鄭 爽,李曉鵬,劉塑杰,杜廣營,田京偉

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院,煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,煙臺大學(xué)分子藥理和藥物評價教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺 264005)

吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO, EC 1.13.11.42)催化必需氨基酸色氨酸(Trp)降解途徑中的起始和限速步驟,表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞(APC)、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,與腫瘤免疫耐受密切相關(guān),可通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[1]。近年發(fā)現(xiàn),免疫調(diào)節(jié)功能并非IDO的唯一功能,其在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中亦發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究表明IDO可誘導(dǎo)腫瘤血管生成,發(fā)揮非免疫作用[2-5]。腫瘤與非惡性組織相比,其血管結(jié)構(gòu)和功能異常,可通過破壞灌注促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤缺氧和腫瘤內(nèi)pH值低,也會限制免疫細(xì)胞從循環(huán)進(jìn)入腫瘤發(fā)揮抗腫瘤活性[6-7]。

臨床前研究結(jié)果提示,IDO抑制劑單用的腫瘤殺傷活性較弱,抑制率在30%～50%[8]。腫瘤免疫治療的效果依賴于腫瘤微環(huán)境(TME)內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞的積累和活性,通過抑制腫瘤血管新生改善腫瘤血管功能和建立免疫支持的腫瘤微環(huán)境,可能提高腫瘤免疫治療的有效性并降低免疫相關(guān)不良反應(yīng)。鑒于IDO腫瘤新生血管之間的關(guān)系,推測IDO抑制劑與抗血管形成藥物聯(lián)用可協(xié)同抑制腫瘤血管新生和改善腫瘤免疫微環(huán)境,發(fā)揮更好的抗腫瘤作用。

索拉菲尼是一種口服多靶點(diǎn)激酶抑制劑,同時阻斷RAF/MEK/ERK途徑,可有效抑制腫瘤生長和血管生成,已獲FDA批準(zhǔn)用于治療肝細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌[9]。LPM3480226是山東綠葉制藥有限公司開發(fā)的小分子IDO抑制劑,結(jié)構(gòu)如圖1所示,目前正在中國開展臨床一期試驗(yàn),注冊登記號為CTR20182328。

本研究以小鼠腎癌Renca荷瘤小鼠為模型,考察IDO抑制劑LPM3480226聯(lián)合索拉菲尼的抗腫瘤作用,為IDO抑制劑的開發(fā)以及臨床研究方案提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

圖1 LPM3480226的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動物

小鼠腎癌細(xì)胞Renca.WT,由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供,培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基,含10% 胎牛血清、0.25% Trypsin,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。

BALB/c小鼠,雌性,試驗(yàn)開始時,6～7周,體重17.9～21.2 g。購自上海靈暢生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動物合格證編號:2020001828945。SPF級飼養(yǎng)環(huán)境,溫度20～25 ℃,濕度36%～50%,10～20次/h換氣,晝夜明暗交替時間12 h/12 h。所有實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方案與操作均經(jīng)過煙臺大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核及批準(zhǔn)。

1.2 供試品與主要試劑

LPM3480226,白色粉末,批號:H21383-029-P1,分子式為:C12H12BrFN6O3S,相對分子質(zhì)量419.23,15～25 ℃,遮光保存。溶液配制:稱取化合物1 344 mg,加入67.2 mL 30% solutol HS 15(37 ℃水浴融化),即得所需濃度溶液,分裝4.8 mL/瓶×14瓶,一周內(nèi)用完。

索拉菲尼(Sorafenib),白色至灰白色固體粉末,CAS:284461-73-0,上海瀚香生物科技有限公司生產(chǎn),分子式為C21H16ClF3N4O3,相對分子質(zhì)量464.82,4 ℃密封保存。溶液配制:稱取24 mg索拉菲尼,加入2 mL聚氧乙烯蓖麻油和2 mL的95%乙醇,渦旋超聲溶解得到4 mL濃度為6 mg/mL的儲存液。取1.2 mL儲存液加入3.6 mL注射用水渦旋混勻得到4.8 mL 1.5 mg/mL溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光存放。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Renca荷瘤小鼠制備

