殖到適當(dāng)?shù)臐舛?，從而更好地抵御IPTG的毒性，最大限度地誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)酶。另外，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體在利用營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖的同時又將更多的代謝產(chǎn)物排出至培養(yǎng)基中，當(dāng)代謝產(chǎn)物積累到一定量時，會反向阻遏菌體的生產(chǎn)及產(chǎn)酶，因此需要對發(fā)酵時間進(jìn)行嚴(yán)格把控。發(fā)酵體系的pH也是影響微生物生長的一個重要因素，適中的pH有利于重組菌的生長、代謝和重組β-AGA酶在發(fā)酵期間活力的穩(wěn)定。除pH外，發(fā)酵溫度也是調(diào)控重組β-AGA酶胞外分泌表達(dá)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，重組β-AGA酶在25 ℃下發(fā)酵活性最高，可能是由于該溫度更接近野生型海洋來源β-AGA酶所處的環(huán)境溫度，此溫度下該酶本身穩(wěn)定性較高，且相對較低的溫度也更適合宿主大腸桿菌的生長繁殖和分泌產(chǎn)酶。相反，當(dāng)發(fā)酵溫度上升至37 ℃時，宿主菌和重組酶的穩(wěn)定性均有所下降，在拷貝過程中質(zhì)?？赡艽嬖谳^嚴(yán)重的丟失現(xiàn)象，因此胞外酶活顯著降低。當(dāng)誘導(dǎo)溫度太低(20 ℃)時，宿主菌的增殖速率和重組酶的轉(zhuǎn)運(yùn)速率均會降低，對重組β-AGA酶的胞外生產(chǎn)起到一定的限制作用。碳源和氮源的種類和濃度也是影響微生物生長代謝的重要因素，濃度過低時不足以提供充足的營養(yǎng)，過高則會反向抑制微生物的生長和代謝[37]，不同微生物對碳、氮源物質(zhì)的選擇偏好性存在明顯差異。

綜合上述各因素對重組β-AGA酶進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后的最終條件為：選取37 ℃下培養(yǎng)5 h的種子液用于發(fā)酵產(chǎn)酶，以TB作為發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基，設(shè)置初始pH為7.0，以6 g·L-1的果糖代替其中的碳源，以30 g·L-1的酵母提取液Ⅱ代替其中的氮源，于25 ℃培養(yǎng)2 h后加入終濃度為0.025 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)48 h，此條件下發(fā)酵所得酶活達(dá)到16.72 U·mL-1，約為初始酶活的6倍，在目前已報道的β-瓊膠酶中處于領(lǐng)先水平[38-40]。優(yōu)良的水解活力和分泌穩(wěn)定性使得重組β-AGA酶具有廣闊的應(yīng)用空間，有望成為定向水解瓊脂糖，高效生產(chǎn)特異性新瓊寡糖的新型酶解工具。

4 結(jié)論

本研究利用基因挖掘技術(shù)從海洋微生物基因庫中篩選得到一個具有優(yōu)良催化潛力的β-瓊膠酶基因，采用分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌系統(tǒng)中的異源表達(dá)，并通過發(fā)酵調(diào)控策略的優(yōu)化使其酶活提高了約5倍。該酶具有優(yōu)良的水解活力、穩(wěn)定的分泌水平和較高的產(chǎn)物特異性，應(yīng)用前景廣闊。研究結(jié)果可為開發(fā)新型瓊膠水解酶和高效制備不同聚合度的新瓊寡糖提供參考。