收集指數(shù)生長期的Renca細(xì)胞,PBS重懸至1×107個/mL于小鼠背部皮下接種,制備Renca荷瘤小鼠模型。待腫瘤平均體積達(dá)到約100 mm3時,據(jù)腫瘤體積隨機(jī)分組,腫瘤體積為0.5×長徑×短徑2,其中長徑和短徑分別指腫瘤的最長直徑和最短直徑。

2.2 劑量設(shè)計

前期藥效研究顯示,LPM3480226在200 mg/kg劑量下,每天灌胃給藥2次(BID),動物體內(nèi)腫瘤抑制率已達(dá)到最大藥效水平;索拉菲尼在 15 mg/kg劑量下,每天灌胃給藥1次(QD),可有效抑制Renca移植瘤的增殖,抑制率40%～60%。因此,在本研究中LPM3480226的劑量設(shè)為200 mg/kg,BID;索拉菲尼的劑量設(shè)為15 mg/kg,QD,均灌胃給藥。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

待腫瘤體積長至約100 mm3,根據(jù)腫瘤體積,將24只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組:對照組,LPM3480226組,索拉菲尼組,LPM3480226+索拉菲尼組,每組6只動物。對照組灌胃給予溶媒30% solutol HS 15,BID;LPM3480226組灌胃給予200 mg/kg的LPM3480226,BID;索拉菲尼組灌胃給予15 mg/kg的索拉菲尼,QD;LPM3480226+索拉菲尼組,灌胃給予200 mg/kg的LPM3480226,BID及15 mg/kg的索拉菲尼,QD。各組給藥體積均為10 μL/g。分組當(dāng)天開始給藥,定義為1 d,連續(xù)給藥19 d。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 動物體重及一般狀態(tài)觀察 試驗(yàn)期間,觀察腫瘤生長及藥物治療對動物的影響,包括但不限于動物死亡,動物體重,一般精神狀態(tài)及被毛,攝食和飲水情況。試驗(yàn)結(jié)束時,以試驗(yàn)分組時動物體重為基礎(chǔ),計算體重相對變化率。

2.4.2 腫瘤體積 試驗(yàn)期間,每周測量2次各組動物的腫瘤體積。瘤體積測量方法為:游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑和最小直徑,根據(jù)0.5×長徑×短徑2計算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線,動態(tài)觀察藥物的抗腫瘤效應(yīng)。

2.4.3 腫重 試驗(yàn)結(jié)束時(第19天),手術(shù)剝?nèi)恿鰤K,快速稱重后用于后續(xù)其他試驗(yàn)。根據(jù)瘤重,計算每組的平均瘤重。相對腫瘤抑制率TGI(%):TGI=1-T/C。T/C為相對腫瘤增值率,即在某一時間點(diǎn),治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對照組瘤重。依據(jù)瘤重計算LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)(CI)。計算公式為CI=Wcomb/(WLPM3480226×W索拉菲尼),Wcomb、WLPM3480226、W索拉菲尼分別為LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用組、LPM3480226組、索拉菲尼組的平均瘤重與對照組平均瘤重的比值。CI值<1表示有協(xié)同作用,CI值=1表示有相加作用,CI值>1表示有拮抗作用。

2.5 流式細(xì)胞技術(shù)分析腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞亞群

手術(shù)剝離各組動物的腫瘤組織,將腫瘤組織切取1/2用于制備腫瘤浸潤T細(xì)胞(TILs)。主要操作流程為:用無菌手術(shù)剪刀和鑷子將腫瘤解離成1～2 mm3小塊并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,每0.25 g腫瘤組織加10 mL消化液(DMEM培養(yǎng)基,0.5 mg/mL膠原酶A,0.2 mg/mL透明質(zhì)酸酶V,0.02 mg/mL DNA酶I),37 ℃,孵育45 min。消化液經(jīng)1500 r/min離心10 min,棄上清,培養(yǎng)基重懸后分別過濾網(wǎng),細(xì)胞懸液用DMEM漂洗重懸。采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離上述細(xì)胞懸液中的淋巴細(xì)胞即得TILs。獲得TILs后,隨即采用流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)檢測其中淋巴細(xì)胞亞群。利用PerCP-Cy5.5標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CD45篩選出淋巴細(xì)胞(CD45+),PE-cy7標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CD11b去除淋巴細(xì)胞中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(CD45+CD11b+)保留活化淋巴細(xì)胞(CD45+CD11b-),APC標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CD3分選出活化淋巴中T淋巴細(xì)胞(CD45+CD11b-CD3+),PE標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CD4和FITC標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CD8對T淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群進(jìn)行分析。Accuri TM C6 流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選(FACS)測定和分析。計算CD11b-CD3+CD4+和CD11b-CD3+CD8+細(xì)胞在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的絕對比例:CD11b-CD3+CD4+細(xì)胞絕對比例=(CD11b-)×(CD3+)×(CD4+),CD11b-CD3+CD8+細(xì)胞絕對比例=(CD11b-)×(CD3+)×(CD8+)。

2.6 免疫組織化學(xué)分析腫瘤組織CD34-MVD

CD34是一種跨膜糖蛋白,表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些干細(xì)胞及祖細(xì)胞等細(xì)胞,是目前腫瘤新生血管評價中特異性較好的標(biāo)記物,因此本研究選擇CD34陽性血管的微血管密度(CD34-MVD)作為腫瘤血管生成水平的替代指標(biāo)[10]。

取試驗(yàn)中剩余1/2部分腫瘤組織用于免疫組織化學(xué)分析。參考文獻(xiàn)[11],各組腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟并抗原修復(fù)后,滴加CD34(1∶2000)抗體,4 ℃過夜孵育,DAB免疫組化檢測試劑盒處理,蘇木素復(fù)染,脫水、封片。先于低倍鏡(×100)下全面觀察切片以確定腫瘤內(nèi)高血管密度位置,高血管密度區(qū)多位于腫瘤邊緣。再于高倍鏡(×400)下,以腫瘤中CD34陽性內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個血管,結(jié)構(gòu)不相連的分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管計數(shù)。記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù),取其平均數(shù)作為該切片CD34-MVD值。

2.7 統(tǒng)計分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 荷瘤小鼠動物體重和一般狀態(tài)

試驗(yàn)期間,各組動物均未出現(xiàn)死亡或?yàn)l死,動物一般精神狀態(tài)、被毛、攝食和飲水正常。體重統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示,與對照組相比較,LPM3480226組、索拉菲尼組及LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用組的動物平均體重在各時間點(diǎn)均無顯著改變(P>0.05),表明LPM3480226與索拉菲尼聯(lián)用沒有增加動物體重降低的毒性作用。

圖2 LPM3480226聯(lián)用索拉菲尼對Renca荷瘤小鼠體重的影響

3.2 腫瘤體積

腫瘤生長曲線如圖3所示,LPM3480226和索拉菲尼單用或聯(lián)用均可顯著抑制腫瘤生長。LPM3480226組在給藥后第13天開始平均腫瘤體積顯著小于對照組(P<0.05),索拉菲尼組和LPM3480226+索拉菲尼組均在給藥后第7天開始腫瘤體積顯著小于對照組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)后期(第13～19天)LPM3480226+索拉菲尼的平均腫瘤體積小于LPM3480226和索拉菲尼單用組(P<0.05)。上述結(jié)果顯示,LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用時對腫瘤生長的抑制作用優(yōu)于藥物單用。

與對照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;&P<0.05,與索拉菲尼組比較。

3.3 腫瘤重量及抑制率

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,各組腫瘤平均重量如圖4所示。LPM3480226組,索拉菲尼組,LPM3480226與索拉菲尼聯(lián)用組的平均腫瘤重量均顯著小于對照組(P<0.05),計算得腫瘤抑制率分別為32.56%,50.45%,71.92%。LPM3480226與索拉菲尼組平均腫瘤重量顯著小于LPM3480226組和索拉菲尼組(P<0.05),索拉菲尼組腫瘤重量顯著小于LPM3480226組(P<0.05)。根據(jù)腫瘤平均重量計算LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用的CI值為0.41,其小于1,且聯(lián)用組腫瘤重量顯著亦小于單用組,提示LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用具有一定協(xié)同效應(yīng)。

與對照組比較,#P<0.05,與LPM3480226組比較;&P<0.05,與索拉菲尼組比較。

3.4 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞亞群

利用流式細(xì)胞分析技術(shù)對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的亞群進(jìn)行分析,結(jié)果如圖5所示,LPM3480226的CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞百分比均顯著高于對照組(P<0.05);索拉菲尼組的CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞百分比均略高于對照組,但無統(tǒng)計學(xué)差異;LPM3480226+索拉菲尼組的CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞百分比均既顯著高于對照組(P<0.05),又顯著高于LPM3480226單用組(P<0.05)。上述結(jié)果提示,LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用可協(xié)同激活腫瘤免疫,提高CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞比例。

3.5 腫瘤組織CD34-MVD水平

利用免疫組化對腫瘤組織CD34-MVD水平進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6所示,LPM3480226組,索拉菲尼組于對照組(P<0.05),又顯著低于LPM3480226單用組(P<0.05)。上述結(jié)果提示,LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用可協(xié)同抑制腫瘤血管生成。

4 討論與結(jié)論

臨床前研究結(jié)果顯示,IDO抑制劑單用時的抗腫瘤作用較弱,且IDO與腫瘤血管新生密切相關(guān),因此,將IDO抑制劑與抗血管生成藥物聯(lián)合使用有可能提高臨床治療效果。本研究結(jié)果顯示,LPM3480226與索拉菲尼聯(lián)用未增加不良反應(yīng)(體重未降低),表明動物對于LPM3480226與索拉菲尼的聯(lián)合治療有良好的耐受性。藥效方面,LPM3480226與索拉菲尼聯(lián)用組的平均腫瘤重量顯著小于對照組,抑制率顯著提高,達(dá)到71.92%,而LPM3480226與索拉菲尼單用組的抑制率較低，分別為32.56%和50.45%,且根據(jù)腫瘤平均重量計算LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)小于1,且聯(lián)用組腫瘤重量顯著亦小于單用組,表明LPM3480226和索拉菲尼聯(lián)用具有一定協(xié)同效應(yīng)。

機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),LPM3480226聯(lián)合索拉菲尼可以顯著增加腫瘤內(nèi)CD3+CD4+和CD3+CD8+浸潤T淋巴細(xì)胞的比例,推測可能的機(jī)制為:索拉菲尼抑制血管生成,破壞了腫瘤內(nèi)血管組織結(jié)構(gòu),增加了T淋巴細(xì)胞的浸潤;同時索拉菲尼可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,釋放更多腫瘤抗原,可與LPM3480226協(xié)同激活T細(xì)胞應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)室另有研究表明,腫瘤細(xì)胞分泌的IDO可通過IL-6/STAT3/VEGF通路促進(jìn)腫瘤血管新生(文章待發(fā)),因此,LPM3480226除了可激活免疫T細(xì)胞外,還可在一定程度通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮作用,本研究結(jié)果也顯示聯(lián)用組腫瘤中CD34-MVD水平顯著降低,這可能是LPM3480226與索拉菲尼聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用的另一個機(jī)制。

綜上,本實(shí)驗(yàn)條件下,索拉菲尼與LPM3480226聯(lián)用在Renca小鼠模型中具協(xié)同抗腫瘤作用,與增加腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞比例和降低血管形成有關(guān)。基于IDO抑制劑的免疫治療與抗血管生成藥物聯(lián)用可能成為提高腫瘤臨床治療效果的重要策略之一。

與對照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;&P<0.05,與索拉菲尼組比較。

與對照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;&P<0.05,與索拉菲尼組比較。